変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

要約

ここでは、マウス変形性関節症の確立された外科モデルを利用して、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内の細胞外染色アッセイと細胞内染色アッセイの両方を使用して、単球/マクロファージおよびT細胞サブセットを同定するための詳細で再現可能なフローサイトメトリープロトコルについて述べた。

要約

変形性関節症(OA)は、痛みや身体的な制限に苦しむ患者に影響を与える最も一般的な筋骨格疾患の一つです。最近の証拠は、T細胞と単球/マクロファージの両方がOAの病因に関連する可能性のある疾患の潜在的な炎症成分を示している。さらなる研究は、Th1、Th2、Th17、およびT-調節性リンパ球、およびM1、M2、および滑膜組織居住マクロファージなどの炎症性細胞系のサブセットに重要な役割を果たした。しかしながら、局所滑液および全身性炎症細胞反応と関節の構造変化との相互作用は不明である。T細胞と単球/マクロファージがOAにどのように寄与するかを完全に理解するには、滑膜組織、二次リンパ器官および全身(脾臓および骨髄)においてこれらの細胞とそのサブセットを同時に定量的に同定できることが重要である。今日では、異なる炎症細胞サブセットは、これらの細胞プロセスを調査する際に多色流サイトメトリーを強力な技術にする細胞表面マーカーの組み合わせによって同定することができる。このプロトコルでは、滑液組織および二次リンパ器官の収穫に関する詳細なステップと、単一細胞懸濁液の生成について説明する。さらに、単球/マクロファージとそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイと、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内のT細胞およびそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイを提示する。このプロトコルの各ステップは最適化され、テストされ、他の外科および非外科的OAマウスモデルに利用することができる非常に再現性の高いアッセイをもたらした。

概要

変形性関節症(OA)は、関節¹に関連するすべての組織の様々な病理を含む衰弱および痛みを伴う疾患である。世界人口の約3.8%に影響を及ぼす^2,OAは最も一般的な筋骨格系疾患の1つであり、2020年までに世界の第4^位の障害原因となる^。外傷後OAは関節損傷後に発生し、膝^4、5などの影響を受けやすい関節において、OAの少なくとも12%、OAの最大25%を占める。^,5さらに、関節損傷はOAの生涯リスクを5倍以上6倍に増加^させる。明らかに同様の不安定性を持つすべての傷害がOAの開発に進むわけではないので、長期的なOAリスクを引き起す要因を定義することは依然として困難です。OAに素因がある傷害特異的な病理、原因、およびメカニズムを調査し、より良く定義するために、心的外傷後OAを予防および/または治療するための効果的な治療法を開発することが¹重要である。

OAとその定義軟骨破壊は、以前は完全に機械的ストレスに起因し、したがって、OAは非炎症性疾患²と考えられていた。しかし、最近の研究では、滑膜の炎症性浸潤と、OA患者の滑膜組織における炎症性細胞の増加が、健康なコントロール²と比較して、OAの潜在的な原動力として炎症成分に光を当てることが示されている。さらなる研究は、CD4+およびCD8+T細胞プロファイルの両方の異常ならびに自然免疫系の単球/マクロファージが^OA2、7,7の病因に寄与する可能性があることを示した。これらの異常に関する詳細な調査は、様々なT細胞サブセット^2、例えばTh1 8、Th2⁹9、Th17^{8 8}およびT規制(Treg)集団^10、11,11のような関連する役割を明らかにした。この説得力のある証拠にもかかわらず、T細胞応答の変化とOAの発達と進行との因果関係はまだ不明^である2.

OAに役割を持つ特定のT細胞に加えて、最近の研究では、分偏光/活性化マクロファージが^OA12の病因と関連している可能性が示唆されている。特に、血液単球に由来するマクロファージは、滑膜に蓄積し、OAの開発中に古典的に活性化されたマクロファージ(M1)または代替活性化マクロファージ(M2)のいずれかに蓄積し、単球由来マクロファージと^OA13との間の相関関係を暗示する。対照的に、マクロファージの特定のサブセットは、発達中の初期に臓器を移入し、単球独立物質¹⁴においてその数を自立する。近年、これらの滑膜組織居住マクロファージ(STRM)14について、密接的な接合バリアによって媒介された関節保護機能が¹⁴示された。これらの知見は、特にマクロファージサブセットの異常がOAの開発中に重要な役割を果たす可能性があることを示している。しかし、この炎症細胞反応と外傷後の関節の構造変化との相互作用は不明である。

歴史的に、滑液組織における免疫細胞の解析は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)が^15,16,16に近づくことで免疫組織化学(IHC)またはmRNA発現に限定された。しかし、IHCとRT-PCRの両方が、複数の異なる細胞タイプとそのサブセットを同時に識別する能力を欠いているため、これらの方法の適用性が制限されます。さらに、IHCは組織の小さなサンプルの分析に限定され、焦点炎症性細胞蓄積を見逃す可能性がある。ここ数年、さまざまな細胞タイプの無数の表面マーカーが開発され、免疫細胞のサブセットは、これらのマーカーの明確な組み合わせによって確実に同定できるようになりました。着実な技術進歩により、フローサイトメーターは、多数の異なるフルオロクロムを同時に同定することができ、大型の多色抗体パネルの分析が可能になりました。

フローサイトメトリーは、多数の免疫細胞とそのサブセットを単一細胞レベルで同時に同定し、定量化できる強力な技術を研究者に提供します。私たちは、単球/マクロファージとそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイと、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内のT細胞およびそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイの両方を開発し、最適化しました。このプロトコルの各ステップは最適化され、テストされ、他の外科および非外科的OAマウスモデル¹⁷に利用することができる非常に再現性の高いアッセイを生じる。

プロトコル

北シドニー地方保健地区動物倫理委員会は、この議定書に記載されているすべての手続きを承認しました。マウスは、実験動物のケアと使用ガイド(オーストラリア国立健康医学研究評議会改訂2010)に従って収容され、世話されています。10〜12週齢のすべての実験に対して、雄C57BL/6マウスを利用した。

注: 心的外傷後OAを誘導するために、右の凝縮関節における内側半月板(DMM)の外科的不安定化が行われた。この動物モデルに関する詳細情報は、Glassonらの¹⁸社から出版された。要するに、一般的な麻酔はイオブルランを用いた誘導室で誘発され、その後、鼻コーンを用いて維持される。手術用脚はカミソリの刃で剃られ、外科部位は洗浄され、汚染を最小限に抑えるためにエタノールで振り回される。その後、動物は手術顕微鏡に移動し、滅菌タオルの上に置かれ、脚は滅菌紙のドレープで覆われ、外科現場を隔離し、汚染を最小限に抑えます。顕微鏡を用いて、0.5cmの内側パラ膝蓋関節切除術を行い、膝蓋骨を横方向に割り出し、腸内膝蓋骨脂肪パッドを上昇させ、解剖鉗子で経えて経皮性の内側半月骨脛骨靭帯を露出させる。関節は、任意の血液を除去するために無菌生理食糸で洗い流され、創傷は3つの層で閉じている - 関節カプセル、皮下組織(縫合材料を使用)および皮膚(外科組織の接着剤を使用)。ただし、このプロトコルで説明されているメソッドは、OA を誘導する他のモデルやメソッドに適用できます。OAは、動物の両側で誘導することができ、組織を収穫する場合、イプシララル(ドレイン)リンパ節を収穫することが重要である。

1. 脾臓の分離, 対側骨髄, スティフレーションと滑膜組織を排出するイプシ側リンパ節

1. 頸部脱臼によりマウスを安楽死させる。マウスを解剖顕微鏡下の上の上の位置に置き、70%エタノールで胸、腹部および脚を拭きます。腹腔をそのままにしてまっすぐはさみを使用して、腹部の長さのために慎重に正中線の皮膚を開きます。
2. 皮膚に付着した皮下脂肪組織を残して、下層の筋肉から動物の右側の皮膚をそっと引っ張ります。通常、穏やかな牽引だけでは、皮膚と下層の脂肪組織を筋肉から分離します。散発的な付着は、組織を最小限に分離するために必要な緊張を維持し、リンパ節に害を与える可能性を減らすために、細かいはさみで切断する必要があります。2つの湾曲した細かい鉗子を使用して、大腿部に位置する脂肪組織を優しくからかうことによって、3つの血管の交差を識別する。イングイナルリンパ節は交差に位置し、その球体形状とわずかに暗い色で識別することができます。
3. 細かい解剖鉗子を使用して、リンパ節を取り除きます。カプセルを破裂しないように注意してください。鉗子でリンパ節の表面に残った脂肪を取り除きます。
4. 腹腔を開き、脾臓を特定します。細かいはさみで脾臓を切り取ります。汚染のリスクを最小限に抑えるために、大腸とその分岐を露出させるために、腸を静かに引き離します。腸骨リンパ節は、腹部大動脈の末端部および共通腸骨動脈の起源に位置する。右腸骨リンパ節を取り除き、1.3に記載されているように進みます。
5. 両後肢の皮膚をそっと取り除きます。刃と細かいはさみを使って筋肉組織からきれいにして左大腿骨を解剖する。骨全体をそのままにして、スティフと股関節の両方を慎重に取り外し、大腿骨を取り除きます。
6. 右の凝縮関節の膝蓋腱を特定し、膝蓋骨に近位の約5mmの四頭筋腱が露出するまで、これに近い隣接する筋肉組織を細かいはさみを使用して除去する。その後、膝蓋骨に約3〜4mm近位の四頭筋腱を切断してハンドルを形成し、細かい鉗子を使用して関節からそっと引き離す。これにより、関節カプセルの取り付けの端が大腿骨に見えるようにし、収穫される滑膜の量を最大化するために脛骨に向かう大腿骨から始まる両側の関節カプセルの端に沿って慎重に切断されたメスブレードを使用します。切断は四頭筋腱の穏やかな牽引を維持し、滑液組織ブロックが脛刺にのみ付着しているときに一時停止することが重要です。この段階では、関節内脂肪パッドは、膝蓋骨に遠位にはっきりと見え、ブレードを使用してメニシの関節および前側面から穏やかに剥離することができる。その後、関節カプセルの残りの部分(脛部)に沿って切断し、滑液組織ブロックを除去する。
   注: この手順は、信頼性の高い結果を得るために非常に正確に行う必要があります。解剖を完了した後、「滑膜組織ブロック」は、膝蓋骨、膝蓋腱、腸蓋骨蓋脂肪パッド、上頭および膝蓋部の凹部の滑膜内層および副靭帯の前部に関連する関節カプセルで構成されるべきである。解剖中、全ての組織を湿潤に保ち、0.9%の生理液溶液を使用してください。
   注:各滑液組織ブロックサンプルは、1.5 mlのRPMI 1640培地を含むラベル付き24ウェルプレートの別々のウェルに入れます。腸骨と鼠糖リンパ節の両方を1つの井戸に組み合わせ、2匹のマウスから組織をプールします。

2. 各組織からの単一細胞懸濁液の生成

注: 2匹のマウスからの滑液組織の流動解析に十分な細胞数を確保するためには、プールする必要があります。現在のプロトコルでは、同じ2匹のマウスからすべての組織をプールして、たとえを維持します。さらに、各動物に対して腸骨リンパ節とりえりリンパ節を組み合わせ、各サンプルに対して合計4個のリンパ節を生じた。一般に、1匹の動物の脾臓、骨髄およびリンパ節の細胞数は流動解析を行うのに十分であり、プロトコルを適用することができる。しかし、1つの動物のライジング時間から組織を使用する場合は、調整する必要があります。

1. 脾臓
   1. 2つのプールされた脾臓を、15 mLチューブの上に70 μmのセルストレーナーの上に置きます。滅菌3 mLシリンジプランジャーを使用して、メッシュフィルターを通して脾臓を穏やかに浸します。10% FBSを補充する RPMI 1640培地の合計6 mLでストレーナーを頻繁に洗い流します。
   2. 細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、5 mLの赤血球(RBC)リシスバッファーでペレットを再懸濁します。RTで5分間インキュベートし、10mLのPBSで溶精緩衝液を希釈して反応を停止する。細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、このステップを一度またはそれ以上の RBC がペレットに入らなくなるまで繰り返します。
      注:30 μmの細胞ストレーナーを使用して、2ラウンドのライジングの間に新しい15 mLチューブに懸濁液を再フィルタして、凝固細胞を除去します。
   3. 溶出が完了したら、細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、上清を捨て、PBSの1 mLでペレットを再懸濁します。トリパンブルー除外を使用して、ヘモサイトメーター上の生細胞の数を数えます。
2. リンパ節
   1. 4つのプールされたリンパ節を、15 mLチューブの上に70μmの細胞ストレーナーの上に置きます。無菌3 mLシリンジプランジャーを押して、リンパ節を単一の細胞懸濁液にそっといじめます。10%FBSでRPMIの合計6 mLでストレーナーを頻繁に洗い流します。
   2. 細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、上清を捨て、PBSの500 μLでペレットを再懸濁します。30 μmの細胞ストレーナーを使用して、凝固した細胞を除去するために新しい15 mLチューブに懸濁液を再フィルタします。トリパンブルー除外を使用して、ヘモサイトメーター上の生細胞の数を数えます。
3. 骨髄
   1. 損傷を与えずに、組織の親指鉗子を使用して、無傷の大腿骨を慎重につかみます。骨の洗い流しを容易にするために、近位大腿骨の端を鋭利なはさみで切り落とします。大腿骨を回し、大腿骨の間音のノッチの真ん中に23G針を置きます。穏やかな圧力を適用しながら、親指と人差し指の間で針を回転させて、骨腔に入るためにコンディルノッチに穴を開けます。
      注:場合によっては、骨の粒子は、フラッシュする前に、針の変更をフラッシュ中に不必要な高圧を避けるために、穴を掘削した後に針を妨害することができます。
   2. 10%FBS(またはフラッシュが白くなるまで)で6 mLのRPMIで骨を洗い流し、23G針を持つ10 mLの注射器を15 mLチューブに置いた70 μmの細胞ストレーナーに入れます。3 mLシリンジのプランジャーで細胞ストレーナーを通して骨髄を静かに押し込み、さらに3 mLのRPMIでストレーナーをすすます。
      注: すべての骨髄が完全に洗い流されると、ボーンは白く表示されます。
   3. 細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、RBCのリシスバッファーの5 mLにペレットを再懸濁させます。RTで5分間インキュベートし、10mLのPBSで溶精緩衝液を希釈して反応を停止する。
   4. 細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、上清を捨て、PBSの1 mLでペレットを再懸濁します。30 μmの細胞ストレーナーを使用して、凝固した細胞を除去するために新しい15 mLチューブに懸濁液を再フィルタします。トリパンブルー除外を使用して、ヘモサイトメーター上の生細胞の数を数えます。
4. 滑液組織
   1. 細かい外科用ハサミで小片に2つの滑液組織ブロックをサイコロ。培地でサンプルを15 mLチューブに移します。残りの細胞および滑液組織を得るためにRPMIの追加の0.5 mLで古い井戸をすすい、ハヤブサの管(最終容積2 mL)に移す。
      ヒント: このステップで直径が広がるチップの転写ピペットとカットを使用します。
   2. メーカーの指示に従って酵素およびアリコートを再構成する(例えば、リベラーゼ)。1単位/mL(サンプルあたり合計2単位)の最終濃度をもたらすのに十分な酵素を加えます。MACS回転器を使用して37°Cで2時間消化します。
   3. 新しい15 mLチューブに70 μmの細胞ストレーナーを通して10%FBSとフィルター細胞懸濁液でRPMIの8 mLを加えることによって消化を停止します。古い15 mLチューブを、同じ細胞ストレーナー(15 mL最終容積)に同じ細胞ストレーナーを介して10%のFCS培地およびフィルターセル懸濁液を用いて、RPMIの別の5 mLでリンスします。
   4. 細胞を回転させ(500 gx g、10分、RT)、上清を捨て、PBSの500 μLでペレットを再懸濁します。トリパンブルー除外を使用して、ヘモサイトメーター上の生細胞の数を数えます。

3. セルの割り当て

1. 2つの96ウェルプレート(Uボトム形状)に、組織の種類、動物ID、および指定抗体パネルをラベル付けします。このプロトコルでは、モノサイトサブセットパネル(細胞外染色)およびT細胞サブセットパネル(細胞外染色)とT細胞サブセットパネルの2つの抗体パネルが使用されています。
2. 各単一細胞懸濁液を使用して、ウェルあたり5 x 10⁵ 細胞を提供する。
   注:実験を設定する際には、グループおよび組織タイプごとに予想される細胞の絶対数を評価します(処理された動物は対照動物よりも組織の細胞数が多くなります)。単一細胞懸濁液を生成する最後のステップで細胞ペレットを再懸濁する場合、200 μLあたり5 x 10⁵ の濃度で終わるには、適切な量のPBSを選択してください。ここで使用される96ウェルプレートは最大300 μLを保持でき、通常、200 μLは、流出によるクロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えるのに理想的です。
3. 各パネルおよび組織タイプについて、明確にマークされたウェルに未染色コントロールとして少なくとも5 x 10⁵ 細胞を分配する。

4. 単球サブセットパネル

1. 生き生き性染色を行う:プレートスピナーを使用してスピンセル(500 x g、5分、4°C)を使用し、200 μLの1x PBSで細胞を1回洗浄します。1x PBSで1:50希釈した細胞非透過アミン反応性色素(生存性染色)のストック溶液を調製する。その後、このストック溶液の100 μLで細胞ペレットを再懸濁し、ウェル当たり2μLの生存性染色の絶対体積を得ます。光から保護された4°Cで15分間インキュベートします。
   注: 必要な生存性染色の最適な量は、用量滴定曲線を実行することによって決定する必要があります。さらに、希釈された生き生き性の汚れストック溶液は、1日で使用する必要があり、保存しないでください。製造能力染色の再構成、希釈、保管の方法については、製造元のマニュアルを参照してください。
2. インキュベーション中に、適切な量のFACSバッファー(Ca2+およびMg+フリーPBS(0.1%BSAおよび0.02%アジ化ナトリウムを含む)で抗体のカクテルを調製します。200 μL の FACS バッファー、遠心分離機 (500 x g、 5 分、4 °C) で細胞を 2 回洗浄し、各ペレットを抗体混合物または適切な対照混合物の 100 μL で再懸濁させます。光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
   注意:アジドナトリウムは細胞に有毒であることに注意してください。現在のプロトコルでは、フローバッファ内のアジドナトリウムの濃度は非常に低い(0.02%)サンプルは、このように染色した直後に実行され、問題を引き起こしません。並べ替えられた細胞の下流機能アッセイが計画されている場合、実験の毎日新鮮なFACSバッファーを構成し、アジ化ナトリウムを使用しないことが有益である可能性があります。多数の抗体を使用する場合、適切な量の「ブリリアントステインバッファー」を抗体のカクテルに添加して結果を高めることをお勧めします。
3. 200 μL の FACS バッファーで細胞を 2 回洗浄し、FACS + EDTA バッファー (1 mM EDTA を含む FACS バッファー) の 250 μL で細胞を再中断します。サンプルをラベル付き FACS チューブに転送します。サンプルを4°Cに保ち、取得するまで光から保護してください。
   注意:免疫細胞は粘着性を持つ傾向があります。閉塞のリスクとダブレット数の両方を最小限に抑えるために、最終フローバッファに1 mM EDTAを追加することをお勧めします。

5. T セルサブセットパネル

1. 生き生き性染色を行う:プレートスピナーを使用してスピンセル(500 x g、5分、4°C)を使用し、200 μLの1x PBSで細胞を1回洗浄します。1x PBSで1:50希釈した細胞非透過アミン反応性色素(生存性染色)のストック溶液を調製する。その後、このストック溶液の100 μLで細胞ペレットを再懸濁し、ウェル当たり2μLの生存性染色の絶対体積を得ます。光から保護された4°Cで15分間インキュベートします。
2. サンプルをインキュベートしながら、細胞外染色抗体カクテルを適切な量の1x FACSバッファで調製します。1x FACSバッファーの200 μLで細胞を2回洗浄し、それらをスピンダウン(500 x g、5分、4 °C)、各ペレットを抗体混合物または適切な対照混合物の100 μLで再懸濁させます。光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
3. メーカーの指示に従って、固定および透過性キットで細胞内染色を行います。200 μLの 1x FACS バッファで細胞を 2 回洗浄し、200 μL の固定バッファーで再中断します。光から保護された4°Cで40分間インキュベートします。
4. インキュベーション中に、抗体のカクテル(細胞内染色)を適切な体積の1倍の透過性および洗浄緩衝液で調製します。紡糸(750 x g、5分、4°C)で細胞を回収し、200 μLの1xパーミ/洗浄バッファーで細胞を2回洗浄します。
   注:固定および透過性は、適切にペレットに少し困難になりがちな細胞で結果を生じます。後続の洗浄工程で細胞損失を最小限に抑えるために、遠心力を750 x gに増 やします。あるいは、より長い回転サイクルを適用することもできます。しかし、これは細胞を準備するために必要なかなり長い時間をもたらすであろう。
5. スピンセル(750 x g、5分、4°C)を、各ペレットを抗体混合物または適切な対照混合物の100 μLで再懸濁します。光から保護された4°Cで40分間インキュベートします。
6. 200 μLの1パーマ/洗浄バッファーで細胞を2回洗浄し、FACS + EDTA バッファーの 250 μL で細胞を再懸濁します。サンプルをラベル付き FACS チューブに転送します。サンプルを4°Cに保ち、取得するまで光から保護してください。
   注:各抗体について、最適濃度は、用量滴定曲線を実行することによって決定される必要があります。抗体間の濃度は大きく異なる可能性があります:CD3とCD80は希釈係数1:1で使用され、CD11bとCD4は希釈因子1:6400で使用されました。抗体濃度を測定する場合は、実験中に使用される細胞と同じ数の細胞を使用します。

6. 補償、適切な管理およびガット

1. 実験の設定
   1. 最適な抗体濃度が決定されると、スペクトルのオーバーラップを調整するための補償のための染色されていない、単一の染色されたコントロールを実行します。
      注: セルと補正ビードの両方を使用して、すべての補正コントロールを実行します。報酬のために最も明るい結果(ポジティブイベントの最高MFI)を生成するものは何でも使用してください。MFIは平均蛍光強度を表し、生成されたシグナルの平均強度、したがって抗体発現のレベルを記述し、定義するためにしばしば使用される。
   2. 新しい多色実験を開始する際に、蛍光マイナス 1 (FMO) コントロールおよびアイソタイプ コントロールを実行します。FMOに関する詳細は、以前に公開されています¹⁹.
   3. 各組織タイプの未染色制御で白血球集団を検出するために最適なフォワードスキャッタ領域(FSC-A)電圧およびサイドスキャッタエリア(SSC-A)電圧を決定します。
      注: 固定および透過プロセスは、セルの寸法を変更します。したがって、単球サブセットパネルとTセルサブセットパネルのFSC-AおよびSSC-A電圧は大きく異なります。Tセルサブセットパネルの最適な電圧を求めるには、CD3で単一染色されたセルと白血球集団に向かってバックゲートを使用し、FSC-A値とSSC-A値を調整します。
2. ギャッティング戦略
   1. 最適なFSC-AおよびSSC-A電圧が決定されたら、白血球集団にプライマリゲートを設置します。
      注:各実験の前に、製造業者の指示に従ってキャリブレーションビーズを使用してサイトメーターを較正し、染色されていないビーズを実行します。異なる時点の白血球集団は、FSCおよびSSC特性に匹敵する(組織タイプ間のわずかな違いが予想され、正常である)を有するべきである。FSCとSSCが大きな問題を抱えている場合は、サイトメーターとサンプル生成を撮影します。
   2. ダブルを除外: プロット FSC-A (y 軸) と FSC-H (x 軸) をプロットします。シングルは、このプロットの対角線として表示されます。シングルのゲート。
   3. 死細胞を除外: プロット FVS510 (生存性染色) (x 軸) および FSC-A (y 軸).死んだ細胞はポジティブなイベントとして現れ、したがって生きた細胞にゲートします。
      注: 真の負のセルは、未染色のコントロールに表示されます。したがって、染色されていないコントロールを実行する際に、サンプルの各セットに対してこのゲートを調整します。さらなる格紙は、調査される抗体パネルおよび細胞タイプに依存する。このプロトコルで使用される各パネルのギャティング戦略は、それぞれ 図1 と 図4にあります。

結果

単球サブセットパネルとT細胞サブセットパネルの両方からの代表的な結果を以下に説明する。

図1 は、DMM処理動物の骨髄から集められた免疫細胞上の単球サブセットパネルの階層格紙戦略を示す。同じ戦略が使用され、他のすべての組織タイプで検証されました.実験を設定する際、各組織タイプに対してフォワード散乱面積(FSC-A)と側散乱面積(SSC-A...

ディスカッション

このプロトコルに記載されている方法は、変形性関節症(OA)のマウスモデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節、滑膜組織の中の単球/マクロファージおよびT細胞の両方から様々なサブセットを確実に同定するように設計され、テストされた。現在のプロトコルは、抗体を交換することによって異なる組織タイプ、または他の細胞タイプを調査するために容易に変更することができ、OAの代?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst	BD	566385	Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	Monocyte Panel
Liberase, Research Grade	Roche	5401127001	Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg	BD	564985	Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg	BD	562454	Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg	BD	742274	T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg	BD	565250	Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg	BD	563061	T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg	BD	557596	T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg	BD	552775	T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg	BD	565480	T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg	BD	565261	T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg	BD	740664	T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg	BD	563687	Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg	BD	563332	T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg	BD	565411	Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg	BD	560408	T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg	BD	563414	Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg	BD	560593	Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg	BD	560600	Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg	BD	564143	T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg	BD	562894	T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer	N/A	N/A	Buffers	Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100Tst	BD	562574	Buffers