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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para la microscopía de localización de células vivas de una sola molécula (SMLM) a través de la explotación de sus dimers de estado de tierra de formación transitoria y cambio de rojo. Presentamos un protocolo SMLM optimizado para rastrear y resolver lípidos neutros subcelulares y ácidos grasos en mamíferos vivos y células de levadura a escala de longitud nanoscópica.

Resumen

Las técnicas de microscopía de localización de molécula única (SMLM) superan el límite de difracción óptica de la microscopía de fluorescencia convencional y pueden resolver las estructuras intracelulares y la dinámica de las biomoléculas con una precisión de 20 nm. Un requisito previo para SMLM son los fluoróforos que pasan de un estado oscuro a un estado fluorescente para evitar la superposición espacio-temporal de sus funciones de propagación de puntos en cada uno de los miles de marcos de adquisición de datos. Los BODIPYs son tintes bien establecidos con numerosos conjugados utilizados en la microscopía convencional. La formación transitoria de dimers de estado de tierra BODIPY (DII)de cambio rojo da como resultado una emisión brillante de molécula única que permite la microscopía de localización de molécula única (SMLM). Aquí presentamos un protocolo simple pero versátil para SMLM con conjugados BODIPY convencionales en levaduras vivas y células de mamíferos. Este procedimiento se puede utilizar para adquirir imágenes de superresoría y para rastrear estados únicos BODIPY-DII para extraer información espacio-temporal de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimiento para resolver las gotas lipídicas (LD), los ácidos grasos y los lisosomas en las células vivas de levadura y mamíferos en la escala de longitud nanoscópica. Además, demostramos la capacidad de imagen multicolor con tintes BODIPY cuando se utilizan junto con otras sondas fluorescentes. Nuestros resultados representativos muestran la distribución espacial diferencial y la movilidad de los ácidos grasos BODIPY y los lípidos neutros en levaduras en condiciones de alimentación y ayuno. Este protocolo optimizado para SMLM se puede utilizar con cientos de conjugados BODIPY disponibles comercialmente y es un recurso útil para estudiar procesos biológicos a nanoescala mucho más allá de las aplicaciones de este trabajo.

Introducción

Las técnicas de microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de localización fotoactivada (PALM) han surgido como métodos para generar imágenes de superresolución con información más allá del límite de difracción óptica de Abbe1,,2 y para el seguimiento de la dinámica de biomoléculas individuales3,,4. Uno de los requisitos para las sondas compatibles con SMLM es la capacidad de controlar el número de fluoróforos activos en cualquier momento para evitar la superposición espacial de sus funciones de propagación de puntos (PSF). En cada uno de los miles de marcos de adquisición de datos, la ubicación de cada fluoróforos fluorescentes se determina con una precisión de 20 nm ajustando su función de dispersión de puntos correspondiente. Tradicionalmente, el parpadeo de encendido y apagado de los fluoróforos se ha controlado a través de fotointerrupción estocástica1,2,5 o intermitente intrínseco inducido químicamente6. Otros enfoques incluyen la activación inducida de fluorógenos en la unión transitoria a una proteína activadora de fluorógeno7,8 y la unión programable-unión-desvinculación de oligómeros de ADN etiquetados en fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o excitación de lámina de luz9. Recientemente, informamos de una novedosa y versátil estrategia de etiquetado para SMLM10 en la que previamente se informaba de dimeric de cambio en rojo (DII)estados de conjugados convencionales de boro di-pirametano (BODIPY)11,12,13 se forman transitoriamente y se excitan específicamente y se detectan con longitudes de onda cambiadas en rojo.

Los BODIPYs son tintes ampliamente utilizados con cientos de variantes que etiquetan específicamente compartimentos subcelulares y biomoléculas14,,15,,16. Debido a su facilidad de uso y aplicabilidad en células vivas, las variantes BODIPY están disponibles comercialmente para la microscopía de fluorescencia convencional. Aquí, describimos un protocolo detallado y optimizado sobre cómo los cientos de conjugados BODIPY disponibles comercialmente se pueden utilizar para SMLM de células vivas. Al ajustar la concentración de monómeros BODIPY y al optimizar los poderes del láser de excitación, los parámetros de diagnóstico por imágenes y datos, se obtienen imágenes de alta calidad de superresolución y datos de seguimiento de moléculas únicas en células vivas. Cuando se utilizan a baja concentración (25-100 nM), los conjugados BODIPY se pueden utilizar simultáneamente para SMLM en el canal de cambio rojo y para la microscopía de fluorescencia convencional correlativa en el canal de emisión convencional. Los datos obtenidos de una sola molécula se pueden analizar para cuantificar la organización espacial de las estructuras inmóviles y extraer los estados difusos de las moléculas en las células vivas17. La disponibilidad de sondas BODIPY en formas verdes y rojas permite obtener imágenes multicolor cuando se utilizan en la combinación correcta con otros fluoróforos compatibles.

En este informe, proporcionamos un protocolo optimizado para adquirir y analizar datos SMLM de células vivas utilizando BODIPY-C12,BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rojo y lysotracker-green en múltiples colores. Resolvemos ácidos grasos y lípidos neutros en levaduras vivas y células de mamíferos con una resolución de 30 nm. Además, demostramos que las células de levadura regulan la distribución espacial de los ácidos grasos añadidos externamente dependiendo de su estado metabólico. Encontramos que los ácidos grasos BODIPY añadidos (FA) se localizan en el retículo endoplasmático (ER) y las gotas de lípidos (LD) en condiciones de alimentación, mientras que BODIPY-FAs forman racimos no LD en la membrana plasmática al en ayunar. Ampliamos aún más la aplicación de esta técnica para tomar imágenes de lisosomas y LDs en células de mamíferos vivos. Nuestro protocolo optimizado para SMLM utilizando conjugados BODIPY convencionales puede ser un recurso útil para estudiar los procesos biológicos a nanoescala con los innumerables conjugados BODIPY disponibles.

Protocolo

NOTA: Para la clonación de levadura y el etiquetado endógeno, consulte nuestra reciente publicación10.

1. Preparación de muestras de células de levadura para imágenes

  1. Preparar un cultivo líquido durante la noche de una cepa de levadura w303. Usando un palo de madera estéril, detecte una pequeña cantidad de células de levadura de una placa de agar que contiene extracto de levadura–peptona-dextrosa en un tubo de cultivo con 2 ml de dextrosa completa sintética (SCD) mediana. Incubar el tubo durante la noche en una incubadora de agitación a 270 rpm y 30oC.
  2. Realice una dilución de 1:50 por la mañana de las células en SCD. Continúe cultivando las células diluidas durante 4 h a 30 oC en una incubadora de agitación de 270 rpm, permitiendo que las células crezcan en fase exponencial y alcancen una densidad óptica (OD) de 0,6 euros.
    NOTA: El procedimiento puede variar aquí dependiendo del estado metabólico que se esté estudiando. Los conjugados BODIPY no requieren células en la fase de crecimiento exponencial. Sin embargo, ser consciente de la autofluorescencia de las células muertas durante la fase estacionaria, ya que puede causar una señal de fondo demasiado fuerte para analizar los emisores BODIPY-DII individuales.
  3. Para estudiar las células en ayunas, hacer crecer el cultivo de levadura durante 2 días sin intercambio de medios.
  4. A 30 min antes de encollar las células, incubar una cubierta de cámara con 80 ml de 0,8 mg/ml estéril de Concanavalina A (ConA) en H2O desionizado a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lave el vaso de la cubierta tres veces con H2O desionizado.
  5. A 30 minutos antes de la toma de imágenes, pipetee las celdas de la cubierta de cámara, con el volumen correcto de SCD fresco para lograr una densidad óptica de 0,12 euros (normalmente 60 l de cultivo de levadura a OD a 0,6 en SCD de 240 l). Deje que las células se asienten y se adhieran a la superficie de ConA durante 30 min.
  6. Añadir el conjugado BODIPY deseado directamente a la cubierta de cámara a una concentración final de 100 nM.
    NOTA: Es posible que se requiera un experimento de optimización de la concentración de BODIPY dependiendo de la densidad local de BODIPYs en un compartimiento celular determinado.

2. Preparación de células de mamíferos para imágenes SMLM

  1. Mantener las células U2OS de mamíferos en DMEM no fluorescente con 10% de suero bovino fetal, 4 mM de glutamina, 1 mM de piruvato sódico y 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina en un matraz T25.
    NOTA: Las células también se pueden mantener en DMEM con un 10% de suero bovino fetal y un 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina, sin embargo, el medio debe intercambiarse antes de tomar imágenes con una solución no autofluorescente.
  2. Dividir las células en 70-80% confluencia 1:5 en un solo pozo de una placa de 8 pozos. Cultivo de las células en la placa de 8 pozos durante 12 a 24 h antes de la toma de imágenes.
  3. Añadir BODIPY-C12, LysoTracker Green o cualquier otro conjugado BODIPY a una concentración final de 100 nM (soluciones de stock en dimetil sulfóxido [DMSO]) 10 min antes de la toma de imágenes. Este tiempo puede variar en función del experimento deseado.
    NOTA: Las imágenes se pueden realizar a temperatura ambiente (23 oC) utilizando una solución de imágenes de células vivas. Sin embargo, se prefiere tomar imágenes a 37oC y 5% deCO2 con DMEM no fluorescente mezclado con 10% de suero bovino fetal, 4 mM de glutamina, 1 mM de piruvato sódico y 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina para mantener las células más cerca de las condiciones fisiológicas y sacar conclusiones biológicas.

3. Preparación del equipo

  1. Monte los conjuntos de filtros apropiados en la ruta de emisión en función del color de emisión de BODIPY que se esté utilizando.
    NOTA: Un espejo dicroico de cuatro bandas (zt/405/488/561/640rdc) separa primero la excitación de la luz de emisión. La emisión verde (525 nm) y la emisión roja (595 nm) se dividen por un divisor de haz de paso largo dicroico (T562lpxr) seguido de filtros de paso de banda ET525/50 en el canal verde y ET 595/50 en el canal rojo. Los dos canales se proyectan a diferentes áreas del mismo chip de cámara. Del mismo modo, la emisión roja (595 nm) y la emisión de rojo lejano se dividen primero por un divisor de haz de paso largo dicroico (FF652-Di01) seguido de filtros de paso de banda ET 610/75 en el rojo y FF731/137 en el canal rojo.
  2. Encienda el microscopio, la etapa del microscopio, los láseres (488 nm, 561 nm) y la cámara. Aquí se utiliza un microscopio invertido con un sistema de enfoque perfecto y una cámara EMCCD refrigerada a -68 oC.
  3. Añadir una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio.
  4. Abra el software Hal4000 (consulte la Tabla de materiales)que controla la luz LED para obtener imágenes de campo brillante, potencias láser, persianas láser y ajustes de cámara para imágenes. Establezca la ganancia de EMCCD en 30 y la temperatura de la cámara en -68 oC. Prepare la cámara y el software correspondiente para grabar películas a 20 Hz.
    NOTA: Esta técnica se aplica a cualquier microscopio de campo ancho capaz de microscopía de localización fotoactivada (PALM) y imágenes de microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM). El software correspondiente puede variar.
  5. Encienda el calentador de etapa del microscopio y colócalo a una temperatura de 37oC y a un nivel de CO2 del 5%. Ajuste el collar de corrección objetiva en consecuencia.
  6. Monte la muestra en la etapa del microscopio y concéntrese hasta que el sistema de enfoque se enganche. Mueva el escenario con el controlador de etapa hasta que aparezcan celdas sanas en el campo de visión.
    NOTA: Para la toma de imágenes con células de levadura a temperatura ambiente, no es necesario encender el calentador ni el control deCO2.
  7. Encienda los láseres apropiados para la excitación de monómeros, así como dimers. Para el verde BODIPY o el verde LysoTracker, utilizamos un láser de 561 nm para excitar los estados DII para SMLM y un láser de 488 nm para excitar monómeros para la fluorescencia convencional.
    NOTA: Para el rojo BODIPY, utilice un láser de 640 nm para excitar los estados DII para SMLM y un láser de 561 nm para excitar los monómeros para la fluorescencia convencional. Para el rojo BODIPY, ajuste las potencias láser de 561 nm y 640 nm para visualizar la fluorescencia a granel en el canal rojo y las ráfagas de molécula única en el canal rojo. La potencia típica para 561 nm es de 0,06 W/cm2 y 5 kW/cm2 para 640 nm. Para el verde BODIPY, espere también ver fluorescencia convencional en el canal de emisión verde bajo 561 nm de excitación. Para el rojo BODIPY, espere ver fluorescencia convencional en el canal rojo bajo excitación de 640 nm. Esta señal surge de la emisión anti-Stokes, que se convierte en útil para las imágenes de co-localización monomer/dimer con excitación láser continua.

4. Adquisición de datos

  1. Cargue secuencias de obturación láser para la excitación de monómeros, así como dimers.
    NOTA: Normalmente utilizamos nueve marcos de excitación de molécula única a 561 nm seguidos de un marco de excitación convencional a 488 nm. Esto ofrece una señal de fluorescencia convencional más brillante y evita la fuga de otro fluoróforo excitable de 488 nm, como la proteína fluorescente verde (GFP) en el canal rojo de detección de una sola molécula en aplicaciones de imágenes multicolor. Alternativamente, encienda el láser de 561 nm continuamente y confíe en la emisión anti-Stokes para imágenes convencionales en el canal de longitud de onda más corto.
  2. Sintonice las potencias láser de tal manera que las ráfagas de fluorescencia de molécula única se detecten en el canal de emisión desplazado en rojo bajo 561 nm de excitación, y la fluorescencia convencional aparece en el canal de emisión verde con 488 nm de excitación. Las potencias láser típicas del láser de 561 nm serán de alrededor de 0,8-1 kW/cm2 para SMLM, y de 0,035-0,07 W/cm2 para el láser de 488 nm en el modo de imagen de fluorescencia convencional.
  3. Elija una carpeta de destino para películas y grabe entre 5.000 y 20.000 marcos de adquisición para recopilar suficientes localizaciones para reconstruir imágenes de superresoría.
  4. Muévase a diferentes campos de visión y repita los pasos anteriores para recopilar datos de más celdas.

5. Análisis de datos y seguimiento de una sola molécula

  1. Cargue la película en un software de análisis SMLM.
    NOTA: Se puede utilizar cualquier software18. Utilizamos INSIGHT (ver la Tabla de Materiales)y validamos los resultados usando el plugin ThunderSTORM19 para imageJ (Fiji).
  2. Visualmente visualmente la película y ajuste los ajustes de contraste de modo que la fluorescencia de una sola molécula parpadee es visible. Si es necesario, restrinja la región o el rango de tramas para el análisis de datos SMLM si partes de la muestra son continuamente fluorescentes.
  3. Establezca parámetros de identificación de molécula única para el ajuste con PSF gaussianos 2D (ROI: 7 x 7 píxeles con tamaño de píxel 160 nm, ancho 260-650 nm, altura > 50 fotones). Visualmente visualmente a través de algunos marcos de ejemplo para comprobar los parámetros de identificación y detectar de forma fiable las distintas ráfagas de fluorescencia de molécula única (ver Figura 1C).
    NOTA: Ciertos parámetros de identificación, como la altura y la anchura, se pueden ajustar ligeramente para optimizar el reconocimiento de las señales de fluorescencia de molécula única percibidas visualmente.
  4. Realice el análisis de imágenes SMLM con los parámetros de identificación optimizados y, a continuación, represente cada molécula como un gaussiano 2D cuya anchura se pondera por la raíz cuadrada inversa del número detectado de fotones.
  5. Evaluar la calidad de los datos. Utilice rangos de trama restringidos para observar distribuciones de moléculas individuales en casos más específicos en el tiempo. Esto puede explicar el movimiento del organel durante la adquisición de datos.
  6. Para analizar más a fondo la distribución espacial y la dinámica de las distribuciones de moléculas, exporte la lista de moléculas obtenidas que contiene las coordenadas, marcos de apariencia, fotones, anchuras y alturas de las localizaciones. Importe la lista de moléculas en procedimientos de análisis escritos personalizados.
  7. Para obtener información espacial de la distribución de molécula única, calcule la función de distribución radial (r), que representa la densidad de las localizaciones en función de la distancia radial20. Para obtener las distancias únicas de todas las localizaciones, construya el histograma con bins centrados en ri con la altura H(ri) y con un ancho dr y divida por 2ori*dr; ((ri) á H(ri)/a(ri+dr)2-ri2). A continuación, se puede utilizar la función de distribución radial para cuantificar y comparar el grado de agrupación en clústeres, así como el tamaño característico de los clústeres.
  8. Para obtener información dinámica sobre la difusión de moléculas, vincule las localizaciones que aparecen, por ejemplo, dentro de 3 píxeles (0,48 m) en marcos de adquisición de datos consecutivos para crear trazas de moléculas únicas.
    NOTA: La distancia de enlace dependerá de la difusión de moléculas y de la densidad de localizaciones. La distancia máxima de enlace se puede estimar analizando la densidad de las localizaciones en cada fotograma21,,22. Se determinó que la densidad media era de 0,043 localizaciones porm 2; por lo tanto, un radio de 0,48 m estaba dentro de una densidad lo suficientemente baja como para garantizar que las diferentes moléculas no estuvieran unidas entre sí.
  9. Promediar los desplazamientos para diferentes tiempos de retraso a partir de múltiples trazas que duran al menos tres tiempos de retraso para crear un desplazamiento cuadrado medio (MSD) frente a la gráfica. Ajuste la curva MSD frente a la de T con la ecuación MSD a 4D - t +2 para calcular el coeficiente medio de difusión D3.

Resultados

Aquí, presentamos un procedimiento optimizado de preparación, adquisición y análisis de muestras para SMLM utilizando conjugados BODIPY basados en el protocolo anterior (Figura 1A). Para demostrar un ejemplo del flujo de trabajo para adquirir y analizar datos SMLM, empleamos BODIPY (493/503) en levadura para resolver LDs por debajo del límite de difracción óptica (Figura 1B-F). Ejemplos de los diferentes modos de imagen multicolor de BODI...

Discusión

En este protocolo, demostramos cómo los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para obtener imágenes SMLM con una mejora del orden de magnitud en la resolución espacial. Este método se basa en la explotación de los estados DII previamente reportados y desplazados en rojo de los tintes BODIPY convencionales, que se forman transitoriamente a través de encuentros bimolemosos. Estos estados pueden ser específicamente excitados y detectados con longitudes de onda cambiadas en rojo y son lo sufic...

Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R21GM127965.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
BODIPY C12ThermoFisherD3822Green fatty acid analog
BODIPY C12 RedThermoFisherD3835Red fatty acid analog
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922Neutral lipid marker
Concanavalin ASigma-AldrichC2010Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen baseUS BiologicalD9515Amino acids for SCD
DextroseSigma-AldrichG7021Carbon source for SCD
Eight WellCellvisC8-1.58-NChambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek IISigma-AldrichChambered Coverglasses
ET525/50ChromaBandpass filter
ET595/50ChromaBandpass filter
ET610/75ChromaBandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140079Serum
FF652SemrockBeam splitter
FF731/137SemrockBandpass filter
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Cell culture medium
Hal4000Zhuang Lab, Harvard UniversityData acquisition software
Ixon89Ultra DU-897UAndorEMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBISLasers for excitation
Insight3Zhuang Lab, Harvard UniversitySingle molecule localization software
L-GlutamineGibco25030-081Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solutionThermoFisherA14291DJImaging buffer
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonOil immersion objective
Penicillin streptomycinGibco15140-122Antibiotics
Sodium PyruvateGibco11360-070Supplement for cell culture
T562lpxrChromaBeam splitter
Trypsin-EDTAGibco15400-054Dissociation of adherent cell
W303 MATa strainHorizon-DharmaconYSC1058Parental yeast strain
Yeast Nitrogen BaseSigma-AldrichY1250Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdcChromaQuadband dichroic mirror

Referencias

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