마우스 간 조직에서 혈관의 다광 현미경 관찰

요약

이 실험에서 마우스는 혈관을 얼룩지게 할 수있는 로다민 B 이소티오카네이트 -dextran과 꼬리 정맥에 주입됩니다. 간이 노출되고 고정된 후에, 간의 특정 부분은 다광 현미경 검사를 사용하여 살아있는 바디에 있는 깊은 조직을 관찰하기 위하여 선택될 수 있습니다.

초록

마우스 간 조직의 내트라바산 역학을 관찰하면 마우스 간의 조직 관련 질병에 대한 심층관찰 및 연구를 더욱 심층적인 관찰할 수 있습니다. 마우스는 혈관을 얼룩지게 할 수 있는 염료를 주입합니다. 생체 내에서 마우스 간을 관찰하기 위해, 그것은 노출되어 프레임에 고정된다. 간 조직에서 혈관의 2 차원 및 3 차원 이미지는 다광 현미경을 사용하여 수득된다. 선택한 사이트의 조직의 이미지는 장기적인 변화를 관찰하기 위해 지속적으로 획득됩니다. 간 조직에 있는 혈관의 동적 변경은 또한 관찰됩니다. 다광현미경검사는 깊은 조직 단면 또는 기관에서 세포 및 세포 기능을 관찰하는 방법입니다. 다광 현미경 검사는 조직 미세 구조에 감도를 가지며 생체 내에서 높은 공간 해상도에서 생물학적 조직의 이미징을 가능하게하여 조직의 생화학 적 정보를 캡처 할 수있는 기능을 제공합니다. 다광현미경검사는 간 일부를 관찰하는 데 사용되지만 간을 고정하여 이미지를 보다 안정적으로 만드는 것은 문제가 된다. 이 실험에서, 특수 진공 흡입 컵은 간을 고치고 현미경의 밑에 간보다 안정적인 심상을 얻기 위하여 이용됩니다. 또한, 이 방법은 염료로 이러한 물질을 표시하여 간에서 특정 물질의 동적 변화를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

혈관은 인체의 다양한 장기 조직에 영양분을 제공하고 물질을 교환 할 수 있습니다. 동시에, 많은 사이토카인, 호르몬, 약물 및 세포는 또한 특정 위치로 혈관 수송을 통해 기능. 간 조직의 혈관 변화를 관찰하면 간 조직에서혈량의 분포와 물질의 운반을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 특정 혈관 관련 질환의 분석을^{돕는다 1,2.}

마우스에서 간 혈관을 관찰 하는 많은 방법이 있다. 그 중에서도 광학 현미경 검사법은 불투명혈관 조직^3을관찰하는 데 많은 한계를 가지고 있다. 다광 현미경 검사는 비침습적 고해상도^4를가진 살아있는 간의 혈관을 이미지하기 위하여 이용될 수 있습니다. 뿐만 아니라 혈관의 3 차원 이미지를 얻을 수 있습니다., 하지만 기술은 또한 그 안에 생물학적 효과를 관찰 하는 조직을 구성 하는 데 도움이 사용할 수 있습니다.; 더욱이, 전체 조직은 계산된 단층 촬영 및 자기 공명 화상 진찰^5에서와같이 마이크로혈관만이 아니라 심영상될 수 있다.

다광 현미경 검사는 광독성^6이적은 깊은 살아있는 조직에서 산란된 형광 신호를 효과적으로 검출하는 데 사용될 수 있다. 따라서 살아있는 조직의 활성을 보장할 수 있으며 손상의 양을 줄일 수 있습니다. 다광 현미경 검사는 공초점 현미경 검사법보다 더 나은 관통 전력을 가지고 있으며, 더 깊은 층을 관찰 할 수 있게^7,독특한 3D 이미징을 제공합니다. 다광현미경검사는 이제 종종 이미징 두개골 신경^8에 사용되며 살아있는 마우스^{9,10,11에서}신경 역학의 연구로 확장되었다.

이 실험에서는 마우스 혈관의 형광 라벨링 후, 간은 프레임에 고정되고, 살아있는 간 조직에서 혈관의 역학은 다광산 현미경을 사용하여 볼 수 있다. 본 실험은 특정 물질을 표시하고, 다광현미경을 사용하여 조직 내의 위치를 관찰하고, 세포간 조직에서 세포 간 사건을 관찰하고, 광화학 적^{측정(12,13,14)을}하고, 살아있는^조직(15)내부의 물질 역학을 관찰하는 방법을 보여 준다. 예를 들어, 종양 내피 마커 1(TEM1)은 많은 고형 종양에서 혈관 및 기질상에 상응한 새로운 표면 마커로 확인되었으며, TEM1에 대한 단일 연쇄 가변 단편(scFv) 78을 표시한 다음, 다중광 현미경 검사법은 마우스 혈관진종 위치 및 종양^16의평가에 사용될 수 있다.

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프로토콜

모든 동물 관리 및 절차는 히스와 웰빙에 대한 중국 난팡 병원 정책에 따라했다 (응용 프로그램 번호: NFYY-2019-73).

1. 마우스 준비

1. 마우스를 마취합니다.
   1. 주사기에 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg)을 준비합니다.
   2. 마우스(8주된 남성 C57BL/6)를 왼손으로 잡아 배가 위를 향하고 머리가 꼬리보다 낮을 수 있도록 하십시오. 75%의 알코올로 복부 피부를 소독하십시오.
   3. 오른손에 주사기를 잡고, 3-5mm피부의 오른쪽에 바늘로 복부 흰색 선을 관통한다. 주사기 바늘과 피부가 45° 각도에 있는지 확인하고 펜토바르비탈을 복강에 천천히 주입하십시오.  면도 후 마우스 절개 부위 주변을 3번 번 소독하여 75%의 알코올과 클로르헤시딘 용액을 번갈아 사용합니다.
   4. 마취가 올바른 반사의 부족에 의해 성공적이었는지 확인하십시오.
2. 로다민 B 이소토오카네이트-dextran을 카우달 정맥에 넣습니다.
   1. 10 mg/mL 로다민 B 이소토오카네이트-디엑스트라넨의 100 μL을 주사기에 준비한다.
   2. 마우스의 꼬리를 75%의 알코올로 닦으부습니다.
   3. 왼손으로 꼬리를 잡고, 정맥과 평행하게 바늘로 오른손에 주사기를 잡고, 100 μL 염료를 주입한다.
   4. 주입 후 면봉으로 출혈을 멈춥시다.
3. 살균수로 젖은 거즈로 마우스의 복부 털을 담그고 면도기로 마우스의 복부를 면도하여 모피 방향으로 스트로크합니다. 면도 후 마우스 절개 부위 주변을 3번 번 소독하여 75%의 알코올과 클로르헤시딘 용액을 번갈아 사용합니다.
4. 75%의 알코올로 가열 패드를 닦은 후, 가열 패드를 열고, 37 °C에서 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 뒷면에 마우스를 배치합니다.

2. 신체 장기 이미징 프레임으로 마우스 간 고정

참고: 상업적인 기관 화상 진찰 프레임은 아직 풀어 놓이지 않았습니다.

1. 깨끗한 흡입 컵을 고정 된 위치에 놓습니다.
2. 장기 이미징기구(보조 도 1)를설치하고 가열 패드와 흡입 컵을 75% 알코올로 닦아냅니다.
3. 진공 펌프 호스에 진공 패드 (직경 5mm)를 연결하고 진공 펌프를 켭니다.
4. 75%의 알코올로 살균된 멸균 테이블에서 마우스 절개 부위 주변을 75%의 알코올과 클로레시딘 용액으로 3번 번 소독한 다음 마우스 절개 부위 주변을 75%의 알코올및 클로레시딘 용액으로 3배 번 소독한 다음 수술용 가위를 사용하여 간암의 2cm를 잘라냅니다.
5. 마우스를 홀더 베이스에 가열 패드와 함께 놓습니다.
6. 흡입 컵이 간을 보유할 수 있도록 장기 이미징 기구를 조정합니다. 그런 다음 흡입에 30-35 kPa의 음압을 사용하여 간이 흡입 컵(보충 도 2)에부착되도록합니다.

3. 다광레이저 스캐닝 현미경 조정

1. 다광현미경을 켜고 60x/1.00 W 목표를 선택합니다.
2. 목표 렌즈 아래에 프레임과 마우스를 고정합니다.
3. 흡입 컵의 중심인 렌즈 전체를 덮을 수 있는 일반 식염수를 추가하고, 일반 식염수를 터치하기 위해 목표 렌즈를 조정합니다.
4. 컴퓨터 아이콘을 두 번 클릭하여 레이저 소프트웨어를 켜고 스위치를 켭니다. 그런 다음 전원 버튼과 셔터를 3s로 누르고 누릅니다.
5. 파장을 800 nm로 설정합니다.
6. 컴퓨터를 사용하여 현미경 작동 소프트웨어를 시작합니다.
7. 획득 설정의경우 레이저 800을설정합니다.

4. 다광레이저 스캐닝 현미경을 이용한 관찰

1. 이미지 수집 제어를위해 형광 스위치를 클릭합니다.
2. 방과 장비 조명이 꺼져 있는지 확인합니다. 소음 수준을 줄이려면 어두운 환경에서 현미경을 사용하십시오.
3. 현미경의 라이트 패스 셔터를 엽니다.
4. 형광 필터를 네 번째 기어로 회전시키고 광학 스위치의 두 레버를 당깁니다.
5. 접안렌즈를 살펴보면, 거칠고 미세한 초점 준나선형을 사용하여 초점 거리를 조정하고 X/Y 축을 사용하여 시야를 조정하여 대상 영역을 찾습니다.

5. 다광 레이저 스캐닝 현미경

1. 소프트웨어의 형광 스위치를 끄고 형광 필터를 두 번째 기어(두 번째 기어는 RXD1)로 전환하고 광학 스위치의 두 레버를 밀어 넣습니다.
2. 포커스 ×2를 클릭하여 대상 영역을 미리 보고 획득 설정 및 이미지 수집 제어 매개 변수(이미지 해상도: 1024)를 조정합니다.
3. 제어 + C를 누르고 고전압, 게인 및 오프셋을 조정합니다(소음 수준을 줄이기 위해).
4. 미리보기를 중지하려면 중지를 클릭하고 XY 버튼을 클릭하여 두 차원으로 스캔하고 완료 후 저장합니다(그림1).
5. 지역을 선택하고 깊이를클릭한 다음 미리 보기를 클릭하여 최종 세트를 선택하고 현미경 설정에서 집합을 시작합니다(혈관의 전체 필수 부분 참조). 3D 이미지를 스캔하고 완료 후 저장(그림 2).
6. 지역을 선택하고 시간을클릭하고 다른 획득 설정 및 이미지 수집 제어 매개 변수를 조정합니다(단계 크기: 1 μm; 슬라이스: 10; 시간 스캔 번호: 40). 다른 슬라이스를 스캔하고 완료 후 저장하여 움직이는 이미지를 얻습니다(비디오 1).
   참고 : 누군가가 스캔 중에 마우스를 돌보고 그에 따라 마취를 추가해야합니다.
7. 목 해부로 마우스를 희생합니다.

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결과

간에서 혈관의 분포는 다광현미경검사를 사용하여 수득된 도 1에서볼 수 있다. 혈관은 트렁크에서 방출되는 복수의 가지로 나누어 주변 공간으로 분배된다. 혈관의 외주는 빨간색이며 내부 구멍은 어둡고 내부에는 많은 것들이 있습니다. 이미지가 명확해질수록 관측 평면에 가깝습니다. 염료가 주변 조직을 침투하여 다른 물질을 얼룩지게 하기 때문에 붉은 반점도 있습니?...

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토론

특정 살아있는 조직을 관찰하는 것은 조직 내부의 물질의 변화, 국소화 및 생물학적 효과를 이해하는 효과적인^{수단이다(17)} 이 실험에서 중요한 단계는 호흡과 심장 박동으로 인한 운동 유물의 문제를 해결할 수있는 장기 이미징 기구로 간을 고정하고 관찰을위한 다광자 현미경을 사용하는 것입니다. 이 방법을 이용하여, 생체 내 간의 내부 조직은 다광 현미경을 통해 관찰되고, ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe x 2	Hunan Pinan Medical Devices Technology	YA0551
5 W heating pad	BiolinkOptics Technology	BL336
75% absolute ethanol	Guangdong Guanghua Sci-Tech	1.17113.023
Absorbent cotton ball	Healthy Sanitation Kingdom
Mouse surgical instrument	RWD Life Science	SP0001-G	Including scissors and tweezers
Multiphoton microscopy	Olympus	FV1200MPE
Organ imaging fixture	BiolinkOptics Technology	BL336	Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran	Sigma	R9379
Shaving machine	Lei Wa	RE-3201
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761-25G