Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن وصف مفصلة واستنساخ تدفق العلاج الخلوي بروتوكول لتحديد أحادية / الضامة والخلايا التائية باستخدام كل من خارج وداخل الخلايا تلطخ المقايسات داخل الطحال مورين، نخاع العظام، والعقد الليمفاوية والأنسجة الزليلي، وذلك باستخدام نموذج جراحية راسخة من هشاشة العظام.

Abstract

هشاشة العظام (OA) هي واحدة من أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا، مما يؤثر على المرضى الذين يعانون من الألم والقيود الجسدية. وتشير الأدلة الحديثة إلى وجود عنصر التهابي محتمل للمرض، مع احتمال ارتباط كل من الخلايا التائية والخلايا أحادية الخلايا/الضامة بتولدات المرض من الزراعة العضوية. وقد افترضت دراسات أخرى دوراً هاماً لكل من مجموعات فرعية من أنساب الخلايا الالتهابية، مثل Th1 وTh2 وTh17 و T-تنظيمية لللمفيات، و M1 و M2 و الضامة السينوفية للأنسجة المقيمة. ومع ذلك، فإن التفاعل بين الاستجابة الخلوية الالتهابية المحلية والنظامية والتغيرات الهيكلية في المفصل غير معروف. لفهم كامل كيف تي الخلايا monocytes / الضامة تسهم في الزراعة العضوية، من المهم أن تكون قادرة على تحديد كمي هذه الخلايا و المجموعات الفرعية الخاصة بهم في وقت واحد في الأنسجة الزليلي، والأعضاء اللمفاوية الثانوية وبشكل نظامي (الطحال ونخاع العظام). في الوقت الحاضر، يمكن تحديد المجموعات الفرعية الخلية الالتهابية المختلفة من خلال مزيج من علامات سطح الخلية مما يجعل عملية استئصال الخلايا متعددة الألوان تقنية قوية في التحقيق في هذه العمليات الخلوية. في هذا البروتوكول، ونحن وصف الخطوات التفصيلية بشأن حصاد الأنسجة الزليلي والأعضاء اللمفاوية الثانوية، فضلا عن توليد تعليق خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، نقدم كل من فحص تلطيخ خارج الخلية لتحديد أحاديات / الضامة و المجموعات الفرعية الخاصة بهم، فضلا عن فحص تلطيخ خارج وداخل الخلوية لتحديد الخلايا التائية وتفرعاتها داخل طحال المورين، نخاع العظام، الغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية. تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول واختبارها ، مما أدى إلى اختبار قابل للاستنساخ للغاية يمكن استخدامه لنماذج أخرى من ماوس الزراعة العضوية الجراحية وغير الجراحية.

Introduction

هشاشة العظام (الزراعة العضوية) هو مرض موهن ومؤلم يشمل مختلف الأمراض من جميع الأنسجة المرتبطة بالمفصل1. تؤثر على ما يقرب من 3.8٪ من سكان العالم2, الزراعة العضوية هي واحدة من أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا وأنه من أن تصبح السببالرئيسي 4 من الإعاقة في جميع أنحاء العالم بحلول عام 20203. بعد الصدمة الزراعة العضوية يحدث بعد إصابة المفاصل وحسابات لا تقل عن 12٪ من جميع الزراعة العضوية وما يصل إلى 25٪ من الزراعة العضوية في المفاصل عرضة مثل الركبة4,5. وعلاوة على ذلك، فإن إصابة المفاصل تزيد من خطر100000000000000000000000000000000000000000000000000000 لن تستمر جميع الإصابات التي يبدو أنها غير مُتشابهة في تطوير الزراعة العضوية، وبالتالي فإن تحديد العوامل التي تدفع خطر الزراعة العضوية على المدى الطويل لا يزال يشكل تحدياً. ومن الأهمية بمكان من أجل تطوير علاجات فعالة لمنع و / أو علاج الزراعة العضوية بعد الصدمة ، للتحقيق وتحديد أفضل الأمراض المتعلقة بالإصابات ، والأسباب ، والآليات التي تهيئ لOA1.

OA والتدمير الغضروف تعريفه كان يعزى سابقا تماما إلى الإجهاد الميكانيكية، وهكذا، كان يعتبر OA مرض غير الالتهابي2. ومع ذلك، أظهرت دراسات أكثر حداثة تسلل التهابي من الأغشية الزليلية وزيادة الخلايا الالتهابية في الأنسجة الزليلية في المرضى الذين يعانون من الزراعة العضوية مقارنة مع الضوابط الصحية2، تسليط الضوء على عنصر التهابي كقوة دافعة محتملة في الزراعة العضوية. وأشارت دراسات أخرى إلى أن شذوذ في كل من CD4 + و CD8 + T-الخلية الشخصية وكذلك monocytes / الضامة من الجهاز المناعي الفطرية قد تسهم في التسبب فيOA 2,7. وكشفت التحقيقات التفصيلية في هذه التشوهات الأدوار ذات الصلة لمختلف المجموعات الفرعية خلية T2، مثل Th18، Th29، Th178 و T التنظيمية (Treg) السكان10،11. على الرغم من هذه الأدلة الدامغة ، فإن العلاقة السببية بين تغيير استجابات الخلايا التى وتطور وتطور الزراعة العضوية لا تزال غير معروفة2.

بالإضافة إلى خلايا تي محددة لها دور في الزراعة العضوية، تشير الدراسات الحديثة إلى أن الضامة المستقطبة /المنشطة قد تكون مرتبطة بتولدية OA12. على وجه الخصوص، الضامة التي تنشأ من أحاديات الدم تتراكم في السينوفيوم والاستقطاب في إما الضامة المنشطة كلاسيكيا (M1) أو بدلا من ذلك تفعيل الضامة (M2) أثناء التنمية الزراعة العضوية، مما يعني وجود علاقة بين الضامة المشتقة monocyte وOA13. في المقابل، مجموعات فرعية معينة من الضامة ملء الأعضاء في وقت مبكر أثناء التنمية والاكتفاء الذاتي أعدادهم في مادة مستقلة monocyte14. في الآونة الأخيرة، تم عرض وظيفة حماية مشتركة بوساطة حاجز ضيق الوصل لهذه الضامة الزليلية الأنسجة المقيم (STRMs)14. وتشير هذه النتائج إلى أن الشذوذ في مجموعات فرعية خاصة من الضامة قد تلعب دوراً حاسماً أثناء تطوير الزراعة العضوية. ومع ذلك، فإن التفاعلات بين هذه الاستجابة الخلوية الالتهابية والتغيرات الهيكلية في المفصل اللاحق للصدمة غير معروفة.

تاريخيا، كان يقتصر تحليل الخلايا المناعية في الأنسجة الزليلية على الكيمياء المناعية (IHC) أو التعبير مرنا عن طريق عكس النسخ تفاعل البوليمرات سلسلة (RT-PCR) النهج15،16. ومع ذلك، فإن كلا من IHC وRT-PCR تفتقر إلى القدرة على تحديد أنواع مختلفة متعددة من الخلايا و مجموعاتها الفرعية في وقت واحد، وبالتالي الحد من إمكانية تطبيق هذه الطرق. وعلاوة على ذلك، يقتصر IHC لتحليل عينات صغيرة من الأنسجة، وقد يغيب عن تراكم الخلايا الالتهابية البؤري. على مدى السنوات القليلة الماضية، تم تطوير عدد لا يحصى من علامات السطح لأنواع مختلفة من الخلايا، ويمكن الآن تحديد مجموعات فرعية من الخلايا المناعية بشكل موثوق من خلال مجموعات متميزة من هذه العلامات. بسبب التقدم التقني المطرد، أجهزة قياس التدفق قادرة الآن على تحديد العديد من الفلوروكرومات المختلفة في وقت واحد مما يتيح تحليل لوحات الأجسام المضادة متعددة الألوان الكبيرة.

يوفر قياس التدفق الخلوي للمحققين تقنية قوية تسمح بتحديد وقياس كمية العديد من الخلايا المناعية و المجموعات الفرعية الخاصة بها على مستوى الخلية المفردة. لقد طورنا وحسّنا كل من مقايسة تلطيخ خارج الخلية لتحديد أحاديات / الضامة و المجموعات الفرعية الخاصة بهم وكذلك مقايسة تلطيخ إضافية / داخل الخلايا لتحديد الخلايا التائية و مجموعاتها الفرعية داخل طحال المورين ونخاع العظام والغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية. تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول واختبارها مما أدى إلى محك قابل للاستنساخ للغاية يمكن استخدامه لنماذج أخرى ماوس OA الجراحية وغير الجراحية17.

Protocol

وقد وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان في منطقة الصحة المحلية في شمال سيدني على جميع الإجراءات المذكورة في هذا البروتوكول. يتم إيواء الفئران ورعايتها وفقًا لدليل رعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها (المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا، المنقح لعام 2010). لجميع التجارب 10-12 أسبوعا من العمر، واستخدمت الفئران C57BL/6 الذكور.

ملاحظة: للحث على ما بعد الصدمة OA، تم إجراء زعزعة الاستقرار الجراحي للغضروف المفصلي الوسيط (DMM) في المفصل الخانق الأيمن. وقد نشرت معلومات مفصلة بشأن هذا النموذج الحيواني من قبل Glasson وآخرون18. باختصار، يتم إجراء التخدير العام في غرفة التعريفي باستخدام isoflurane و الحفاظ عليها بعد ذلك باستخدام مخروط الأنف. يتم حلق الساق الجراحية بشفرة حلاقة ويتم غسل الموقع الجراحي وشفاحه بالإيثانول لتقليل التلوث. ثم يتم نقل الحيوان إلى مجهر التشغيل ووضعه على منشفة معقمة والساق تتدلى مع ستائر ورقة معقمة لعزل الموقع الجراحي وتقليل التلوث. باستخدام المجهر، يتم إجراء مفصلية شبه الرضفة 0.5 سم، والرضفة لوكسي بشكل جزئي، ولوحة الدهون تحت الرضفة مرتفعة لفضح الرباط الطمثي- التيبالي المتوسط، الذي يتم تقسيمه مع ملقط تشريح. يتم مسح المفصل مع المالحة المعقمة لإزالة أي الدم ويتم إغلاق الجرح في ثلاث طبقات – كبسولة مشتركة، والأنسجة تحت الجلد (باستخدام مواد خياطة) والجلد (باستخدام الغراء الأنسجة الجراحية). الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول، ومع ذلك، يمكن تطبيقها على نماذج وأساليب أخرى لتحفيز الزراعة العضوية. يمكن أن يكون سبب الزراعة العضوية في جانبي الحيوان، وعند حصاد الأنسجة، من المهم حصاد الغدد الليمفاوية ipsilateral (استنزاف).

1. عزل الطحال، نخاع العظام contralateral، العقد الليمفاوية ipsilateral استنزاف الأنسجة الزليلية خنق

  1. القتل الرحيم الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. وضع الماوس في وضعية supine تحت المجهر تشريح ومسح الصدر والبطن والساقين مع 70٪ الإيثانول. فتح بعناية الجلد على خط الوسط لطول البطن باستخدام مقص مستقيم ترك تجويف البطن سليمة.
  2. اسحب الجلد بلطف على الجانب الأيمن من الحيوان بعيدًا عن العضلات الكامنة تاركاً النسيج الدهني تحت الجلد ملتصقاً بالبشرة. عادة، سوف الجر لطيف وحدها فصل الجلد والأنسجة الدهنية الكامنة من العضلات. وينبغي قطع من خلال التمسك متفرقة مع مقص غرامة من أجل الحفاظ على التوتر اللازم لفصل الأنسجة إلى أدنى حد ممكن والحد من فرصة الإضرار العقد الليمفاوية. تحديد عبور ثلاث سفن عن طريق إغاظة بلطف خارج الأنسجة الدهنية الموجودة في الفخذ باستخدام اثنين من ملقط ناعم المنحني. العقدة اللمفية الإربية تقع عند المعبر ويمكن تحديدها من خلال شكلها المبيض ولون أغمق قليلا.
  3. إزالة العقدة الليمفاوية الإربي باستخدام ملقط تشريح غرامة. يجب الحرص على عدم تمزق الكبسولة. إزالة الدهون المتبقية على سطح العقدة الليمفاوية مع ملقط.
  4. افتح تجويف البطن وحدد الطحال. قطع الطحال مع مقص غرامة. سحب بلطف الأمعاء جانبا لفضح الشريان الأورطي والتشعب مع الحرص على عدم الإضرار بها, من أجل تقليل خطر التلوث. تقع العقدة اللمفاوية الحرقفية في الجزء الطرفي من الشريان الأورطي البطني وأصل الشريان الحرقفي المشترك. إزالة العقدة الليمفاوية الحرقفية الحق والمضي قدما كما هو موضح في 1.3.
  5. إزالة بلطف الجلد من كلا الطرفين الخلفيين. تشريح عظم الفخذ الأيسر عن طريق تنظيفه من الأنسجة العضلية باستخدام شفرة ومقص غرامة. قطع بعناية كل من خنق والورك المشتركة ترك كامل العظام سليمة وإزالة عظم الفخذ.
  6. تحديد وتر الرضفة من الحق خنق مشتركة، ثم إزالة الأنسجة العضلية المجاورة القريبة إلى هذا باستخدام مقص غرامة حتى ما يقرب من 5mm من وتر رباعية القريبة من الرضفة يتعرض. بعد ذلك، وقطع من خلال وتر رباعية تقريبا 3-4mm قريبة إلى الرضفة لتشكيل مقبض واستخدام ملقط غرامة سحب بلطف بعيدا عن المفصل. وهذا سيجعل حواف مرفق كبسولة مشتركة لعظم الفخذ مرئية، واستخدام شفرة مشرط قطع بعناية على طول حواف كبسولة مشتركة على كلا الجانبين، بدءا من عظم الفخذ تسير نحو الساق، من أجل تعظيم كمية الغشاء الزليلي الذي يتم حصاده. في حين قطع من المهم للحفاظ على الجر لطيف على وتر رباعية ووقفة عندما يتم إرفاق كتلة الأنسجة الزليلي فقط إلى الساق. في هذه المرحلة لوحة الدهون داخل العين هو الآن واضحة واضحة لرضفة الرضفة ويمكن فصل بلطف من الجانب المشترك والمرئي من الثني باستخدام شفرة. بعد ذلك، قطع على طول الجزء المتبقي من الكبسولة المشتركة (جزء الريبة) لإزالة كتلة الأنسجة الزليلي.
    ملاحظة: هذه الخطوة يجب أن يتم بدقة للسماح نتائج موثوق بها. بعد الانتهاء من تشريح, "كتلة الأنسجة الزليلي" ينبغي أن تتكون من الرضفة, وتر الرضفة, وسادة الدهون infrapatellar, فوق- وfrafrapatellar استراحة بطانة الزليلية وكبسولة مشتركة المرتبطة بها الأمامي إلى الأربطة الجانبية. الحفاظ على جميع الأنسجة رطبة أثناء تشريح باستخدام محلول ملحي 0.9٪.
    ملاحظة: ضع كل عينة كتلة الأنسجة الزليلي في بئر منفصل من لوحة 24-well الموسومة التي تحتوي على 1.5 مل من 1640 1640 1640 11. الجمع بين كل من الحرقفي والعقدة الليمفاوية الإربية في بئر واحد وبركة الأنسجة من اثنين من الفئران.

2. توليد تعليق خلية واحدة من كل نسيج

ملاحظة: من أجل ضمان أرقام الخلايا الكافية لتحليل تدفق الأنسجة الزليلي من اثنين من الفئران تحتاج إلى أن تكون مجمعة. في البروتوكول الحالي، تجمع جميع الأنسجة من نفس الفئران اثنين من أجل الحفاظ على القياس. وعلاوة على ذلك، تم الجمع بين الغدد الليمفاوية الإربية والأربية لكل مما أدى إلى ما مجموعه 4 العقد الليمفاوية لكل عينة. بشكل عام، أرقام الخلايا في الطحال، نخاع العظام والغدد الليمفاوية من واحد كافية لإجراء تحليل التدفق ويمكن تطبيق البروتوكول. ومع ذلك، عند استخدام الأنسجة من وقت واحد فقط الحيوانات lysing قد تحتاج إلى تعديل.

  1. الطحال
    1. ضع الطحالين المتجمعين على مصفاة 70 ميكرومتر على قمة أنبوب 15 مل. برفق اشعل الطحال من خلال مرشح شبكة باستخدام مغمس حقنة معقم 3 مل. تدفق المصفاة في كثير من الأحيان مع ما مجموعه 6 مل من 1640 1640 متوسطة 1640 تكملة مع FBS 10٪.
    2. تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT) و resuspend بيليه في 5 مل من خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ووقف رد الفعل عن طريق تخفيف العازلة تحلل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT) وتكرار هذه الخطوة مرة واحدة أو حتى لا يكون أكثر RBC في بيليه.
      ملاحظة: إعادة تصفية التعليق باستخدام مصفاة خلية 30 ميكرومتر في أنبوب جديد 15 مل بين الجولتين من الخلع لإزالة الخلايا المتخثرة.
    3. بعد اكتمال lysing، تدور الخلايا (500 س ز،5 دقيقة، RT)، تجاهل عظمى و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني. عد عدد الخلايا الحية على مقياس الهيموسيت باستخدام استبعاد Trypan الأزرق.
  2. العقد اللمفاوية
    1. ضع العقد اللمفية الأربعة المجمعة على مصفاة خلايا 70 ميكرومتر فوق أنبوب 15 مل. ندف بلطف العقد الليمفاوية وبصرف النظر في تعليق خلية واحدة عن طريق الضغط مع مغطس حقنة 3 مل معقمة. تدفق المصفاة في كثير من الأحيان مع ما مجموعه 6 مل من RPMI مع 10٪ FBS.
    2. تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT)، والتخلص من افرا و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إعادة تصفية التعليق باستخدام مصفاة 30 ميكرومتر الخلايا في أنبوب جديد 15 مل لإزالة الخلايا المتخثرة. عد عدد الخلايا الحية على مقياس الهيموسيت باستخدام استبعاد Trypan الأزرق.
  3. نخاع العظم
    1. فهم بعناية عظم الفخذ سليمة باستخدام ملقط الإبهام الأنسجة دون كسر ذلك. قطع نهاية عظم الفخذ القريب مع مقص حاد من أجل تسهيل مسح العظام. بدوره حول عظم الفخذ ووضع إبرة 23 G في منتصف الشق intercondylar من عظم الفخذ. في حين تطبيق ضغط لطيف تدوير الإبرة بين الإبهام وسببة من أجل حفر ثقب في الشق بينات الدم لدخول تجويف العظام.
      ملاحظة: في بعض الأحيان يمكن أن جزيئات العظام عرقلة الإبرة بعد حفر الحفرة، لتجنب الضغط العالي غير الضرورية أثناء التنظيف تغيير إبرة قبل أن ينصح التنظيف.
    2. قم بتدفق العظم مع 6 مل من RPMI مع 10٪ FBS (أو حتى يتحول تدفق أبيض) باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 23 G على مصفاة خلايا 70 ميكرومتر التي يتم وضعها على أنبوب 15 مل. اضغط بلطف على نخاع العظم من خلال مصفاة الخلية مع المكبس من حقنة 3 مل وشطف المصفاة مع آخر 3 مل من RPMI.
      ملاحظة: يجب أن تظهر العظام بيضاء مرة واحدة وقد تم مسح كل النخاع تماما.
    3. تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT) و resuspend بيليه في 5 مل من العازلة تحلل RBC. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ووقف رد الفعل عن طريق تخفيف العازلة تحلل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
    4. تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT)، والتخلص من افرا و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني. إعادة تصفية التعليق باستخدام مصفاة 30 ميكرومتر الخلايا في أنبوب جديد 15 مل لإزالة الخلايا المتخثرة. عد عدد الخلايا الحية على مقياس الهيموسيت باستخدام استبعاد Trypan الأزرق.
  4. النسيج الزليلي
    1. الزهر كتل النسيج الزليلي اثنين في قطع صغيرة مع مقص الجراحية غرامة. نقل العينات مع المتوسطة في أنبوب 15 مل. شطف البئر القديم مع 0.5 مل إضافية من RPMI للحصول على الخلايا المتبقية والأنسجة الزليلي، ونقل إلى أنبوب الصقر (الحجم النهائي 2 مل).
      TIP: استخدام ماصة نقل وقطع من طرف حيث يتسع قطر في هذه الخطوة.
    2. إعادة تشكيل انزيم و aliquot وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (على سبيل المثال، Liberase). إضافة إنزيم كافٍ لنتيجة تركيز نهائي من وحدة/مل (ما مجموعه وحدتين لكل عينة). جسّد عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة باستخدام جهاز ماكينة ماكينة ماكينة ماك.
    3. وقف الهضم عن طريق إضافة 8 مل من RPMI مع 10٪ FBS وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر خلية في أنبوب جديد 15 مل. شطف أنبوب 15 مل القديمة مع آخر 5 مل من RPMI مع 10٪ FCS المتوسطة ومرشح تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية نفسها في أنبوب جديد (15 مل الحجم النهائي).
    4. تدور الخلايا (500 س ز،10 دقيقة، RT)، والتخلص من افرا و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. عد عدد الخلايا الحية على مقياس الهيموسيت باستخدام استبعاد Trypan الأزرق.

3- تخصيص الخلايا

  1. تسمية اثنين من 96-جيدا لوحات (U-أسفل الشكل) مع نوع من الأنسجة، معرف الحيوان، ولوحة الأجسام المضادة المعينة. يتم استخدام مجموع اثنين من لوحات الأجسام المضادة في هذا البروتوكول: لوحة فرعية أحادية (تلطيخ خارج الخلية) ولوحة مجموعة فرعية T-خلية (تلطيخ خارج الخلية وداخل الخلايا).
  2. توفير 5 × 105 خلايا في البئر باستخدام تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: عند إعداد التجربة، قم بتقييم العدد المطلق للخلايا المتوقعة لكل مجموعة ونوع الأنسجة (الحيوانات المعالجة لديها عدد خلايا أعلى في الأنسجة من الحيوانات المسيطرة). عند إعادة بناء بيليه الخلية خلال الخطوة الأخيرة من توليد تعليق خلية واحدة، واختيار كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني في نهاية المطاف مع تركيز 5 × 105 لكل 200 ميكرولتر. يمكن أن تحمل اللوحة 96-جيدا المستخدمة هنا ما لا يزيد عن 300 ميكرولتر وعادة ما تكون 200 ميكرولتر مثالية لتقليل خطر التلوث المتبادل بسبب الانسكاب.
  3. لكل لوحة ونوع الأنسجة، وتوزيع ما لا يقل عن 5 × 105 الخلايا والضوابط غير الملطخة في الآبار التي تم وضع علامة واضحة.

4. لوحة المجموعة الفرعية أحادية الكيس

  1. أداء تلطيخ القدرة على البقاء: خلايا الدوران (500 س ز،5 دقائق، 4 درجة مئوية) باستخدام لوحة الدوار وغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من 1X PBS. إعداد حل الأسهم من خلية impermeant أمين التفاعلي صبغة (وصمة عار قابلية البقاء) المخفف 1:50 في 1X PBS. بعد ذلك، resuspend الكريات الخلية مع 100 ميكرولتر من هذا الحل المخزون مما أدى إلى حجم مطلق من 2 ميكرولتر من وصمة عار قابلة للحياة في بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظة: ينبغي تحديد الكمية المثلى من وصمة عار القدرة على البقاء اللازمة من خلال إجراء منحنى المعايرة الجرعة. وبالإضافة إلى ذلك، وينبغي أن تستخدم المخففات محلول الأسهم وصمة عار قابلة للحياة في يوم واحد، ولا يتم تخزينها. راجع تعليمات الشركة المصنعة للحصول على مزيد من المعلومات حول كيفية إعادة تشكيل وصمة عار قابلية البقاء وتمييعها وتخزينها.
  2. أثناء الحضانة، وإعداد كوكتيل من الأجسام المضادة في حجم مناسب من FACS العازلة (Ca2 + و Mg + برنامج تلفزيوني مجاني يحتوي على 0.1٪ BSA و 0.02٪ أزيد الصوديوم). غسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر من FACS العازلة، الطرد المركزي (500 × ز، 5 دقيقة، 4 درجة مئوية) وإعادة بناء كل بيليه مع 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة أو خليط التحكم المناسب. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظة: يرجى أن تكون على علم بأن أزيد الصوديوم هو سام للخلايا. في البروتوكول الحالي تركيز أزيد الصوديوم في المخزن المؤقت للتدفق منخفض جداً (0.02٪ ) ويتم تشغيل عينات مباشرة بعد تلطيخ وبالتالي، لا تسبب أي مشكلة. إذا تم التخطيط للفرز الوظيفية المصب من الخلايا المفوّجة ، فقد يكون من المفيد تعويض عازلة FACS جديدة كل يوم من التجارب وعدم استخدام أي أزيد الصوديوم. عند استخدام العديد من الأجسام المضادة، ينصح بإضافة كمية مناسبة من "الرائعة وصمة عار العازلة" إلى كوكتيل من الأجسام المضادة لتعزيز النتائج.
  3. اغسل الخلايا مرتين بـ 200 ميكرولتر من مخزن FACS العازلة و resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر من FACS + EDTA العازلة (FACS العازلة التي تحتوي على 1 mM EDTA). نقل العينات إلى أنابيب FACS المسماة. الاحتفاظ بالعينات عند 4 درجة مئوية وحمايتها من الضوء حتى الحصول عليها.
    ملاحظة: الخلايا المناعية لديها ميل إلى أن تكون لزجة. من أجل تقليل كل من خطر انسداد وعدد من doublets فمن المستحسن إضافة 1 mM EDTA إلى المخزن المؤقت تدفق النهائي.

5. T الخلية لوحة فرعية

  1. أداء تلطيخ القدرة على البقاء: خلايا الدوران (500 س ز،5 دقائق، 4 درجة مئوية) باستخدام لوحة الدوار وغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من 1X PBS. إعداد حل الأسهم من خلية impermeant أمين التفاعلي صبغة (وصمة عار قابلية البقاء) المخفف 1:50 في 1X PBS. بعد ذلك، resuspend الكريات الخلية مع 100 ميكرولتر من هذا الحل المخزون مما أدى إلى حجم مطلق من 2 ميكرولتر من وصمة عار قابلة للحياة في بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
  2. أثناء احتضان العينات، إعداد كوكتيل الأجسام المضادة تلطيخ خارج الخلية في حجم مناسب من 1x FACS العازلة. غسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر من 1x FACS العازلة، تدور عليهم (500 × ز،5 دقيقة، 4 درجة مئوية) و resuspend كل بيليه مع 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة أو خليط التحكم المناسب. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
  3. تنفيذ تلطيخ داخل الخلايا مع تثبيت وطقم permeabilization اتباع تعليمات الشركة المصنعة. اغسل الخلايا مرتين بـ 200 ميكرولتر من 1x FACS buffer و resuspend في 200 ميكرولتر من حاجز التثبيت. احتضان لمدة 40 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
  4. أثناء الحضانة ، قم بإعداد مزيج من الأجسام المضادة (التلطيخ داخل الخلايا) في حجم مناسب من 1x permeabilization وغسيل العازلة. جمع الخلايا عن طريق الغزل (750 × ز،5 دقيقة، 4 درجة مئوية) وغسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر من 1x بيرم / غسل العازلة.
    ملاحظة: التثبيت والنتائج permeabilization في الخلايا التي تميل إلى أن تكون أصعب قليلاً بيليه بشكل صحيح. من أجل تقليل فقدان الخلايا خلال خطوات الغسيل اللاحقة، وزيادة قوة الطرد المركزي إلى 750 x ز. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضاً تطبيق دورة غزل أطول. ومع ذلك، فإن هذا يؤدي إلى وقت أطول بكثير التي هي مطلوبة لإعداد الخلايا.
  5. تدور الخلايا (750 س ز،5 دقيقة، 4 درجة مئوية) و resuspend كل بيليه مع 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة أو خليط التحكم المناسب. احتضان لمدة 40 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
  6. غسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر من 1x بيرم / غسل العازلة وإعادة تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من FACS + EDTA العازلة. نقل العينات إلى أنابيب FACS المسماة. الاحتفاظ بالعينات عند 4 درجة مئوية وحمايتها من الضوء حتى الحصول عليها.
    ملاحظة: بالنسبة لكل جسم مضاد، يجب تحديد التركيز الأمثل من خلال إجراء منحنى المعايرة بالجرعة. يمكن أن يختلف التركيز بين الأجسام المضادة بشكل كبير: تم استخدام CD3 و CD80 مع عامل تخفيف 1:1 ، في حين تم استخدام CD11b و CD4 مع عامل تخفيف 1:6400. عند المعايرة تركيز الأجسام المضادة استخدام نفس العدد من الخلايا التي سيتم استخدامها خلال التجارب.

6- التعويض، والضوابط المناسبة، والبوابات

  1. إعداد التجربة
    1. مرة واحدة تم تحديد تركيز الأجسام المضادة الأمثل تشغيل الضوابط الملطخة والملطخة واحدة للتعويض لضبط التداخل الطيفي.
      ملاحظة: تشغيل كافة عناصر التحكم التعويض مع كل من الخلايا والخرز التعويض. استخدام كل ما يولد النتائج ألمع (أعلى MFI من الأحداث الإيجابية) للتعويض. MFI تعني متوسط شدة الفلورس، وغالباً ما تستخدم لوصف وتحديد متوسط شدة الإشارة المتولدة، وبالتالي، مستوى التعبير عن الأجسام المضادة.
    2. تشغيل الفلوريسنس ناقص واحد (FMO) عناصر التحكم و isotype عناصر تحكم عند بدء تجربة متعددة الألوان جديدة. مزيد من التفاصيل بشأن FMO وقد نشرت سابقا19.
    3. تحديد الأمثل لمنطقة التشتت إلى الأمام (FSC-A) الجهد والجهد منطقة تشتت الجانب (SSC-A) من أجل الكشف عن السكان الكريات البيض في الضوابط غير الملطخة من كل نوع الأنسجة.
      ملاحظة: عملية التثبيت و permeabilization يغير أبعاد الخلية. وهكذا، فإن الفولتية FSC-A وSSC-A للوحة المجموعة الفرعية أحادية الخلية و T مجموعة فرعية تختلف اختلافا كبيرا. من أجل العثور على الفولتية المثلى لتي الخلية مجموعة فرعية الفريق، استخدام الخلايا التي كانت واحدة ملطخة CD3 والبوابة الخلفية نحو السكان الكريات البيض مع ضبط القيم FSC-A وSSC-A.
  2. استراتيجية الغاتينغ
    1. مرة واحدة تم تحديد الأمثل FSC-A و SSC-A الجهد، اقامة بوابة رئيسية على السكان الكريات البيض.
      ملاحظة: قبل كل تجربة معايرة مقياس المقاييس باستخدام حبات المعايرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتشغيل الخرز غير المطّط. وينبغي أن يكون للسكان الكريات البيض من نقاط زمنية مختلفة خصائص FSC وSSC قابلة للمقارنة (الاختلافات الطفيفة بين أنواع الأنسجة ومن المتوقع أن تكون طبيعية). إذا FSC وSSC يختلف مشكلة كبيرة اطلاق النار على مقياس الدراجات الكهربائية وتوليد العينة.
    2. استبعاد المضاعفة: مؤامرة FSC-A (محور ص) و FSC-H (محور س). يظهر Singlets كقطر من هذه المؤامرة. البوابة على العزاب.
    3. استبعاد الخلية الميتة: مؤامرة FVS510 (وصمة البقاء) (س المحور) و FSC-A (محور ص). الخلايا الميتة سوف تظهر كالأحداث الإيجابية، وبالتالي بوابة على الخلايا الحية.
      ملاحظة: الخلايا السالبة true ستكون مرئية في عناصر التحكم غير المُطَمَّى. وهكذا، ضبط هذه البوابة لكل مجموعة من العينات عند تشغيل عناصر التحكم غير الملطخة قبل عينات ملطخة. مزيد من الغوط يعتمد على لوحة الأجسام المضادة ونوع الخلية التي يتم التحقيق. ويمكن الاطلاع على استراتيجيات الغات لكل لوحة تستخدم في هذا البروتوكول في الشكل 1 والشكل 4، على التوالي.

النتائج

يتم أدناه وصف النتائج التمثيلية من كل من لوحة المجموعة الفرعية أحادية الخلية و T-cell.

يوضح الشكل 1 استراتيجية البوابات الهرمية للوحة الفرعية أحادية الخلايا على الخلايا المناعية التي تم جمعها من نخاع العظم للحيوانات المعالجة DMM. واستخدمت نفس الاستراتيجية وتحق...

Discussion

وقد تم تصميم واختبار الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول لتحديد موثوق مجموعات فرعية مختلفة من كل من أحادية الخلايا / الضامة والخلايا التائية داخل الطحال مورين، نخاع العظام، والغدد الليمفاوية، والأنسجة الزليلي في نموذج مورين من هشاشة العظام (الزراعة العضوية). يمكن تعديل البروتوكول الحالي بس...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر أندرو ليم، دكتوراه وجايلز بيست، دكتوراه لمساعدتهم في إعداد تدفق مقياس المقاييس. وقد دعم هذا المشروع دويتشه هـيـزنغـسجيمينشافت (DFG-HA 8481/1-1) الذي مُنح لـ PH.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
APC anti-mouse CD194 (CCR4)BioLegend131212T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000TstBD566385Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µgBD564406T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µgBD564406Monocyte Panel
Liberase, Research GradeRoche5401127001Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µgBD564985Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µgBD562454Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µgBD742274T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µgBD565250Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µgBD563061T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µgBD557596T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µgBD552775T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µgBD565480T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µgBD565261T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µgBD740664T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µgBD563687Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µgBD563332T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µgBD565411Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µgBD560408T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µgBD563414Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µgBD560593Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µgBD560600Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µgBD564143T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µgBD562894T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing BufferN/AN/ABuffersDescription in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100TstBD562574Buffers

References

  1. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
  2. Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
  3. Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
  4. Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
  5. Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
  6. Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
  7. Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
  8. Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
  9. Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
  10. Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
  11. Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
  12. Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
  13. Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
  14. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
  15. Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
  16. Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
  17. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  20. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  21. Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  22. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  23. Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
  24. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  25. Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
  26. Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

158monocytes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved