תצפית מיקרוסקופית מולטיפוטון של כלי רקמת כבד עכבר

Summary

בניסוי זה, עכבר מוזרק בווריד הזנב שלו עם רודמין B isothiocyanate-dextran שיכול להכתים כלי דם. לאחר שהכבד נחשף ומתוקן, ניתן לבחור חלק מסוים של הכבד כדי להתבונן ברקמה העמוקה בגוף החי באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון.

Abstract

התבוננות בדינמיקה התוך-וסקולרית של רקמת הכבד של העכבר מאפשרת לנו לבצע תצפיות מעמיקות נוספות ומחקרים על מחלות הקשורות לרקמות של כבד העכבר. עכבר מוזרק עם צבע שיכול להכתים כלי דם. כדי להתבונן בכבד העכבר ב vivo, הוא חשוף ומתוקן במסגרת. תמונות דו מימדיות ותלת מימדיות של כלי הדם ברקמת הכבד מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ מולטי פוטון. תמונות של הרקמות באתרים שנבחרו נרכשות ברציפות כדי לבחון שינויים ארוכי טווח; השינויים הדינמיים של כלי הדם ברקמות הכבד נצפו גם. מיקרוסקופיה מולטי פוטון היא שיטה להתבוננות בתפקוד התא והתא בחלקי רקמות עמוקים או באיברים. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יש רגישות מיקרו מבנה רקמות ומאפשר הדמיה של רקמות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית גבוהה vivo, מתן היכולת ללכוד את המידע הביוכימי של הארגון. מיקרוסקופיה מולטי פוטון משמש כדי לבחון חלק מהכבד אבל תיקון הכבד כדי להפוך את התמונה יציבה יותר הוא בעייתי. בניסוי זה, יניקה ואקום מיוחד משמש כדי לתקן את הכבד ולקבל תמונה יציבה יותר של הכבד מתחת למיקרוסקופ. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון שינויים דינמיים של חומרים ספציפיים בכבד על ידי סימון חומרים כאלה עם צבעים.

Introduction

כלי דם יכולים לספק חומרים מזינים עבור רקמות איברים שונות של גוף האדם, ולהחליף חומרים. במקביל, ציטוקינים רבים, הורמונים, תרופות ותאים מתפקדים גם באמצעות הובלת כלי דם למקומות ספציפיים. התבוננות בשינויים בכלי הדם ברקמת הכבד יכולה לסייע בהבנת התפלגות זרימת הדם ברקמת הכבד והובלת חומרים, ולסייע בניתוח של מחלות מסוימות הקשורות לכלי הדם^1,2.

ישנן דרכים רבות להתבונן בכלי הדם של הכבד בעכברים. ביניהם, מיקרוסקופיה אופטית יש מגבלות רבות בהתבוננות רקמת כלי דם אטומים³. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יכול לשמש כדי לדמיין את כלי הדם של כבדים חיים עם רזולוציה גבוהה פולשנית⁴. לא רק תמונות תלת מימדיות של כלי דם ניתן להשיג, אבל הטכניקה יכולה לשמש גם כדי לעזור לארגן את הרקמה כדי לבחון את ההשפעות הביולוגיות בו; יתר על כן, הרקמה כולה ניתן לדמיין ולא רק את microvessels כמו טומוגרפיה ממוחשבת הדמיה תהודה מגנטית⁵.

מיקרוסקופיה מולטי פוטון ניתן להשתמש כדי לזהות ביעילות אותות פלואורסצנטיים מפוזרים ברקמה חיה עמוקה, עם פוטוטוקסיות פחות⁶. לכן, ניתן להבטיח את הפעילות של רקמה חיה, ואת כמות הנזק ניתן להפחית. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יש כוח חודר טוב יותר מאשר מיקרוסקופיה confocal, המאפשר שכבות עמוקות יותר להיות שנצפו⁷, מתן הדמיה 3D ייחודי. מיקרוסקופיה מולטי פוטון משמשת כיום לעתים קרובות בהדמיית עצבי^{גולגולת 8} והורחבה לחקר הדינמיקה העצבית בעכברים^{חיים 9,10,11}.

בניסוי זה, לאחר תיוג פלואורסצנטי של כלי דם של העכבר, הכבד קבוע במסגרת, ואת הדינמיקה של כלי הדם ברקמת הכבד החי ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון. ניסוי זה מדגים כיצד לסמן חומרים ספציפיים, להשתמש במיקרוסקופיה מולטי פוטוטון כדי לעזור להתבונן במיקום בתוך הרקמה, להתבונן באירועים תאיים ברקמה הבין תאית, לבצע מדידות פוטוכימיות^12,13,14, ולבחון את הדינמיקה החומרית בתוך הרקמה החיה¹⁵. לדוגמה, סמן אנדותל הגידול 1 (TEM1) זוהה כסמן משטח חדשני upregulated על כלי הדם סטרומה בגידולים מוצקים רבים, סימון שבר משתנה שרשרת אחת (scFv) 78 נגד TEM1, ולאחר מכן מיקרוסקופיה multiphoton יכול לשמש עבור מיקום המנגיומה העכבר והערכה של גידולים¹⁶.

Protocol

כל הטיפול והנהלים בבעלי חיים היו בהתאם למדיניות בית החולים סין Nanfang עבור הית ורווחה (יישום לא: NFYY-2019-73).

1. הכנת עכבר

1. תהרם את העכבר.
   1. מכינים נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) במזרק.
   2. תפוס את העכבר (זכר בן 8 שבועות C57BL/6) עם יד שמאל, כך הבטן שלה פונה כלפי מעלה וראשו נמוך יותר הזנב שלה. לחטא את עור הבטן עם 75% אלכוהול.
   3. מחזיק את המזרק ביד ימין, לנקב את הקו הלבן בבטן עם המחט מעט בצד ימין של העור על ידי 3-5 מ"מ. ודא כי מחט המזרק ואת העור נמצאים בזווית של 45 °, להזריק את pentobarbital לאט לתוך חלל הבטן.  לאחר הגילוח, מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ופתרון Chlorhexidine.
   4. בדוק אם ההרדמה הצליחה על ידי היעדר רפלקס תיקון.
2. הזרק רודמין B isothiocyanate-דקסטרן לתוך הווריד caudal.
   1. הכן 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל רודמין B isothiocyanate-dextran במזרק.
   2. נגב את זנב העכבר עם 75% אלכוהול.
   3. להחזיק את הזנב עם היד השמאלית, להחזיק את המזרק ביד ימין עם המחט במקביל לווריד, ולהזריק את צבע 100 μL.
   4. לעצור את הדימום עם ספוגית כותנה לאחר הזריקה.
3. משרים את פרוות הבטן של העכבר עם גזה רטובה במים סטריליים, ומגלחים את הבטן של העכבר באמצעות סכין גילוח, מה שהופך משיכות לכיוון הפרווה. לאחר הגילוח, מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ופתרון Chlorhexidine.
4. לאחר ניגוב כרית חימום עם 75% אלכוהול, לפתוח את כרית החימום, ומניחים את העכבר על גבו כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה ב 37 °C (69 °F).

2. תיקון כבד העכבר עם מסגרת הדמיית איבר הגוף

הערה: מסגרת הדמיית האיברים המסחרית עדיין לא שוחררה.

1. מניחים יניקה נקייה בתנוחה קבועה.
2. התקינו מתקן הדמיית איברים(איור 1 משלים)ונגבו את כרית החימום ואת היניקה ב-75% אלכוהול.
3. חבר את היניקה (בקוטר 5 ממ) לצינור משאבת הוואקום והפעל את משאבת הוואקום.
4. על שולחן סטרילי מעוקר עם 75% אלכוהול, מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ופתרון Chlorhexidine, ולאחר מכן מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול פתרון Chlorhexidine, ולאחר מכן להשתמש במספריים כירורגיים לחתוך 2 ס"מ של העור את הגבול התחתון של העכבר ולחשוף את
5. מניחים את העכבר יחד עם כרית החימום על בסיס המחזיק.
6. התאימו את מתקן הדמיית האיברים כך שגביע היניקה יחזיק את הכבד. לאחר מכן השתמשו בלחץ שלילי של 30-35 קילוואט-אפ ליניקה, כך שהכבד נצמד לגביע היניקה(איור משלים 2).

3. התאמת מיקרוסקופ סריקת לייזר מולטי פוטון

1. הפעל את המיקרוסקופ מרובה פוטון ובחר את המטרה 60x/1.00 W.
2. תקן את המסגרת והעכבר מתחת לעדשה האובייקטיבית.
3. מוסיפים טיפה של מלוחים רגילים שיכולים לכסות את כל העדשה, שהיא מרכז היניקה, ולהתאים את העדשה האובייקטיבית רק כדי לגעת במלח הרגיל.
4. לחץ פעמיים על סמל המחשב כדי להפעיל את תוכנת הלייזר ולהדליק את המתג. לאחר מכן לחץ לחיצה ארוכה על לחצן ההפעלה והתריס למשך 3 שניות.
5. הגדר את אורך הגל ל-800 ננומטר.
6. הפעל את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ באמצעות המחשב.
7. עבור הגדרת הרכישה, הגדר לייזר 800.

4. תצפית באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר מולטי פוטון

1. עבור בקרת רכישת תמונה, לחץ על הבורר פלואורסצנטי.
2. ודא שאורות החדר והציוד כבויים. כדי להפחית את רמות הרעש, השתמש במיקרוסקופ בסביבה חשוכה.
3. פתח את תריס נתיב האור במיקרוסקופ.
4. סובב את מסנן הפלואורסצנטי להילוך הרביעי ומשוך את שני המנופים של המתג האופטי.
5. במבט דרך העינית, להשתמש quasispirals התמקדות גסה ועדינה כדי להתאים את אורך המוקד, ולהשתמש צירי X/Y כדי להתאים את שדה הראייה כדי למצוא את אזור היעד.

5. מיקרוגרפיה של סריקת לייזר מולטיפוטון

1. כבה את מתג הפלורסנט בתוכנה, העבר את מסנן הפלורסנט להילוך השני (ההילוך השני הוא RXD1) ולחץ על שני המנופים של המתג האופטי.
2. לחץ על פוקוס ×2 כדי להציג בתצוגה מקדימה את אזור היעד ולהתאים את הגדרת הרכישה ואת הפרמטרים של בקרת רכישת התמונה (רזולוציית תמונה: 1024).
3. לחץ על Control + C והתאם את המתח הגבוה, הרווח וההיסט (כדי להפחית את רמות הרעש).
4. לחצו על 'עצור' כדי לעצור את התצוגה המקדימה, לחצו על הלחצן XY לסריקה בשני ממדים ושמרו לאחר השלמתו (איור 1).
5. בחר אזור, לחץ על עומקולאחר מכן תצוגה מקדימה כדי לבחור את ערכת הסיום ולהתחיל להגדיר (ראה את החלק הנדרש המלא של כלי הדם) בהגדרה מיקרוסקופ. סרוק תמונות תלת-ממד ושמור לאחר השלמתן (איור 2).
6. בחר אזור, לחץ על זמן, והתאם הגדרת רכישה אחרת ופרמטרים של בקרת רכישת תמונה (גודל שלב: 1 מיקרומטר; פרוסות: 10; מספר סריקת זמן: 40). לסרוק פרוסות שונות ולשמור לאחר השלמת כדי להשיג תמונות נעות (וידאו 1).
   הערה: יש מישהו לטפל בעכברים במהלך הסריקה ולהוסיף הרדמה בהתאם.
7. להקריב את העכבר על ידי ניתוח בצוואר.

תוצאות

את התפלגות כלי הדם בכבד ניתן לראות באיור 1, המתקבל באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון. כלי הדם מחולק לריבוי ענפים הנובעים מתא מטען ומופצים לחלל שמסביב. ההיקף החיצוני של כלי הדם הוא אדום, החלל הפנימי חשוך, ויש הרבה דברים בפנים. ככל שהתמונה ברורה יותר, כך היא קרובה יותר למישור התצ...

Discussion

התבוננות ברקמה חיה ספציפית היא אמצעי יעיל להבנת השינויים, לוקליזציה, ואת ההשפעות הביולוגיות של החומר בתוך הרקמה¹⁷. בניסוי זה, הצעדים החשובים הם תיקון הכבד עם גוף הדמיית איברים, אשר יכול לפתור את הבעיה של חפצי תנועה עקב נשימה ופעימות לב, ושימוש במיקרוסקופ מולטי פוטון לתצפית. בשי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe x 2	Hunan Pinan Medical Devices Technology	YA0551
5 W heating pad	BiolinkOptics Technology	BL336
75% absolute ethanol	Guangdong Guanghua Sci-Tech	1.17113.023
Absorbent cotton ball	Healthy Sanitation Kingdom
Mouse surgical instrument	RWD Life Science	SP0001-G	Including scissors and tweezers
Multiphoton microscopy	Olympus	FV1200MPE
Organ imaging fixture	BiolinkOptics Technology	BL336	Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran	Sigma	R9379
Shaving machine	Lei Wa	RE-3201
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761-25G