АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Обычные конъюги BODIPY могут быть использованы для живой-клеточной одномолекулярной микроскопии локализации (SMLM) путем эксплуатации их преходящее, красно-сдвигаемых стриеров земли. Мы представляем оптимизированный протокол SMLM для отслеживания и разрешения субклеточных нейтральных липидов и жирных кислот в живых клетках млекопитающих и дрожжей в наноскопической шкале длины.

Аннотация

Методы локализации одной молекулы (SMLM) преодолевают оптический предел дифракции обычной флуоресценционной микроскопии и могут разрешать внутриклеточные структуры и динамику биомолекул с точностью 20 нм. Предпосылкой для SMLM являются флюорофоры, которые переходят из темного в флуоресцентное состояние, чтобы избежать пространственно-временного перекрытия их функций точечного распространения в каждом из тысяч кадров для сбора данных. BODIPYs являются устоявшимися красителями с многочисленными конъюгами, используемыми в обычной микроскопии. Переходное образование красно-сдвигающихся димеров НАИППи (DII)приводит к яркому выбросу одной молекулы, позволяющему микроскопию локализации одной молекулы (SMLM). Здесь мы представляем простой, но универсальный протокол для SMLM с обычными спариями BODIPY в живых дрожжах и клетках млекопитающих. Эта процедура может быть использована для получения изображений супер-разрешения и для отслеживания одного состояния BODIPY-DII для извлечения пространственно-временной информации конъюгированных BODIPY. Мы применяем эту процедуру для разрешения липидных капель (ЛД), жирных кислот и лисосомы в живых дрожжах и клетках млекопитающих в наноскопической шкале длины. Кроме того, мы демонстрируем возможность многоцветной визуализации с красителями BODIPY при использовании в сочетании с другими флуоресцентными зондами. Наши репрезентативные результаты показывают дифференциальное пространственное распределение и подвижность БОДИПИ-жирных кислот и нейтральных липидов в дрожжах в условиях кормления и поста. Этот оптимизированный протокол для SMLM может быть использован с сотнями коммерчески доступных конъюгатов BODIPY и является полезным ресурсом для изучения биологических процессов на наноуровне, далеко за пределами применения этой работы.

Введение

Одномолекулярная локализация микроскопии (SMLM) методы, такие как стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) и фото-активированной локализации микроскопии (PALM) появились как методы для генерации супер-разрешение изображения с информацией за пределами оптического дифракции Абба предел1,2 и для отслеживания динамики отдельных биомолекул3,4. Одним из требований к зондам, совместимым с SMLM, является возможность контролировать количество активных фторфоров в любое время, чтобы избежать пространственного перекрытия их функций точечного распространения (PSF). В каждом из тысяч кадров для сбора данных местоположение каждого флуоресцентного флуорофора определяется с точностью 20 нм, устанавливая соответствующую функцию точечного распространения. Традиционно, выключенное мигание фторофоров было контролироваться через стохастические фотопереключения1,,2,,5 или химически индуцированного внутреннего мигает6. Другие подходы включают индуцированной активации флюорогенов при переходных связывания с флюорогеновым активированием белка7,,8 и программируемой связывания-несвязывающей помеченных олигомеров ДНК в общей внутренней флуоресценции отражения (TIRF) или возбуждения светового листа9. Недавно мы сообщили о новой и универсальной стратегии маркировки для SMLM10, в которой ранее сообщалось красно-сдвиной димерической (DII) состояния обычных бор ди-пирометан (BODIPY) конъюгирует11,12,13являются специально возбужденных и обнаружены с красными сдвинутых волн.13

BODIPYs широко используются красители с сотнями вариантов, которые специально этикетки субклеточных отсеков и биомолекул14,15,16. Из-за их простоты использования и применимости в живых клетках, варианты BODIPY коммерчески доступны для обычной флуоресценции микроскопии. Здесь мы описываем подробный и оптимизированный протокол о том, как сотни коммерчески доступных конъюгатов BODIPY могут быть использованы для живых ячеек SMLM. Путем настройки концентрации мономеров BODIPY и оптимизации лазерных функций возбуждения, параметров визуализации и анализа данных, в живых клетках получаются высококачественные изображения суперразрешения и данные слежения за одной молекулой. При использовании при низкой концентрации (25-100 нм), конъюгированные bodiPY могут быть одновременно использованы для SMLM в красно-сдвигаемканале и для корреляционной обычной флуоресценции микроскопии в обычном канале выбросов. Полученные данные одной молекулы могут быть проанализированы для количественной оценки пространственной организации неподвижных структур и извлечения диффузивных состояний молекул в живых клетках17. Наличие зондов BODIPY в зеленых и красных формах позволяет использовать многоцветные изображения при правильном сочетании с другими совместимыми флюорофорами.

В этом отчете мы предоставляем оптимизированный протокол для получения и анализа данных SMLM с живыми ячейками с использованием BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 красного и lysotracker-зеленого цвета в нескольких цветах. Мы разрешаем жирные кислоты и нейтральные липиды в живых дрожжах и клетках млекопитающих с разрешением 30 нм. Мы также демонстрируем, что дрожжевые клетки регулируют пространственное распределение внешних жирных кислот в зависимости от их метаболического состояния. Мы находим, что добавленные БОДИПИ-жирные кислоты (FA) локализуются в эндоплазмический ретикулум (ER) и липидные капли (ЛД) в условиях fed, в то время как BODIPY-FAs образуют не-LD кластеры в плазменной мембране после поста. Мы также расширяем применение этого метода для изображения лизосомы и LDs в живых клетках млекопитающих. Наш оптимизированный протокол для SMLM с использованием обычных конъюгетов BODIPY может быть полезным ресурсом для изучения биологических процессов на наноуровне с множеством доступных конъюги BODIPY.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Для клонирования дрожжей и эндогенных пометок пожалуйста, обратитесь к нашей недавней публикации10.

1. Подготовка образцов дрожжевых клеток для визуализации

  1. Подготовьте жидкую ночную культуру штамма дрожжей w303. Используя стерильную деревянную палочку, пятно небольшое количество дрожжевых клеток из агар пластины, содержащей дрожжевой экстракт-пептон-декстрозя в культуре трубки с 2 мл синтетических полной декстроза (SCD) среды. Инкубировать трубку на ночь в трясущихся инкубатора при 270 об/мин и 30 градусов по Цельсию.
  2. Выполните 1:50 утреннее разбавление клеток в SCD. Продолжить культуру разбавленных клеток в течение 4 ч при 30 градусах По Цельсия в 270 об/мин встряхивания инкубатора, что позволяет клеткам расти в экспоненциальной фазе и достичь оптической плотности (OD) в 0,6 евро.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может варьироваться здесь в зависимости от того, какое метаболическое состояние изучается. Спряжные клетки BODIPY не требуют клеток в фазе экспоненциального роста. Однако, будьте осведомлены об аутофлооресценции из мертвых клеток во время стационарной фазы, так как это может привести к фоновому сигналу слишком сильным, чтобы анализировать одиночные излучатели BODIPY-DII.
  3. Для изучения клеток натощак, расти дрожжевой культуры в течение 2 дней без обмена средствами массовой информации.
  4. На 30 минут до покрытия клеток, инкубировать камерные крышки с 80 мг /мл стерильного Конкановалина А (ConA) в деионизированных H2O при комнатной температуре. После 30 минут, мыть крышку три раза с деионизированной H2O.
  5. На 30 минут до изображения, pipette клетки на камерной крышкой, с правильным объемом свежего SCD для достижения оптической плотности 0,12 (как правило, 60 йл дрожжевой культуры на OD 0,6 в 240 Л SCD). Пусть клетки оседают и придерживаются поверхности ConA в течение 30 минут.
  6. Добавьте желаемый BODIPY конъюгировать сяплет прямо в камерный покрывало при окончательной концентрации в 100 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент по оптимизации концентрации BODIPY может потребоваться в зависимости от плотности местной плотности BODIPYs в конкретном клеточном отсеке.

2. Подготовка клеток млекопитающих для визуализации SMLM

  1. Поддержание клеток U2OS млекопитающих в нефлуоресцентных DMEM с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки, 4 мм глутамина, 1 мм натрия пируват и 1% пенициллина-стрептомицина антибиотиков в t25 колбу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки также могут быть сохранены в DMEM с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицин антибиотики, однако, среда должна быть обменяна до изображения с не-автофлуоресцентного раствора.
  2. Разделите клетки на 70-80% встою 1:5 в одном колодце 8-колодца пластины. Культура клетки в 8-колодец пластины от 12 до 24 ч до изображения.
  3. Добавьте BODIPY-C12, LysoTracker Green или любой другой bodiPY конъюгированный при конечной концентрации 100 нм (запасные растворы в диметилсульфодоксидах »DMSO) 10 мин до изображения. Это время может варьироваться в зависимости от желаемого эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация может быть выполнена при температуре окружающей среды (23 градусов по Цельсию) с помощью решения живой визуализации клеток. Тем не менее, визуализация при 37 КК и 5% CO2 с нелюфлуоресцентными DMEM, смешанными с 10% сыворотки плода, 4 мМ глутамина, 1 мМ пируватом натрия и 1% антибиотиками пенициллин-стрептомицин предпочтительнее держать клетки ближе к физиологическим условиям и делать биологические выводы.

3. Подготовка оборудования

  1. Установите соответствующие наборы фильтров в пути выбросов на основе цвета выбросов BODIPY используется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Четырехполосное дихроическое зеркало (zt/405/488/561/640rdc) сначала отделяет возбуждение от света выбросов. Зеленый выброс (525 нм) и красные выбросы (595 нм) затем делятся на дихротический сплиттер длиннопроходного луча (T562lpxr), а затем фильтры диапазона ET525/50 в зеленом канале и ET 595/50 в красном канале. Затем эти два канала проецируются на различные области одного и того же чипа камеры. Аналогичным образом, красный излучение (595 нм) и дальнекрасный излучение сначала делятся на дихротический сплиттер длиннопроходного луча (FF652-Di01), за которым следуют фильтры диапазона ET 610/75 в красном и FF731/137 в дальнем красном канале.
  2. Включите микроскоп, стадию микроскопа, лазеры (488 нм, 561 нм) и камеру. Здесь используется перевернутый микроскоп с идеальной системой фокусировки и камерой EMCCD, охлажденая до -68 градусов по Цельсию.
  3. Добавьте каплю масла погружения на цель микроскопа.
  4. Откройте программное обеспечение Hal4000 (см. таблицу материалов), которое управляет светодиодным светом для яркой полевой визуализации, лазерных мощностей, лазерных ставней и настроек камеры для визуализации. Установите увеличение EMCCD до 30, а температура камеры до -68 градусов по Цельсию. Подготовьте камеру и соответствующее программное обеспечение для записи фильмов на уровне 20 Гц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применяется к любому широкоугольному микроскопу, способенму микроскопии локальной локализации (PALM) и стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM). Соответствующее программное обеспечение может варьироваться.
  5. Включите обогреватель стадии микроскопа и установите его до температуры 37 градусов по Цельсию и до уровня CO2 5%. Отрегулируйте объективную коррекцию воротник ат... соответственно.
  6. Установите образец на стадии микроскопа и сосредоточьтесь до тех пор, пока не займется фокусировка системы. Переместите сцену с помощью контроллера сцены до тех пор, пока в поле зрения не появятся здоровые ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации с дрожжевыми клетками при комнатной температуре, нет необходимости включать обогреватель или CO2 управления.
  7. Включите соответствующие лазеры для возбуждения мономеров, а также димеров. Для BODIPY зеленый или LysoTracker зеленый, мы используем 561 нм лазер для возбуждения DII государств для SMLM и 488 нм лазер возбудить мономеров для обычной флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для BODIPY красный, используйте 640 нм лазер для возбуждения DII государств для SMLM и 561 нм лазер, чтобы возбудить мономеров для обычной флуоресценции. Для BODIPY красный, настроить 561 нм и 640 нм лазерные полномочия для визуализации объемной флуоресценции в красном канале и одной молекулы очередей в дальнем красном канале. Типичная мощность для 561 нм составляет 0,06 Вт/см2 и 5 кВт/см2 для 640 нм. Для BODIPY зеленый, ожидать, чтобы также увидеть обычные флуоресценции в зеленом канале выбросов под 561 нм возбуждение. Для BODIPY красный, ожидать увидеть обычные флуоресценции в красном канале под 640 нм возбуждение. Этот сигнал возникает из-за выброса против Стокоса, который становится полезным для мономерных/димерных изображений совместной локализации с непрерывным лазерным возбуждением.

4. Приобретение данных

  1. Загрузите лазерные последовательности затвора для возбуждения мономеров, а также димеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используем девять одной молекулы возбуждения кадров на 561 нм следуют один обычный эксцитации кадра на 488 нм. Это предлагает более яркий обычный сигнал флуоресценции и позволяет избежать утечки еще 488 нм возбудимых флюорофоров, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) в красный одномолекулярный канал обнаружения в многоцветных приложений изображений. Кроме того, включите 561 нм лазер непрерывно и полагаться на анти-Стокс выбросов для обычных изображений в короткой длины волны канала.
  2. Настройте лазерные силы таким образом, что одиночные молекулы флуоресценции очередей обнаруживаются в красно-сдвинутых канала выбросов под 561 нм возбуждение, и обычные флуоресценции появляется в зеленом канале выбросов с 488 нм возбуждение. Типичные лазерные мощности лазера 561 нм будут составят около 0,8-1 кВт/см2 для SMLM и 0,035-0,07 Вт/см2 для лазера 488 нм в обычном режиме флуоресценции.
  3. Выберите папку назначения для фильмов и запишите 5000-20 000 кадров для приобретения, чтобы собрать достаточное количество локализаций для восстановления изображений супер-разрешения.
  4. Перейдите к различным полям зрения и повторите вышеприведенные шаги для сбора данных из большего числа ячеек.

5. Анализ данных и одномолекулярное отслеживание

  1. Загрузите фильм в программное обеспечение для анализа SMLM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любое программное обеспечение18 может быть использовано. Мы используем INSIGHT (см. Таблицу Материалов)и перепроверяем результаты с помощью плагина ThunderSTORM19 для imageJ (Фиджи).
  2. Визуально экранируйте фильм и настраивайте настройки контрастности таким образом, чтобы одномолекулярная флуоресценция мигает. При необходимости ограничьте область или диапазон кадров для анализа данных SMLM, если части образца непрерывно флуоресцентируются.
  3. Установите параметры идентификации одной молекулы для установки с 2D гауссианскими PSFs (ROI: 7 x 7 пикселей с размером пикселя 160 нм, шириной 260-650 нм, высотой йgt; 50 фотонов). Визуально экран через некоторые примеры кадры, чтобы проверить параметры идентификации и надежно обнаружить различные одной молекулы флуоресценции очередей (см. Рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые параметры идентификации, такие как высота и ширина могут быть слегка скорректированы для оптимизации распознавания визуально воспринимаемых сигналов флуоресценции одной молекулы.
  4. Выполните анализ изображений SMLM с оптимизированными параметрами идентификации, а затем сделать каждую одну молекулу 2D гауссианской, ширина которой взвешена обратным квадратным корнем обнаруженного количества фотонов.
  5. Оцените качество данных. Используйте ограниченные диапазоны кадров для наблюдения за распределением одной молекулы в более конкретных случаях во времени. Это может объяснить движение органелл ы при получении данных.
  6. Для дальнейшего анализа пространственного распределения и динамики распределения молекул, экспортировать полученный список молекул, содержащий координаты, рамки внешнего вида, фотоны, ширину и высоту локализаций. Импорт молекулы список в пользовательских письменных процедур анализа.
  7. Для получения пространственной информации о распределении одной молекулы вычислите функцию радиального распределения, которая представляет плотность локализаций как функцию радиального расстояния20. Чтобы получить q(r), рассчитать уникальные парные расстояния всех локализаций, построить гистограмму с бункерами по центру ri с высотой H (ri) и с шириной д-р и разделить на 2'rяdr; (В(ri) - H (ri)/) (riqdr)2-ri2). Функция радиального распределения может быть использована для количественной оценки и сравнения степени кластеризации, а также характерного размера кластеров.
  8. Чтобы получить динамическую информацию о диффузии молекул, свяжите локализации, которые появляются, например, в пределах 3 пикселей (0,48 мкм) в последовательных кадрах сбора данных для создания единичных следов молекул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние соединения будет зависеть от диффузии молекул и плотности локализаций. Максимальное расстояние связующего можно оценить, проанализировав плотность локализаций в каждом кадре21,,22. Средняя плотность была определена в 0,043 локализации на мкм2; таким образом, радиус 0,48 мкм находился в достаточно низкой плотности, чтобы гарантировать, что различные молекулы не были связаны друг с другом.
  9. Среднее смещение для разных времен задержки от нескольких следов продолжительностью не менее трех раз, чтобы создать среднее смещение в квадрате (MSD) по сравнению с сюжетом. Приспособитесь к кривой MSD против qt с уравнением MSD No 4D-t2 для расчета среднего коэффициента диффузии D3.

Результаты

Здесь мы представляем оптимизированную подготовку образца, процедуру сбора и анализа данных для SMLM с использованием конъюги для BODIPY на основе вышеуказанного протокола(рисунок 1A). Чтобы продемонстрировать пример рабочего процесса для получения и анализа данных SMLM, мы и...

Обсуждение

В этом протоколе мы продемонстрировали, как обычные конъюгированные BODIPY могут быть использованы для получения изображений SMLM с улучшением пространственного разрешения на порядок. Этот метод основан на использовании ранее сообщалось, красно-сдвинутые DII состояния обычных краси?...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.

Благодарности

Исследование, о проислизировавее в этой публикации, было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии R21GM127965.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BODIPY C12ThermoFisherD3822Green fatty acid analog
BODIPY C12 RedThermoFisherD3835Red fatty acid analog
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922Neutral lipid marker
Concanavalin ASigma-AldrichC2010Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen baseUS BiologicalD9515Amino acids for SCD
DextroseSigma-AldrichG7021Carbon source for SCD
Eight WellCellvisC8-1.58-NChambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek IISigma-AldrichChambered Coverglasses
ET525/50ChromaBandpass filter
ET595/50ChromaBandpass filter
ET610/75ChromaBandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140079Serum
FF652SemrockBeam splitter
FF731/137SemrockBandpass filter
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Cell culture medium
Hal4000Zhuang Lab, Harvard UniversityData acquisition software
Ixon89Ultra DU-897UAndorEMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBISLasers for excitation
Insight3Zhuang Lab, Harvard UniversitySingle molecule localization software
L-GlutamineGibco25030-081Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solutionThermoFisherA14291DJImaging buffer
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonOil immersion objective
Penicillin streptomycinGibco15140-122Antibiotics
Sodium PyruvateGibco11360-070Supplement for cell culture
T562lpxrChromaBeam splitter
Trypsin-EDTAGibco15400-054Dissociation of adherent cell
W303 MATa strainHorizon-DharmaconYSC1058Parental yeast strain
Yeast Nitrogen BaseSigma-AldrichY1250Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdcChromaQuadband dichroic mirror

Ссылки

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

160BODIPY

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены