المراقبة المجهرية متعددة الفوتون للأوعية في أنسجة كبد الفأر

Summary

في هذه التجربة، يتم حقن الماوس في الوريد الذيل مع رودامين B isothiocyanate-dextran التي يمكن أن وصمة عار الأوعية الدموية. بعد تعرض الكبد وإصلاحه ، يمكن اختيار جزء محدد من الكبد لمراقبة الأنسجة العميقة في الجسم الحي باستخدام المجهر متعدد الفوتون.

Abstract

مراقبة ديناميات داخل الأوعية الدموية من أنسجة الكبد الماوس يسمح لنا لإجراء مزيد من الملاحظات المتعمقة والدراسات على الأمراض المرتبطة بالأنسجة من كبد الفأر. يتم حقن الماوس بصبغة يمكن أن تلطخ الأوعية الدموية. لمراقبة كبد الماوس في الجسم الحي ، يتم كشفه وإصلاحه في إطار. يتم الحصول على صور ثنائية وثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية في أنسجة الكبد باستخدام مجهر متعدد الفوتون. يتم الحصول على صور الأنسجة في المواقع المختارة باستمرار لمراقبة التغيرات على المدى الطويل؛ ويلاحظ أيضا التغيرات الديناميكية للأوعية الدموية في أنسجة الكبد. المجهر متعدد الفوتون هو وسيلة لمراقبة وظيفة الخلية والخلية في أقسام الأنسجة العميقة أو الأعضاء. يتميز المجهر متعدد الفوتون بحساسية تجاه البنية المجهرية للأنسجة ويمكن من تصوير الأنسجة البيولوجية بدقة مكانية عالية في الجسم الحي ، مما يوفر القدرة على التقاط المعلومات الكيميائية الحيوية للمنظمة. يستخدم المجهر متعدد الفوتون لمراقبة جزء من الكبد ولكن تحديد الكبد لجعل الصورة أكثر استقرارا هو إشكالية. في هذه التجربة ، يتم استخدام كوب شفط فراغ خاص لإصلاح الكبد والحصول على صورة أكثر استقرارا للكبد تحت المجهر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبة التغيرات الديناميكية لمواد محددة في الكبد عن طريق وضع علامات على هذه المواد بالأصباغ.

Introduction

يمكن للأوعية الدموية توفير المواد الغذائية لمختلف أنسجة الأعضاء في جسم الإنسان، وتبادل المواد. وفي الوقت نفسه، تعمل العديد من السيتوكينات والهرمونات والأدوية والخلايا أيضا من خلال نقل الأوعية الدموية إلى مواقع محددة. يمكن أن تساعد مراقبة التغيرات الوعائية في أنسجة الكبد في فهم توزيع تدفق الدم في أنسجة الكبد ونقل المواد ، والمساعدة في تحليل بعض الأمراض المرتبطة بالأوعية الدموية^1،2.

هناك العديد من الطرق لمراقبة الأوعية الدموية للكبد في الفئران. من بينها ، المجهر البصري له العديد من القيود في مراقبة الأنسجة الوعائية المبهمة³. يمكن استخدام المجهر متعدد الفوتون لتصوير الأوعية الدموية للكبد الحية بدقة عالية غير باضعة^4. لا يمكن فقط الحصول على صور ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية ، ولكن يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للمساعدة في تنظيم الأنسجة لمراقبة الآثار البيولوجية فيها ؛ وعلاوة على ذلك، يمكن تصوير الأنسجة بأكملها بدلا من الميكروفسيل فقط كما هو الحال في التصوير المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي⁵.

يمكن استخدام المجهر متعدد الفوتونات للكشف الفعال عن إشارات الفلورسنت المتناثرة في الأنسجة الحية العميقة ، مع أقل سمية^{ضوئية 6}. لذلك ، يمكن ضمان نشاط الأنسجة الحية ، ويمكن تقليل كمية الضرر. Microscopy multiphoton لديه قوة اختراق أفضل من المجهر confocal ، مما يسمح لطبقات أعمق أن يلاحظ⁷، وتوفير التصوير 3D فريدة من نوعها. يستخدم الآن المجهر متعدد الفوتون في تصوير الأعصاب القحفية⁸ وتم توسيعه ليشمل دراسة ديناميات الخلايا العصبية في الفئران الحية^9و10و11.

في هذه التجربة ، بعد وضع علامات فلورية للأوعية الدموية الماوس ، يتم إصلاح الكبد في إطار ، ويمكن رؤية ديناميات الأوعية الدموية في أنسجة الكبد الحية باستخدام المجهر متعدد الفوتون. توضح هذه التجربة كيفية وضع علامة على مواد محددة ، واستخدام المجهر متعدد الفوتون للمساعدة في مراقبة موقع داخل الأنسجة ، ومراقبة الأحداث الخلوية في الأنسجة بين الخلايا ، وإجراء^{قياسات ضوئية 12،13،14}، ومراقبة الديناميكيات المادية داخل الأنسجة الحية¹⁵. على سبيل المثال، تم تحديد علامة بطانة الورم 1 (TEM1) كعلامة سطح جديدة أعلى تنظيما على الأوعية الدموية والستروما في العديد من الأورام الصلبة، ووضع علامة على جزء متغير من سلسلة واحدة (scFv) 78 ضد TEM1، ومن ثم يمكن استخدام المجهر متعدد الفوتون لموقع ورم وعائي الماوس وتقييم الأورام¹⁶.

Protocol

جميع العناية بالحيوانات والإجراءات كانت وفقا لسياسات مستشفى نانفانغ الصيني للرعاية الصحية والرفاهية (التطبيق رقم: NFYY-2019-73).

1. إعداد الماوس

1. تخدير الفأرة.
   1. إعداد بنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغم/كغ) في حقنة.
   2. الاستيلاء على الماوس (8 أسابيع من العمر C57BL الذكور / 6) مع اليد اليسرى بحيث بطنها تواجه ورأسها هو أقل من ذيله. تطهير الجلد البطن مع الكحول 75٪.
   3. عقد الحقنة في اليد اليمنى، واخترق خط البطن الأبيض مع الإبرة قليلا إلى الجانب الأيمن من الجلد من قبل 3-5 ملم. تأكد من أن إبرة الحقن والجلد بزاوية 45 درجة، وحقن البنتوباربيتال ببطء في تجويف البطن.  بعد الحلاقة، يطهر حول موقع شق الماوس 3 مرات بالتناوب مع 75٪ الكحول والحل الكلورهيكسيدين.
   4. تحقق مما إذا كان التخدير ناجحا بسبب عدم وجود رد فعل تصحيحي.
2. حقن رودامين B ايزوثيوسيانات-ديكتران في الوريد الكودالي.
   1. إعداد 100 ميكرولتر من 10 ملغم/مل رودامين B ايزوثيوسيانات-ديكتران في حقنة.
   2. امسح ذيل الفأر ب 75٪ كحول.
   3. أمسك الذيل باليد اليسرى، واحمل الحقنة في اليد اليمنى مع الإبرة الموازية للوريد، وحقن صبغة 100 ميكرولتر.
   4. وقف النزيف مع مسحة القطن بعد الحقن.
3. نقع فرو البطن الماوس مع شاش مبللة بالماء العقيم، وحلق بطن الماوس باستخدام شفرة حلاقة، مما يجعل السكتات الدماغية في اتجاه الفراء. بعد الحلاقة، يطهر حول موقع شق الماوس 3 مرات بالتناوب مع 75٪ الكحول والحل الكلورهيكسيدين.
4. بعد مسح وسادة التدفئة مع الكحول 75٪، وفتح وسادة التدفئة، ووضع الماوس على ظهره في لوحة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم في 37 درجة مئوية.

2. تحديد الكبد الماوس مع إطار تصوير الجهاز الجسم

ملاحظة: لم يتم إصدار إطار تصوير الأعضاء التجارية بعد.

1. ضع كوب شفط نظيف في وضع ثابت.
2. تثبيت لاعبا اساسيا التصوير الجهاز (الشكل التكميلي 1) ومسح وسادة التدفئة وكأس الشفط مع الكحول 75٪.
3. قم بتوصيل كوب الشفط (قطر 5 مم) بخرطوم مضخة الفراغ ثم قم بتشغيل مضخة الفراغ.
4. على طاولة معقمة معقمة مع الكحول 75٪، ويطهر حول موقع شق الماوس 3 مرات بالتناوب مع 75٪ الكحول ومحلول الكلورهيكسيدين، ثم يطهر حول موقع شق الماوس 3 مرات بالتناوب مع 75٪ الكحول ومحلول الكلورهيكسيدين، ثم استخدام مقص الجراحية لقطع 2 سم من الجلد قبالة الحدود السفلية القصية للفأر وفضح الكبد.
5. ضع الماوس مع لوحة التدفئة على قاعدة الحامل.
6. ضبط لاعبا اساسيا التصوير الجهاز بحيث كوب شفط يحمل الكبد. ثم استخدم الضغط السلبي من 30-35 كيلو باسكال للشفط بحيث يعلق الكبد على كوب الشفط(الشكل التكميلي 2).

3. ضبط المجهر متعدد الضوئي الليزر المسح الضوئي

1. قم بتشغيل المجهر متعدد الفوتون وحدد الهدف 60x/1.00 W.
2. إصلاح الإطار والفأرة تحت العدسة الهدف.
3. إضافة قطرة من المالحة العادية التي يمكن أن تغطي العدسة بأكملها، والتي هي مركز كوب الشفط، وضبط العدسة الهدف لمجرد لمس المالحة العادية.
4. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز الكمبيوتر لتشغيل برنامج الليزر وتشغيل المفتاح. ثم اضغط مع الاستمرار على زر الطاقة ومصراع الكاميرا لمدة 3 ق.
5. تعيين الطول الموجي إلى 800 نانومتر.
6. بدء تشغيل برنامج تشغيل المجهر باستخدام الكمبيوتر.
7. لإعداد الاستحواذ، قم بتعيين ليزر 800.

4. المراقبة باستخدام مجهر المسح بالليزر متعدد الفوتون

1. للتحكم في الحصول على الصورة، انقر فوق مفتاح الفلورسنت.
2. تأكد من أن أضواء الغرفة والمعدات مطفأة. لتقليل مستويات الضوضاء، استخدم المجهر في بيئة مظلمة.
3. افتح مصراع مسار الضوء على المجهر.
4. تدوير مرشح مضان إلى العتاد الرابع وسحب اثنين من العتلات من التبديل البصري.
5. يبحث من خلال العدسة، واستخدام شبه القرصنة الخشنة وغرامة التركيز لضبط البعد البؤري، واستخدام محاور X/Y لضبط مجال الرؤية للعثور على المنطقة المستهدفة.

5. التصوير المجهري متعدد الفوتون بالليزر

1. إيقاف تشغيل مفتاح الفلورسنت على البرنامج، والتبديل مرشح الفلورسنت إلى العتاد الثاني (والعتاد الثاني هو RXD1)، ودفع اثنين من العتلات من التبديل البصري.
2. انقر على التركيز ×2 لمعاينة المنطقة المستهدفة وضبط الإعداد الاستحواذ والمعلمات التحكم في اقتناء الصور (دقة الصورة: 1024).
3. اضغط على Control + C وضبط الجهد العالي والكسب والإزاحة (لتقليل مستويات الضوضاء).
4. انقر فوق إيقاف لإيقاف المعاينة، وانقر فوق الزر XY لمسح بعدين، وحفظ بعد الانتهاء (الشكل 1).
5. حدد منطقة، وانقر على العمق،ثم معاينة لتحديد مجموعة النهاية وبدء مجموعة (انظر الجزء المطلوب الكامل من الأوعية الدموية) في إعداد المجهر. مسح الصور ثلاثية الأبعاد وحفظها بعد الانتهاء (الشكل 2).
6. حدد منطقة، وانقر على الوقت،وضبط إعدادات الاستحواذ الأخرى والمعلمات التحكم في اقتناء الصور (حجم الخطوة: 1 ميكرومتر؛ 1 ميكرومتر؛ شرائح: 10; رقم المسح الضوئي للوقت: 40). مسح شرائح مختلفة وحفظ بعد الانتهاء من الحصول على الصور المتحركة (فيديو 1).
   ملاحظة: يجب أن يهتم شخص ما بالفئران أثناء الفحص وإضافة التخدير وفقا لذلك.
7. التضحية الماوس عن طريق تشريح الرقبة.

النتائج

ويمكن رؤية توزيع الأوعية الدموية في الكبد في الشكل 1, الحصول عليها باستخدام المجهر متعددةفوتون. وينقسم الأوعية الدموية إلى عدد وافر من الفروع المنبثقة من جذع وتوزيعها على المساحة المحيطة بها. المحيط الخارجي للأوعية الدموية أحمر ، والتجويف الداخلي مظلم ، وهناك العديد من ال...

Discussion

مراقبة نسيج حي معين هو وسيلة فعالة لفهم التغيرات والتوطين والآثار البيولوجية للمواد داخل الأنسجة^17. في هذه التجربة ، والخطوات الهامة هي تحديد الكبد مع لاعبا اساسيا تصوير الجهاز ، والتي يمكن أن تحل مشكلة القطع الأثرية الحركة بسبب التنفس وضربات القلب ، واستخدام المجهر متعددةفو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe x 2	Hunan Pinan Medical Devices Technology	YA0551
5 W heating pad	BiolinkOptics Technology	BL336
75% absolute ethanol	Guangdong Guanghua Sci-Tech	1.17113.023
Absorbent cotton ball	Healthy Sanitation Kingdom
Mouse surgical instrument	RWD Life Science	SP0001-G	Including scissors and tweezers
Multiphoton microscopy	Olympus	FV1200MPE
Organ imaging fixture	BiolinkOptics Technology	BL336	Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran	Sigma	R9379
Shaving machine	Lei Wa	RE-3201
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761-25G