Observação microscópica multifotípica de vasos em tecido hepático de rato

Resumo

Neste experimento, um rato é injetado em sua veia traseira com isotocianato Rhodamine B-dextran que pode manchar vasos sanguíneos. Depois que o fígado é exposto e fixo, uma parte específica do fígado pode ser selecionada para observar o tecido profundo no corpo vivo usando microscopia multifotícula.

Resumo

Observar a dinâmica intravascular do tecido hepático do camundongo nos permite realizar observações e estudos mais aprofundados sobre doenças relacionadas ao tecido do fígado de camundongos. Um rato é injetado com um corante que pode manchar vasos sanguíneos. Para observar o fígado do rato in vivo, ele é exposto e fixado em uma moldura. Imagens bidimensionais dos vasos sanguíneos no tecido hepático são obtidas usando um microscópio multifotono. As imagens dos tecidos nos locais selecionados são adquiridas continuamente para observar alterações a longo prazo; as mudanças dinâmicas dos vasos sanguíneos nos tecidos hepáticos também são observadas. Microscopia multifotítica é um método para observar a função celular e celular em seções de tecido profundo ou órgãos. A microscopia multifotônica tem sensibilidade à microestrutura tecidual e permite a imagem de tecidos biológicos em alta resolução espacial in vivo, proporcionando a capacidade de capturar as informações bioquímicas da organização. A microscopia multifotônio é usada para observar parte do fígado, mas fixar o fígado para tornar a imagem mais estável é problemático. Neste experimento, uma ventosa especial é usada para consertar o fígado e obter uma imagem mais estável do fígado sob o microscópio. Além disso, este método pode ser usado para observar alterações dinâmicas de substâncias específicas no fígado, marcando tais substâncias com corantes.

Introdução

Os vasos sanguíneos podem fornecer nutrientes para vários tecidos de órgãos do corpo humano, e trocar substâncias. Ao mesmo tempo, muitas citocinas, hormônios, drogas e células também funcionam através do transporte vascular para locais específicos. Observar alterações vasculares no tecido hepático pode ajudar na compreensão do fluxo sanguíneo no tecido hepático e no transporte de substâncias, e auxiliar na análise de certas doenças vasculares^1,2.

Há muitas maneiras de observar os vasos sanguíneos do fígado em camundongos. Entre elas, a microscopia óptica tem muitas limitações na observação do tecido vascular opaco³. A microscopia multifotúna pode ser usada para imaginar os vasos sanguíneos de fígados vivos com alta resolução não invasiva⁴. Não só podem ser obtidas imagens tridimensionais dos vasos sanguíneos, mas a técnica também pode ser usada para ajudar a organizar o tecido para observar efeitos biológicos; além disso, todo o tecido pode ser imageado em vez de apenas os microvexis como na tomografia computadorizada e ressonância magnética⁵.

A microscopia multifotônio pode ser usada para detectar efetivamente sinais fluorescentes dispersos em tecido vivo profundo, com menos fototoxicidade⁶. Portanto, a atividade do tecido vivo pode ser garantida, e a quantidade de dano pode ser reduzida. A microscopia multifotônio tem melhor poder penetrante do que a microscopia confocal, permitindo que camadas mais profundas sejam observadas⁷, fornecendo imagens 3D únicas. A microscopia multifotônio é agora frequentemente usada na imagem dos nervos cranianos⁸ e foi estendida ao estudo da dinâmica neuronal em camundongos vivos^9,10,11.

Neste experimento, após a rotulagem fluorescente dos vasos sanguíneos do rato, o fígado é fixado em uma estrutura, e a dinâmica dos vasos sanguíneos no tecido hepático vivo pode ser vista usando microscopia multifotítica. Este experimento demonstra como marcar substâncias específicas, usar microscopia multifotônica para ajudar a observar um local dentro do tecido, observar eventos celulares no tecido intercelular, fazer medições fotoquímicas^12,13,14, e observar a dinâmica material dentro do tecido vivo¹⁵. Por exemplo, o marcador endotelial tumoral 1 (TEM1) foi identificado como um novo marcador de superfície regulado nos vasos sanguíneos e estroma em muitos tumores sólidos, marcando fragmento variável de cadeia única (scFv) 78 contra TEM1, e então microscopia multifotona pode ser usada para localização de hemangioma de camundongos e avaliação de tumores¹⁶.

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Protocolo

Todos os cuidados e procedimentos de animais estavam de acordo com as políticas do Hospital China Nanfang para saúde e bem-estar (aplicação NFYY-2019-73).

1. Preparação do rato

1. Anestesiar o rato.
   1. Prepare pentobarbital de sódio (50 mg/kg) em uma seringa.
   2. Pegue o mouse (C57BL/6 masculino de 8 semanas de idade) com a mão esquerda para que sua barriga esteja virada para cima e sua cabeça fique mais baixa que sua cauda. Desinfete a pele abdominal com 75% de álcool.
   3. Segurando a seringa na mão direita, fure a linha branca do abdômen com a agulha ligeiramente para o lado direito da pele por 3-5 mm. Certifique-se de que a agulha da seringa e a pele estão em um ângulo de 45°, injete o pentobarbital lentamente na cavidade abdominal.  Após a barba, desinfeta ao redor do local de incisão do rato 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina.
   4. Verifique se a anestesia foi bem sucedida pela falta de um reflexo de direito.
2. Injete isothiocyanato-dextran de Rhodamine B na veia caudal.
   1. Prepare 100 μL de 10 mg/mL Rhodamine B isothiocyanato-dextran em uma seringa.
   2. Limpe a cauda do rato com 75% de álcool.
   3. Segure a cauda com a mão esquerda, segure a seringa na mão direita com a agulha paralela à veia e injete o corante de 100 μL.
   4. Pare o sangramento com um cotonete depois da injeção.
3. Mergulhe a pele abdominal do rato com gaze molhada com água estéril, e raspe o abdômen do rato usando uma navalha, fazendo traços na direção da pele. Após a barba, desinfeta ao redor do local de incisão do rato 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina.
4. Depois de limpar uma almofada de aquecimento com 75% de álcool, abra a almofada de aquecimento e coloque o mouse de costas na almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C.

2. Fixação do fígado do rato com a estrutura de imagem do órgão corporal

NOTA: O quadro de imagem do órgão comercial ainda não foi divulgado.

1. Coloque uma ventosa limpa em uma posição fixa.
2. Instale uma luminária de imagem de órgão(Figura Suplementar 1) e limpe a almofada de aquecimento e a ventosa com 75% de álcool.
3. Conecte a ventosa (5 mm de diâmetro) à mangueira da bomba de vácuo e ligue a bomba de vácuo.
4. Em uma mesa estéril esterilizada com 75% de álcool, desinfeta ao redor do local de incisão do camundongo 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina, em seguida, desinfeta ao redor do local de incisão do rato 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina, em seguida, usar tesoura cirúrgica para cortar 2 cm de pele da borda severa inferior do rato e expor o fígado.
5. Coloque o mouse junto com a almofada de aquecimento na base do suporte.
6. Ajuste a luminária de imagem do órgão para que a ventosa segure o fígado. Em seguida, use uma pressão negativa de 30-35 kPa para sucção para que o fígado se anexe ao copo de sucção(Figura Suplementar 2).

3. Ajustando o microscópio de varredura a laser multifotônio

1. Ligue o microscópio multifotono e selecione o objetivo de 60x/1.00 W.
2. Fixar o quadro e o mouse sob a lente objetiva.
3. Adicione uma gota de soro fisiológico normal que pode cobrir toda a lente, que é o centro da ventosa, e ajustar a lente objetiva para apenas tocar o soro fisiológico normal.
4. Clique duas vezes no ícone do computador para ativar o software laser e ativar o interruptor. Em seguida, pressione e segure o botão de alimentação e o obturador por 3 s.
5. Defina o comprimento de onda para 800 nm.
6. Inicie o software operacional do microscópio usando o computador.
7. Para a Configuração de Aquisição,ajuste Laser 800.

4. Observação usando microscópio de varredura a laser multifotônio

1. Para controle de aquisição deimagens, clique no interruptor fluorescente.
2. Certifique-se de que as luzes da sala e do equipamento estão desligadas. Para reduzir os níveis de ruído, use o microscópio em um ambiente escurecido.
3. Abra o obturador do caminho de luz no microscópio.
4. Gire o filtro de fluorescência para a quarta marcha e puxe as duas alavancas do interruptor óptico.
5. Olhando através da ocular, use os quasispirals de foco grosseiro e fino para ajustar a distância focal, e use os eixosX/Y para ajustar o campo de visão para encontrar a área alvo.

5. Micrografia de varredura a laser multifotônio

1. Desligue o interruptor fluorescente no software, troque o filtro fluorescente para a segunda marcha (a segunda marcha é RXD1) e empurre as duas alavancas do interruptor óptico.
2. Clique em Focus ×2 para visualizar a área de destino e ajustar a configuração de aquisição e os parâmetros de controle de aquisição de imagens (resolução de imagem: 1024).
3. Pressione o controle + C e ajuste a alta tensão, ganho e deslocamento (para reduzir os níveis de ruído).
4. Clique em Parar para interromper a visualização, clique no botão XY para digitalizar em duas dimensões e salvar após a conclusão(Figura 1).
5. Selecione uma região, clique em Profundidadee, em seguida, visualize para selecionar o conjunto final e o conjunto de início (veja a parte completa necessária do vaso sanguíneo) na configuração do microscópio. Digitalize imagens 3D e salve após a conclusão(Figura 2).
6. Selecione uma região, clique em Timee ajuste outros parâmetros de configuração de aquisição e controle de aquisição de imagens (Tamanho da etapa: 1 μm; Fatias: 10; Número de varredura de tempo: 40). Digitalize diferentes fatias e salve após a conclusão para obter imagens em movimento(Vídeo 1).
   NOTA: Tenha alguém cuidando dos ratos durante o exame e adicione anestesia em conformidade.
7. Sacrifique o rato por dissecção do pescoço.

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Resultados

A distribuição dos vasos sanguíneos no fígado pode ser vista na Figura 1,obtida por meio de microscopia multifotona. O vaso sanguíneo é dividido em uma pluralidade de ramos emanando de um tronco e distribuídos para o espaço circundante. A circunferência externa do vaso sanguíneo é vermelha, a cavidade interna é escura, e há muitas coisas dentro. Quanto mais clara a imagem, mais perto do plano de observação ela é. Há também algumas manchas vermelhas ao redor, provavelmente p...

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Discussão

Observar um tecido vivo específico é um meio eficaz de compreender as mudanças, localização e efeitos biológicos do material dentro do tecido¹⁷. Neste experimento, os passos importantes são a fixação do fígado com uma fixação de imagem de órgão, que pode resolver o problema dos artefatos de movimento devido à respiração e batimentos cardíacos, e o uso de um microscópio multifotônio para observação. Usando este método, os tecidos internos do fígado in vivo são observados at...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe x 2	Hunan Pinan Medical Devices Technology	YA0551
5 W heating pad	BiolinkOptics Technology	BL336
75% absolute ethanol	Guangdong Guanghua Sci-Tech	1.17113.023
Absorbent cotton ball	Healthy Sanitation Kingdom
Mouse surgical instrument	RWD Life Science	SP0001-G	Including scissors and tweezers
Multiphoton microscopy	Olympus	FV1200MPE
Organ imaging fixture	BiolinkOptics Technology	BL336	Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran	Sigma	R9379
Shaving machine	Lei Wa	RE-3201
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761-25G