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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Herkömmliche BODIPY-Konjugate können für die livezellige Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) durch Ausnutzung ihrer vorübergehend bildenden, rot verschiebeten Bodenzustandsdimer eingesetzt werden. Wir präsentieren ein optimiertes SMLM-Protokoll zur Verfolgung und Auflösung subzellulärer neutraler Lipide und Fettsäuren in lebenden Säugetier- und Hefezellen auf der nanoskopischen Längenskala.

Zusammenfassung

Die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM)-Techniken überwinden die optische Beugungsgrenze der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie und können intrazelluläre Strukturen und die Dynamik von Biomolekülen mit einer Genauigkeit von 20 nm auflösen. Eine Voraussetzung für SMLM sind Fluorophore, die von einem dunklen in einen fluoreszierenden Zustand übergehen, um eine räumlich-zeitliche Überlappung ihrer Punktausbreitungsfunktionen in jedem der Tausenden von Datenerfassungsrahmen zu vermeiden. BODIPYs sind etablierte Farbstoffe mit zahlreichen Konjugaten, die in der konventionellen Mikroskopie verwendet werden. Die transiente Bildung rot verschiebtiger BODIPY-Boden-Dimere (DII) führt zu einer hellen Einzelmolekülemission, die eine Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) ermöglicht. Hier präsentieren wir ein einfaches, aber vielseitiges Protokoll für SMLM mit konventionellen BODIPY-Konjugaten in lebenden Hefe- und Säugetierzellen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um hochauflösende Bilder zu erfassenII und einzelne BODIPY-D II-Zustände zu verfolgen, um räumlich-zeitliche Informationen von BODIPY-Konjugaten zu extrahieren. Wir wenden dieses Verfahren an, um Lipidtröpfchen (LDs), Fettsäuren und Lysosomen in lebenden Hefe- und Säugetierzellen auf der nanoskopischen Längenskala aufzulösen. Darüber hinaus demonstrieren wir die mehrfarbige Bildgebungsfähigkeit mit BODIPY-Farbstoffen in Verbindung mit anderen fluoreszierenden Sonden. Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen die differenzierte räumliche Verteilung und Mobilität von BODIPY-Fettsäuren und neutralen Lipiden in Hefe unter gefütterten und gefasteten Bedingungen. Dieses optimierte Protokoll für SMLM kann mit Hunderten von kommerziell erhältlichen BODIPY-Konjugaten verwendet werden und ist eine nützliche Ressource, um biologische Prozesse im Nanomaßstab weit über die Anwendungen dieser Arbeit hinaus zu untersuchen.

Einleitung

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) Techniken wie stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) haben sich als Methoden zur Erzeugung von hochauflösenden Bildern mit Informationen jenseits der optischen Beugungsgrenze1,2 und zur Verfolgung der Dynamik einzelner Biomoleküle3,4herauskristallisiert. Eine der Anforderungen für Sonden, die mit SMLM kompatibel sind, ist die Fähigkeit, die Anzahl der aktiven Fluorophore jederzeit zu kontrollieren, um räumliche Überschneidungen ihrer Punktstreufunktionen (PSF) zu vermeiden. In jedem der Tausenden von Datenerfassungsrahmen wird dann die Position der einzelnen fluoreszierenden Fluorophore mit einer Genauigkeit von 20 nm bestimmt, indem die entsprechende Punktstreufunktion angebracht wird. Traditionell wurde das On-Off-Blinken von Fluorophoren durch stochastisches Photoswitching1,2,5 oder chemisch induziertes intrinsisches Blinken6gesteuert. Weitere Ansätze sind die induzierte Aktivierung von Fluorogenen bei vorübergehender Bindung an ein fluorogen-aktivierendes Protein7,8 und die programmierbare bindungsfreie Bindung von markierten DNA-Oligomeren in der gesamten inneren Reflexionsfluoreszenz (TIRF) oder Lichtblattanregung9. Kürzlich berichteten wir über eine neuartige und vielseitige Etikettierungsstrategie für SMLM10, in der zuvor gemeldete rot verschiebte Dimer (DII) Zustände herkömmlicher Bor-Di-Pyromethan (BODIPY)-Konjugate11,12,13 vorübergehend bilden und speziell angeregt und mit rot verschobenen Wellenlängen erkannt werden.

BODIPYs sind weit verbreitete Farbstoffe mit Hunderten von Varianten, die speziell subzelluläre Kompartimente und Biomoleküle14,15,16kennzeichnen. Aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit und Anwendbarkeit in lebenden Zellen sind BODIPY-Varianten für die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir ein detailliertes und optimiertes Protokoll, wie die Hunderte von kommerziell erhältlichen BODIPY-Konjugaten für Live-Cell-SMLM verwendet werden können. Durch die Optimierung der Konzentration von BODIPY-Monomeren und die Optimierung der Anregungslaserkräfte, Bildgebungs- und Datenanalyseparameter werden hochwertige hochauflösende Bilder und Einzelmolekül-Tracking-Daten in lebenden Zellen gewonnen. Bei geringer Konzentration (25-100 nM) können BODIPY-Konjugate gleichzeitig für SMLM im rot verschiebten Kanal und für die korrelative konventionelle Fluoreszenzmikroskopie im konventionellen Emissionskanal eingesetzt werden. Die erhaltenen Einzelmoleküldaten können analysiert werden, um die räumliche Organisation unbeweglicher Strukturen zu quantifizieren und die diffusiven Zustände von Molekülen in lebenden Zellen zu extrahieren17. Die Verfügbarkeit von BODIPY-Sonden in grüner und roter Form ermöglicht eine mehrfarbige Bildgebung, wenn sie in der richtigen Kombination mit anderen kompatiblen Fluorophoren verwendet wird.

In diesem Bericht bieten wir ein optimiertes Protokoll zum Erfassen und Analysieren von Live-Zell-SMLM-Daten mit BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rot und Lysotracker-Grün in mehreren Farben. Wir lösen Fettsäuren und neutrale Lipide in lebenden Hefe- und Säugetierzellen mit einer Auflösung von 30 nm. Wir zeigen weiter, dass Hefezellen die räumliche Verteilung von extern zugesetzten Fettsäuren in Abhängigkeit von ihrem Stoffwechselzustand regulieren. Wir stellen fest, dass zugesetzte BODIPY-Fettsäuren (FA) das endoplasmatische Retikulum (ER) und Lipidtröpfchen (LDs) unter gefütterten Bedingungen lokalisieren, während BODIPY-FAs beim Fasten nicht-LD-Cluster in der Plasmamembran bilden. Wir erweitern die Anwendung dieser Technik auf Bildlysosomen und LDs in lebenden Säugetierzellen. Unser optimiertes Protokoll für SMLM mit herkömmlichen BODIPY-Konjugaten kann eine nützliche Ressource sein, um biologische Prozesse im Nanomaßstab mit den unzähligen verfügbaren BODIPY-Konjugaten zu untersuchen.

Protokoll

HINWEIS: Zum Hefeklonen und endogenen Tagging lesen Sie bitte unsere aktuelle Publikation10.

1. Herstellung von Hefezellproben zur Bildgebung

  1. Bereiten Sie eine flüssige Nachtkultur eines w303 Hefestamms vor. Mit einem sterilen Holzstab, erkennen Sie eine kleine Menge von Hefezellen aus einer Agarplatte, die Hefeextrakt-Pepton-Dextrose in einem Kulturrohr mit 2 ml synthetischem Komplett-Dextrose-Medium (SCD) enthält. Inkubieren Sie die Röhre über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 270 U/min und 30 °C.
  2. Führen Sie eine 1:50-Morgenverdünnung der Zellen in SCD durch. Die verdünnten Zellen für 4 h bei 30 °C in einem 270 Rpm-Shaking-Inkubator weiter bebauen, so dass die Zellen in exponentiellen Phasen wachsen und eine optische Dichte (OD) von 0,6 erreichen können.
    HINWEIS: Das Verfahren kann hier variieren, je nachdem, welcher Stoffwechselzustand untersucht wird. BODIPY-Konjugate benötigen keine Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase. Beachten Sie jedoch die Autofluoreszenz von abgestorbenen Zellen während der stationären Phase, da es ein HintergrundsignalII verursachen kann, das zu stark ist, um einzelne BODIPY-D II-Emitter zu analysieren.
  3. Für das Studium von Fastenzellen, wachsen die Hefekultur für 2 Tage ohne Austausch von Medien.
  4. In 30 min vor der Beschichtung der Zellen ein kammerkammeriertes Deckglas mit 80 l mit 0,8 mg/ml sterilem Concanavalin A (ConA) bei deionisiertemH2O bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 30 min das Deckglas dreimal mit deionisiertem H2O waschen.
  5. Bei 30 min vor der Bildgebung pipette die Zellen auf dem kammerierten Deckglas, mit dem richtigen Volumen von frischem SCD, um eine optische Dichte von 0,12 zu erreichen (typischerweise 60 L Hefekultur bei OD 0,6 in 240 L SCD). Lassen Sie die Zellen sich absetzen und 30 min an der ConA-Oberfläche haften.
  6. Fügen Sie das gewünschte BODIPY-Konjugat bei einer Endkonzentration von 100 nM direkt in das kammergekammerte Deckglas ein.
    HINWEIS: Je nach lokaler Dichte von BODIPYs in einem bestimmten Zellfach kann ein BODIPY-Konzentrationsoptimierungsexperiment erforderlich sein.

2. Vorbereitung von Säugetierzellen für die SMLM-Bildgebung

  1. Pflegen Sie die Säugetier-U2OS-Zellen in nicht fluoreszierenden DMEM mit 10% fetalem Rinderserum, 4 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 1% Penicillin-Streptomycin-Antibiotika in einem T25-Kolben.
    HINWEIS: Zellen können auch in DMEM mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin-Antibiotika aufrechterhalten werden, jedoch muss das Medium vor der Bildgebung mit einer nicht-autofluoreszierenden Lösung ausgetauscht werden.
  2. Teilen Sie die Zellen bei 70-80% Konfluenz 1:5 in einem einzigen Brunnen einer 8-Well-Platte. Kultur die Zellen in der 8-Well-Platte für 12 bis 24 h vor der Bildgebung.
  3. Fügen Sie BODIPY-C12, LysoTracker Green oder ein anderes BODIPY-Konjugat in einer Endkonzentration von 100 nM (Lagerlösungen in Dimethylsulfoxid [DMSO]) 10 min vor der Bildgebung hinzu. Diese Zeit kann je nach gewünschtem Experiment variieren.
    HINWEIS: Die Bildgebung kann bei Umgebungstemperatur (23 °C) mit einer Live-Zell-Bildgebungslösung durchgeführt werden. Die Bildgebung bei 37 °C und 5 %CO2 mit nicht fluoreszierendem DMEM gemischt mit 10 % fetalem Rinderserum, 4 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 1 % Penicillin-Streptomycin-Antibiotika wird jedoch bevorzugt, um Zellen näher an physiologischen Bedingungen zu halten und biologische Schlussfolgerungen zu ziehen.

3. Gerätevorbereitung

  1. Montieren Sie die entsprechenden Filtersätze in den Emissionspfad, basierend auf der verwendeten Emissionsfarbe von BODIPY.
    HINWEIS: Ein vierband-dichroitischer Spiegel (zt/405/488/561/640rdc) trennt zunächst die Anregung vom Emissionslicht. Die grüne Emission (525 nm) und die rote Emission (595 nm) werden dann durch einen dichroitischen Langpass-Strahlteiler (T562lpxr) geteilt, gefolgt von Bandpassfiltern ET525/50 im grünen Kanal und ET 595/50 im roten Kanal. Die beiden Kanäle werden dann auf verschiedene Bereiche desselben Kamerachips projiziert. Ebenso werden die rote Emission (595 nm) und die far-rote Emission zunächst durch einen dichroitischen Langpass-Strahlteiler (FF652-Di01) geteilt, gefolgt von Bandpassfiltern ET 610/75 im Rot und FF731/137 im fernroten Kanal.
  2. Mikroskop, Mikroskopstufe, Laser (488 nm, 561 nm) und Kamera einschalten. Hier kommen ein invertiertes Mikroskop mit perfektem Fokussystem und einer auf -68 °C gekühlten EMV-Kamera zum Einsatz.
  3. Fügen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Mikroskop objektiv.
  4. Öffnen Sie die Hal4000-Software (siehe Materialtabelle),die das LED-Licht für Lichtfeld-Bildgebung, Laserleistungen, Laserläden und Kameraeinstellungen für die Bildgebung steuert. Stellen Sie die EMVCD-Verstärkung auf 30 und die Kameratemperatur auf -68 °C ein. Bereiten Sie die Kamera und die entsprechende Software vor, um Filme mit 20 Hz aufzunehmen.
    HINWEIS: Diese Technik gilt für jedes Weitfeldmikroskop, das in der Lage ist, fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) zu fotografieren. Entsprechende Software kann variieren.
  5. Schalten Sie die Mikroskop-Bühnenheizung ein und stellen Sie sie auf eine Temperatur von 37 °C und auf einenCO2-Gehalt von 5 %. Passen Sie den Objektivkorrekturkragen entsprechend an.
  6. Montieren Sie die Probe auf der Mikroskopstufe und fokussieren Sie, bis das Fokussiersystem eingreift. Verschieben Sie die Bühne mit dem Stufencontroller, bis fehlerbesagte Zellen im Sichtfeld angezeigt werden.
    HINWEIS: Für die Bildgebung mit Hefezellen bei Raumtemperatur ist es nicht erforderlich, die Heizung oderCO2-Steuerung einzuschalten.
  7. Schalten Sie die entsprechenden Laser für die Anregung von Monomeren sowie Dichern ein. Für BODIPY green oder LysoTracker green verwenden wir einen 561 nm Laser, um DII-Zustände für SMLM zu erregen, und einen 488 nm Laser, um Monomere für konventionelle Fluoreszenz zu begeistern.
    HINWEIS: Verwenden Sie für BODIPY red einen 640II nm Laser, um D II-Zustände für SMLM zu erregen, und einen 561 nm-Laser, um die Monomere für konventionelle Fluoreszenz zu begeistern. Passen Sie für BODIPY red die Laserstärken 561 nm und 640 nm an, um die Massenfluoreszenz im roten Kanal und einzelne Molekülausbrüche im weitroten Kanal zu visualisieren. Die typische Leistung für 561 nm beträgt 0,06 W/cm2 und 5 kW/cm2 für 640 nm. Für BODIPY green erwarten Sie auch konventionelle Fluoreszenz im grünen Emissionskanal unter 561 nm Anregung. Für BODIPY rot, erwarten, dass konventionelle Fluoreszenz im roten Kanal unter 640 nm Anregung zu sehen. Dieses Signal entsteht durch Anti-Stokes-Emission, die für Monomer/Dimer-Co-Lokalisierungsbilder mit kontinuierlicher Laseranregung nützlich wird.

4. Datenerfassung

  1. Laden Sie Laser-Shutter-Sequenzen zur Anregung von Monomeren sowie Dichern.
    HINWEIS: Wir verwenden in der Regel neun einzelne Molekül-Anregungsrahmen bei 561 nm, gefolgt von einem konventionellen Anregungsrahmen bei 488 nm. Dies bietet ein helleres konventionelles Fluoreszenzsignal und vermeidet das Auslaufen weiterer 488 nm erregbarer Fluorophore wie grünes Fluoreszenzprotein (GFP) in den roten Einzelmolekül-Detektionskanal in mehrfarbigen Bildgebungsanwendungen. Alternativ können Sie den 561 nm Laser kontinuierlich einschalten und sich auf die Anti-Stokes-Emission für herkömmliche Bilder im kürzeren Wellenlängenkanal verlassen.
  2. Tune die Laser-Kräfte so, dass einzelne Molekül Fluoreszenz Bursts im rot-versetzten Emissionskanal unter 561 nm Anregung erkannt werden, und konventionelle Fluoreszenz erscheint im grünen Emissionskanal mit 488 nm Anregung. Typische Laserleistungen des 561 nm Lasers werden für SMLM um 0,8-1 kW/cm2 und für den 488 nm Laser im herkömmlichen Fluoreszenz-Bildgebungsmodus um 0,035-0,07 W/cm2 betragen.
  3. Wählen Sie einen Zielordner für Filme aus, und zeichnen Sie 5.000-20.000 Erfassungsframes auf, um genügend Lokalisierungen für die Rekonstruktion von Bildern mit super Auflösung zu sammeln.
  4. Wechseln Sie zu verschiedenen Sichtfeldern, und wiederholen Sie die obigen Schritte, um Daten aus mehr Zellen zu sammeln.

5. Datenanalyse und Einzelmolekül-Tracking

  1. Laden Sie den Film in eine SMLM-Analysesoftware.
    HINWEIS: Jede Software18 kann verwendet werden. Wir verwenden INSIGHT (siehe Tabelle der Materialien) und kreuzvalidieren die Ergebnisse mit dem ThunderSTORM19 Plugin für imageJ (Fidschi).
  2. Den Film visuell abschirmen und Kontrasteinstellungen so anpassen, dass ein-Molekül-Fluoreszenzblinken sichtbar ist. Beschränken Sie bei Bedarf den Bereich oder den Rahmenbereich für die SMLM-Datenanalyse, wenn Teile der Probe kontinuierlich fluoreszieren.
  3. Festlegen von Einzelmolekül-Identifikationsparametern für die Anpassung an 2D Gaussian PSFs (ROI: 7 x 7 Pixel mit Pixelgröße 160 nm, Breite 260-650 nm, Höhe > 50 Photonen). Visuelle Stellbilder durch einige Beispielrahmen, um die Identifikationsparameter zu überprüfen und die unterschiedlichen Fluoreszenzausbrüche eines einzelnen Moleküls zuverlässig zu erkennen (siehe Abbildung 1C).
    HINWEIS: Bestimmte Identifikationsparameter wie Höhe und Breite können leicht angepasst werden, um die Erkennung von visuell wahrgenommenen Fluoreszenzsignalen für einzelne Moleküle zu optimieren.
  4. Führen Sie die SMLM-Bildanalyse mit den optimierten Identifikationsparametern durch und rendern Sie dann jedes einzelne Molekül als 2D-Gaußian, dessen Breite durch die umgekehrte Quadratwurzel der erkannten Anzahl von Photonen gewichtet wird.
  5. Bewerten Sie die Qualität der Daten. Verwenden Sie eingeschränkte Rahmenbereiche, um einzelne Molekülverteilungen in spezifischeren Fällen zu beobachten. Dies kann für Organellenbewegungen während der Datenerfassung verantwortlich sein.
  6. Um die räumliche Verteilung und Dynamik der Molekülverteilungen weiter zu analysieren, exportieren Sie die erhaltene Molekülliste mit den Koordinaten, Rahmen des Aussehens, Photonen, Breiten und Höhen der Lokalisationen. Importieren Sie die Molekülliste in benutzerdefinierten schriftlichen Analyseverfahren.
  7. Um räumliche Informationen über die Verteilung des einzelnen Moleküls zu erhalten, berechnen Sie die radiale Verteilungsfunktion (r), die die Dichte der Lokalisierungen als Funktion des Radialabstands20darstellt. Um die Anzahl der Durchtrennungen zu erhalten, berechnen Sie die eindeutigen paarweisen Abstände aller Lokalisierungen, konstruieren Sie das Histogramm mit Behältern, die bei ri mit der Höhe H(ri)zentriert sind und mit einer Breite dr und dividieren durch 2'ri*dr; ((ri) = H(ri)/(ri+dr)2-ri2). Die radiale Verteilungsfunktion kann dann verwendet werden, um den Cluster-Grad sowie die charakteristische Größe von Clustern zu quantifizieren und zu vergleichen.
  8. Um dynamische Informationen über die Diffusion von Molekülen zu erhalten, verbinden Sie Lokalisierungen, die beispielsweise innerhalb von 3 Pixeln (0,48 m) in aufeinander folgenden Datenerfassungsrahmen auftreten, um einzelne Molekülspuren zu erstellen.
    HINWEIS: Die Verbindungsentfernung hängt von der Diffusion von Molekülen und der Dichte der Lokalisierungen ab. Der maximale Verbindungsabstand kann geschätzt werden, indem die Dichte der Lokalisierungen in jedem Frame21,22analysiert wird. Die durchschnittliche Dichte wurde auf 0,043 Lokalisierungen pro m2festgelegt; So lag ein Radius von 0,48 m innerhalb einer niedrigen Dichte, um sicherzustellen, dass verschiedene Moleküle nicht miteinander verbunden waren.
  9. Durchschnittlich die Verschiebungen für unterschiedliche Verzögerungszeiten von mehreren Spuren, die mindestens drei Verzögerungszeiten dauern, um eine mittlere quadratische Verschiebung (MSD) im Vergleich zu einem Plot zu erzeugen. Passen Sie die MSD-Kurve mit der Gleichung MSD = 4D t +2 an, um den durchschnittlichen Diffusionskoeffizienten D3zu berechnen.

Ergebnisse

Hier stellen wir ein optimiertes Probenvorbereitungs-, Datenerfassungs- und Analyseverfahren für SMLM mit BODIPY-Konjugaten auf der Grundlage des obigen Protokolls vor (Abbildung 1A). Um ein Beispiel für den Workflow zum Erfassen und Analysieren von SMLM-Daten zu veranschaulichen, verwenden wir BODIPY (493/503) in Hefe, um LDs unterhalb der optischen Beugungsgrenze aufzulösen (Abbildung 1B-F). Beispiele für die verschiedenen mehrfarbigen Bil...

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie herkömmliche BODIPY-Konjugate verwendet werden können, um SMLM-Bilder mit einer Größenordnungsverbesserung in der räumlichen Auflösung zu erhalten. Diese Methode basiert auf der Ausnutzung zuvorII gemeldeter, rot verschieber D-II-Zustände herkömmlicher BODIPY-Farbstoffe, die sich vorübergehend durch bimolekulare Begegnungen bilden. Diese Zustände können speziell angeregt und mit rot verschobenen Wellenlängen erkannt werden und sind spärlich und kurzlebig ...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Vergabenummer R21GM127965 unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
BODIPY C12ThermoFisherD3822Green fatty acid analog
BODIPY C12 RedThermoFisherD3835Red fatty acid analog
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922Neutral lipid marker
Concanavalin ASigma-AldrichC2010Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen baseUS BiologicalD9515Amino acids for SCD
DextroseSigma-AldrichG7021Carbon source for SCD
Eight WellCellvisC8-1.58-NChambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek IISigma-AldrichChambered Coverglasses
ET525/50ChromaBandpass filter
ET595/50ChromaBandpass filter
ET610/75ChromaBandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140079Serum
FF652SemrockBeam splitter
FF731/137SemrockBandpass filter
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Cell culture medium
Hal4000Zhuang Lab, Harvard UniversityData acquisition software
Ixon89Ultra DU-897UAndorEMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBISLasers for excitation
Insight3Zhuang Lab, Harvard UniversitySingle molecule localization software
L-GlutamineGibco25030-081Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solutionThermoFisherA14291DJImaging buffer
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonOil immersion objective
Penicillin streptomycinGibco15140-122Antibiotics
Sodium PyruvateGibco11360-070Supplement for cell culture
T562lpxrChromaBeam splitter
Trypsin-EDTAGibco15400-054Dissociation of adherent cell
W303 MATa strainHorizon-DharmaconYSC1058Parental yeast strain
Yeast Nitrogen BaseSigma-AldrichY1250Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdcChromaQuadband dichroic mirror

Referenzen

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