Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمكن استخدام الاقترانات التقليدية BODIPY للخلية الحية جزيء واحد المجهري ة توطين (SMLM) من خلال استغلال بهم تشكيل عابرة، والأحمر تحول الدولة الخافتات. نحن نقدم بروتوكول SMLM الأمثل لتتبع وحل الدهون المحايدة دون الخلوية والأحماض الدهنية في الثدييات الحية وخلايا الخميرة على مقياس طول nanoscopic.

Abstract

تقنيات المجهر توطين جزيء واحد (SMLM) التغلب على حد الحيود البصري من المجهر الفلوري التقليدية ويمكن حل الهياكل داخل الخلايا وديناميات الجزيئات الحيوية مع ~ 20 نانومتر الدقة. ومن الشروط الأساسية لـ SMLM الفلوروفوريات التي تنتقل من حالة مظلمة إلى حالة فلورية من أجل تجنب التداخل الزمني للنقاط التي تعمل على نشر النقاط في كل من آلاف إطارات الحصول على البيانات. BODIPYs هي الأصباغ الراسخة مع العديد من المتجانسات المستخدمة في المجهر التقليدي. ينتج عن التكوين العابر للديمنات الأرضية ذات الحالة الأرضية التي تحولت من BODIPY (DII)انبعاثات جزيء واحد مشرقة تمكن من إجراء المجهر توطين جزيء واحد (SMLM). هنا نقدم بروتوكول بسيط ولكن تنوعا لSMLM مع الاقتران اتبوبي التقليدية في الخميرة الحية وخلايا الثدييات. ويمكن استخدام هذا الإجراء للحصول على صور فائقة الدقة وتتبع حالات بودي ديالثاني واحدة لاستخراج المعلومات الزمنية spatio من الاقترانات BODIPY. نحن نطبق هذا الإجراء لحل قطرات الدهون (LDs) ، والأحماض الدهنية ، والليسوسومافي ة الخميرة الحية وخلايا الثدييات على مقياس طول النانسكوبي. وعلاوة على ذلك، ونحن نظهر قدرة التصوير متعددة الألوان مع الأصباغ BODIPY عند استخدامها جنبا إلى جنب مع تحقيقات الفلورسنت الأخرى. تظهر نتائجنا التمثيلية التوزيع المكاني التفاضلي وحركة الأحماض الدهنية BODIPY والدهون المحايدة في الخميرة في ظل ظروف التغذية والصيام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول الأمثل لSMLM مع مئات من المجمعات المتاحة تجاريا BODIPY وهو مورد مفيد لدراسة العمليات البيولوجية على مقياس النانو أبعد بكثير من تطبيقات هذا العمل.

Introduction

ظهرت تقنيات المجهر المجهري ة ذات الجزيء الواحد (SMLM) مثل المجهر الضوئي لإعادة البناء العشوائي (STORM) والمجهر التوطين المنشط بالصور (PALM) كطرق لتوليد صور فائقة الدقة مع معلومات تتجاوز حد الحيود البصري لآبي1،2 ولتتبع ديناميكيات الجزيئات الحيوية المفردة3،4. أحد متطلبات المسابير المتوافقة مع SMLM هو القدرة على التحكم في عدد الفلوروبورورس النشط في أي وقت لتجنب التداخل المكاني لوظائف انتشار النقاط (PSF). في كل من الآلاف من إطارات الحصول على البيانات ، يتم تحديد موقع كل فلوروفوريس الفلورسنت مع ~ 20 نانومتر الدقة عن طريق تركيب وظيفة انتشار نقطة المقابلة. تقليديا، وقد تم التحكم في وامض على قبالة من الفلوروفوراس من خلال تبديل الضوئي stochastic1،,2،,5 أو الناجمة كيميائيا الوميض الجوهرية6. وتشمل النهج الأخرى التنشيط المستحث للفلوروجين اتّلى على ربط عابر لبروتين الفلوروجين المنشط7،,8 والربط غير الملزم للبرمجة من oligomers الحمض النووي المسمى في الفلورسة الانعكاسية الداخلية الكلية (TIRF) أو إثارة ورقة الضوء9. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا عن استراتيجية جديدة ومتعددة الاستخدامات لـ SMLM10 التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا مع تغير اللون الأحمر (DII)حالات البورون التقليدية دي بيروميثان (BODIPY) التي تتجاور11،12،13 تتشكل بشكل عابر وتصبح متحمسة على وجه التحديد ويتم اكتشافها مع أطوال موجية ذات تحول أحمر.

BODIPYs هي الأصباغ المستخدمة على نطاق واسع مع مئات من المتغيرات التي تسمية على وجه التحديد المقصورات دون الخلوية والجزيئات الحيوية14،15،16. بسبب سهولة استخدامها وتطبيقها في الخلايا الحية ، تتوفر متغيرات BODIPY تجاريًا للتنظير المجهري التقليدي للفلورسينس. هنا ، نحن نصف بروتوكول مفصل والأمثل حول كيفية مئات من المتاحة تجاريا BODIPY conjugates يمكن استخدامها ليعيش الخلية SMLM. من خلال ضبط تركيز مونومرات BODIPY وعن طريق تحسين قوى الليزر الإثارة ، يتم الحصول على معلمات التصوير وتحليل البيانات والصور عالية الدقة عالية الدقة وبيانات تتبع الجزيء الواحد في الخلايا الحية. عند استخدامها بتركيز منخفض (25-100 nM)، يمكن استخدام الاقترانات بوديبي في وقت واحد لSMLM في القناة الحمراء التحول وللمجهرية الفلورية التقليدية القرابة في قناة الانبعاثات التقليدية. يمكن تحليل بيانات الجزيء الواحد التي تم الحصول عليها لتحديد التنظيم المكاني للهياكل غير المتنقلة واستخراج الحالات المنحلة للجزيئات في الخلايا الحية17. توافر تحقيقات BODIPY في كل من الأشكال الخضراء والحمراء يسمح للتصوير متعدد الألوان عند استخدامها في المزيج الصحيح مع الفلوروفوريات الأخرى المتوافقة.

في هذا التقرير، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل للحصول على وتحليل البيانات الخلية الحية SMLM باستخدام BODIPY-C12،BODIPY (493/503)، BODIPY-C12 الأحمر وlysotracker-الأخضر في ألوان متعددة. نحن حل الأحماض الدهنية والدهون محايدة في الخميرة الحية وخلايا الثدييات مع ~ 30 نانومتر القرار. ونحن نثبت كذلك أن خلايا الخميرة تنظيم التوزيع المكاني للأحماض الدهنية المضافة خارجيا اعتمادا على حالتها الأيضية. نجد أن وأضاف BODIPY الأحماض الدهنية (FA) التوطين إلى التحمية الإندوسلية (ER) وقطرات الدهون (LDs) في ظل ظروف تغذية في حين BODIPY-FAs تشكل مجموعات غير LD في غشاء البلازما عند الصيام. كما نقوم بتوسيع نطاق تطبيق هذه التقنية إلى صورة الليسوسوماوسومات والمواد LDs في خلايا الثدييات الحية. لدينا بروتوكول الأمثل لSMLM باستخدام الاقترانات BODIPY التقليدية يمكن أن يكون موردا مفيدا لدراسة العمليات البيولوجية على مقياس النانو مع عدد لا يحصى من الاتزان اتّهاب ة BODIPY المتاحة.

Protocol

ملاحظة: لاستنساخ الخميرة ووضع العلامات الذاتية يرجى الرجوع إلى المنشور الأخير10.

1. إعداد عينات خلايا الخميرة للتصوير

  1. إعداد ثقافة السائل بين عشية وضحاها من سلالة الخميرة w303. باستخدام عصا خشبية معقمة، بقعة كمية صغيرة من خلايا الخميرة من لوحة أجار التي تحتوي على استخراج الخميرة-peptone-dextrose في أنبوب ثقافة مع ~ 2 مل من dextrose الاصطناعية كاملة (SCD) المتوسطة. احتضان الأنبوب بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز في 270 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
  2. إجراء تخفيف 1:50 صباحي للخلايا في SCD. استمر في استزراع الخلايا المخففة لمدة 4 ساعة عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز 270 دورة في الدقيقة ، مما يسمح للخلايا بالنمو في مرحلة الأسي والوصول إلى كثافة بصرية (OD) تبلغ ~ 0.6.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف الإجراء هنا اعتماداً على الحالة الأيضية التي يتم دراستها. لا تتطلب الاتزانات BODIPY خلايا في مرحلة النمو الأسي. ومع ذلك ، كن مدركًا للفلور الفلورية من الخلايا الميتة خلال المرحلة الثابتة ، حيث يمكن أن يسبب إشارة خلفية قوية جدًا لتحليل انبعاثات BODIPY-DII واحدة.
  3. لدراسة خلايا الصيام، وتنمو ثقافة الخميرة لمدة 2 أيام دون تبادل وسائل الإعلام.
  4. في ~ 30 دقيقة قبل طلاء الخلايا، واحتضان غطاء زجاجي غرفة مع 80 ميكرولتر من 0.8 ملغ/ مل معقم Concanavalin A (كونا) في H2O deionized في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، اغسل زجاج الغلاف ثلاث مرات بH2O المنتأين.
  5. في ~ 30 دقيقة قبل التصوير، ماصة الخلايا على زجاج الغلاف غرفة، مع الحجم الصحيح من SCD الطازجة لتحقيق كثافة بصرية من ~ 0.12 (عادة 60 ميكرولتر ثقافة الخميرة في OD ~ 0.6 في 240 ميكرولتر SCD). السماح للخلايا تسوية والالتزام سطح كونا لمدة 30 دقيقة.
  6. إضافة الاقتران بودي المطلوب مباشرة إلى زجاج الغلاف غرفة بتركيز النهائي من ~ 100 nM.
    ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى تجربة تحسين تركيز BODIPY اعتماداً على الكثافة المحلية BODIPYs في مقصورة خلوية معينة.

2. إعداد خلايا الثدييات لتصوير SMLM

  1. الحفاظ على خلايا U2OS الثدييات في DMEM غير الفلورية مع 10٪ مصل البقر الجنين، 4 mM الجلوتامين، 1 mM بيروفات الصوديوم والمضادات الحيوية البنسلين-العقديات 1٪ في قارورة T25.
    ملاحظة: يمكن أيضًا الحفاظ على الخلايا في DMEM مع مصل البقر الجنيني بنسبة 10٪ والمضادات الحيوية البنسلين-العقديات، ومع ذلك، يجب تبادل الوسط قبل التصوير مع محلول غير فلوري.
  2. تقسيم الخلايا في 70-80٪ التقاء 1:5 في بئر واحد من لوحة 8 بئر. ثقافة الخلايا في لوحة 8 بئر لمدة 12 إلى 24 ساعة قبل التصوير.
  3. إضافة BODIPY-C12، LysoTracker الأخضر أو أي اقتران BODIPY أخرى في تركيز نهائي من 100 nM (حلول الأسهم في كبريتيد ثنائي ميثيل [DMSO]) 10 دقيقة قبل التصوير. يمكن أن تختلف هذه المرة استناداً إلى التجربة المطلوبة.
    ملاحظة: يمكن إجراء التصوير في درجة الحرارة المحيطة (23 درجة مئوية) باستخدام محلول تصوير الخلايا الحية. ومع ذلك، التصوير في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 مع DMEM غير الفلورية مختلطة مع 10٪ مصل البقري الجنيني، 4 mM الجلوتامين، 1 mm بيروفات الصوديوم والمضادات الحيوية البنسلين-العقديات 1٪ ويفضل للحفاظ على الخلايا أقرب إلى الظروف الفسيولوجية وجعل استنتاجات بيولوجية.

3- إعداد المعدات

  1. قم بتركيب مجموعات التصفية المناسبة في مسار الانبعاثات استنادًا إلى لون الانبعاثات لـ BODIPY المستخدم.
    ملاحظة: مرآة ديكهرويك رباعية النطاقات (zt/405/488/561/640rdc) أولاً يفصل الإثارة عن ضوء الانبعاثات. ثم يتم تقسيم الانبعاثات الخضراء (525 نانومتر) والانبعاثات الحمراء (595 نانومتر) بواسطة مقسم شعاع تمريرة طويلة الديكهرويك (T562lpxr) تليها مرشحات تمرير الفرقة ET525/50 في القناة الخضراء وET 595/50 في القناة الحمراء. ثم يتم عرض القناتين إلى مناطق مختلفة من نفس رقاقة الكاميرا. وبالمثل، يتم تقسيم الانبعاثات الحمراء (595 نانومتر) والانبعاثات الحمراء البعيدة أولاً بواسطة مقسم شعاع طويل التمرير (FF652-Di01) متبوعاً بمرشحات تمرير الفرقة ET 610/75 في الأحمر وFF731/137 في القناة الحمراء البعيدة.
  2. بدوره على المجهر، مرحلة المجهر، وأشعة الليزر (488 نانومتر، 561 نانومتر) والكاميرا. هنا يتم استخدام المجهر مقلوب مع نظام التركيز المثالي وكاميرا EMCCD تبريد إلى -68 درجة مئوية.
  3. إضافة قطرة من زيت الغمر على الهدف المجهر.
  4. افتح برنامج Hal4000 (انظر جدول المواد)الذي يتحكم في ضوء LED للتصوير الميداني الساطع وقوى الليزر ومصاريع الليزر وإعدادات الكاميرا للتصوير. تعيين مكاسب EMCCD إلى 30 ودرجة حرارة الكاميرا إلى -68 درجة مئوية. إعداد الكاميرا والبرامج المقابلة لتسجيل الأفلام في 20 هرتز.
    ملاحظة: تنطبق هذه التقنية على أي مجهر واسع المجال قادر على التصوير المجهري للتعريب (PALM) والمجهر الضوئي (STORM) الذي يتم تنشيطه ضوئيًا. قد تختلف البرامج المقابلة.
  5. بدوره على سخان مرحلة المجهر وتعيينها إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية وإلى مستوى CO2 من 5٪. ضبط طوق التصحيح الهدف وفقا لذلك.
  6. قم بتركيب العينة على مرحلة المجهر وركز حتى يشارك نظام التركيز. نقل المرحلة باستخدام وحدة تحكم المرحلة حتى تظهر خلايا صحية في مجال العرض.
    ملاحظة: للتصوير بخلايا الخميرة في درجة حرارة الغرفة، ليست هناك حاجة لتشغيل سخان أو CO2 التحكم.
  7. بدوره على الليزر المناسب لإثارة مونومرات وكذلك dimers. لBODIPY الخضراء أو LysoTracker الخضراء، ونحن نستخدم ليزر 561 نانومتر لإثارة الدول DII لSMLM وليزر 488 نانومتر لإثارة مونومرات للفلورسينس التقليدية.
    ملاحظة: لBODIPY الأحمر، واستخدام ليزر 640 نانومتر لإثارة الدول DII لSMLM وليزر 561 نانومتر لإثارة مونومرات للفلورسرينس التقليدية. لBODIPY الأحمر، وضبط 561 نانومتر و 640 نانومتر سلطات الليزر لتصور الفلورسال السائبة في القناة الحمراء ورشقات نارية جزيء واحد في القناة الحمراء البعيدة. الطاقة النموذجية ل561 نانومتر ~ 0.06 W/cm2 و ~ 5 كيلوواط / سم2 ل640 نانومتر. لBODIPY الخضراء، نتوقع أن نرى أيضا الفلورسال التقليدية في قناة الانبعاثات الخضراء تحت 561 نانومتر الإثارة. لBODIPY الأحمر، نتوقع أن نرى الفلورسين التقليدية في القناة الحمراء تحت 640 نانومتر الإثارة. تنشأ هذه الإشارة من الانبعاثات المضادة لستوكس ، والتي تصبح مفيدة لصور التعريب المشترك المونومر / خافت مع الإثارة المستمرة بالليزر.

4 - الحصول على البيانات

  1. تحميل تسلسل مصراع الليزر لإثارة مونومرات وكذلك dimers.
    ملاحظة: نحن عادة استخدام تسعة إطارات إثارة جزيء واحد في 561 نانومتر تليها إطار الإثارة التقليدية واحدة في 488 نانومتر. وهذا يوفر إشارة أكثر إشراقا الفلورسيز التقليدية ويتجنب تسرب آخر 488 نانومتر الفلوروفور ينقب مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في قناة الكشف عن جزيء واحد الأحمر في تطبيقات التصوير متعددة الألوان. بدلاً من ذلك، قم بتشغيل الليزر 561 نانومتر بشكل مستمر ويعتمد على الانبعاثات المضادة لستوكس للصور التقليدية في قناة الطول الموجي الأقصر.
  2. ضبط قوى الليزر بحيث يتم الكشف عن رشقات نارية الفلورسينس جزيء واحد في قناة الانبعاثات الحمراء تحول تحت 561 نانومتر الإثارة، ويظهر الفلورسال التقليدية في قناة الانبعاثات الخضراء مع 488 نانومتر الإثارة. وسوف تكون قوى الليزر النموذجية من ليزر 561 نانومتر حوالي 0.8-1 كيلوواط /سم2 لSMLM، و 0.035-0.07 W/cm2 لليزر 488 نانومتر في وضع التصوير الفلوري التقليدي.
  3. اختر مجلد ًا للأفلام وسجل إطارات الاستحواذ 5,000-20,000 لجمع عمليات تعريب كافية لإعادة بناء الصور فائقة الدقة.
  4. الانتقال إلى حقول عرض مختلفة وتكرار الخطوات المذكورة أعلاه لجمع البيانات من المزيد من الخلايا.

5- تحليل البيانات وتتبع الجزيء الواحد

  1. تحميل الفيلم في برنامج تحليل SMLM.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي برنامج18. نحن نستخدم INSIGHT (انظر جدول المواد)وعبر التحقق من صحة النتائج باستخدام البرنامج المساعد ThunderSTORM19 لimageJ (فيجي).
  2. شاشة الفيلم بصريا وضبط إعدادات التباين مثل أن التئم الفلور سيوم واحد الوميض مرئية. إذا لزم الأمر تقييد المنطقة أو نطاق الإطار لتحليل البيانات SMLM إذا كانت أجزاء من العينة تفلور باستمرار.
  3. تعيين معلمات تحديد جزيء واحد للتركيب مع 2D غاوسي PSFs (ROI: 7 × 7 بكسل مع حجم بكسل 160 نانومتر، عرض 260-650 نانومتر، ارتفاع > 50 فوتون). بصريا الشاشة من خلال بعض الإطارات المثال للتحقق من معلمات تحديد الهوية والكشف بشكل موثوق عن رشقات نارية الفلورالية جزيء واحد متميزة (انظر الشكل 1C).
    ملاحظة: يمكن تعديل بعض معلمات التعريف مثل الارتفاع والعرض قليلاً لتحسين التعرف على إشارات الفلورسان الجزيء الواحد المتصورة بصرياً.
  4. إجراء تحليل صورة SMLM مع معلمات التعريف الأمثل ثم تقديم كل جزيء واحد كغاوسي 2D الذي يتم ترجيح عرضه من قبل الجذر التربيعي العكسي لعدد الفوتونات المكتشفة.
  5. تقييم جودة البيانات. استخدم نطاقات الإطار المقيدة لمراقبة توزيعات الجزيء الواحد في حالات أكثر تحديدًا في الوقت المناسب. وهذا يمكن أن تفسر حركة العضيات أثناء الحصول على البيانات.
  6. لمزيد من التحليل للتوزيع المكاني وديناميات توزيعات الجزيء، قم بتصدير قائمة الجزيئات التي تم الحصول عليها التي تحتوي على إحداثيات وإطارات المظهر والفوتون اتّهاب وارتفاعات التوطين. استيراد قائمة الجزيئات في إجراءات التحليل الكتابي المخصصة.
  7. للحصول على معلومات مكانية لتوزيع جزيء واحد، قم بحساب وظيفة التوزيع الشعاعي ة (ص)، والتي تمثل كثافة التعريب كدالة للمسافة الشعاعية20. للحصول على (ص)، احسب مسافات فريدة من نوعها من جميع الإعدادات، قم بإنشاء الرسم البياني مع صناديق تتركز في صi مع ارتفاع H (ri)ومع عرض dr وتقسيمها على 2μri*dr؛ (ri)= H (r i)/ο(ri+dr)2-ri2).i ويمكن بعد ذلك استخدام وظيفة التوزيع الشعاعي للقياس الكمي ومقارنة درجة التجميع وكذلك الحجم المميز للمجموعات.
  8. للحصول على معلومات ديناميكية حول انتشار الجزيئات، ربط التعريبات التي تظهر على سبيل المثال ضمن 3 بكسل (0.48 ميكرومتر) في إطارات اكتساب البيانات المتتالية لإنشاء آثار جزيء واحد.
    ملاحظة: تعتمد مسافة الربط على انتشار الجزيئات وكثافة التعريب. يمكن تقدير المسافة القصوى للربط من خلال تحليل كثافة التعريب في كل إطار21،22. تم تحديد متوسط الكثافة على أنه 0.043 توطين لكل ميكرومتر2; وبالتالي كان نصف قطر 0.48 ميكرون ضمن كثافة منخفضة بما فيه الكفاية لضمان عدم ربط جزيئات مختلفة معا.
  9. متوسط عمليات الإزاحة لأوقات التأخر المختلفة من آثار متعددة تدوم ثلاث مرات تأخير على الأقل لإنشاء إزاحة مربعة متوسطة (MSD) مقابل مؤامرة. تناسب منحنى MSD مقابل. ΟT مع المعادلة MSD = 4DΟt +2 لحساب معامل الانتشار المتوسط D3.

النتائج

هنا ، نقدم إعداد عينة الأمثل ، وحيازة البيانات وتحليلها إجراءات لSMLM باستخدام الاقتران BODIPY على أساس البروتوكول أعلاه(الشكل 1A). لإثبات مثال على سير العمل للحصول على وتحليل البيانات SMLM، ونحن توظيف BODIPY (493/503) في الخميرة لحل LDs تحت حد الحيود البصري(الشكل 1B-F).

Discussion

في هذا البروتوكول ، أظهرنا كيف يمكن استخدام الاقترانات التقليدية BODIPY للحصول على صور SMLM مع ترتيب تحسن الحجم في الاستبانة المكانية. ويستند هذا الأسلوب على استغلال الحالات التي تم الإبلاغ عنها سابقا، والأحمر تحول DII من الأصباغ بودي التقليدية، والتي تشكل بشكل عابر من خلال لقاءات ثنائية...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح متنافسة.

Acknowledgements

وقد دعم البحث الوارد في هذا المنشور المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R21GM127965.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BODIPY C12ThermoFisherD3822Green fatty acid analog
BODIPY C12 RedThermoFisherD3835Red fatty acid analog
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922Neutral lipid marker
Concanavalin ASigma-AldrichC2010Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen baseUS BiologicalD9515Amino acids for SCD
DextroseSigma-AldrichG7021Carbon source for SCD
Eight WellCellvisC8-1.58-NChambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek IISigma-AldrichChambered Coverglasses
ET525/50ChromaBandpass filter
ET595/50ChromaBandpass filter
ET610/75ChromaBandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140079Serum
FF652SemrockBeam splitter
FF731/137SemrockBandpass filter
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Cell culture medium
Hal4000Zhuang Lab, Harvard UniversityData acquisition software
Ixon89Ultra DU-897UAndorEMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBISLasers for excitation
Insight3Zhuang Lab, Harvard UniversitySingle molecule localization software
L-GlutamineGibco25030-081Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solutionThermoFisherA14291DJImaging buffer
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonOil immersion objective
Penicillin streptomycinGibco15140-122Antibiotics
Sodium PyruvateGibco11360-070Supplement for cell culture
T562lpxrChromaBeam splitter
Trypsin-EDTAGibco15400-054Dissociation of adherent cell
W303 MATa strainHorizon-DharmaconYSC1058Parental yeast strain
Yeast Nitrogen BaseSigma-AldrichY1250Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdcChromaQuadband dichroic mirror

References

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved