Analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo di citometria di flusso dettagliato e riproducibile per identificare sottoinsiemi monociti/macrofamiglia e t-cell utilizzando saggi di colorazione extra e intracellulare all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale, utilizzando un modello chirurgico stabilito di osteoartrite murina.

Abstract

L'osteoartrite (OA) è una delle malattie muscolo-scheletriche più diffuse, che colpisce i pazienti affetti da dolore e limitazioni fisiche. Prove recenti indicano una potenziale componente infiammatoria della malattia, sia con cellule T che monociti/macrofagi potenzialmente associati alla patogenesi dell'OA. Ulteriori studi postularono un ruolo importante per sottoinsiemi di entrambi i lignaggi delle cellule infiammatorie, come i linfociti di Th1, Th2, Th17 e T-regulatory, e M1, M2 e macrofagi residenti con tessuto sinovi. Tuttavia, l'interazione tra la risposta cellulare infiammatoria sinoviale locale e sistemica e i cambiamenti strutturali nell'articolazione è sconosciuta. Per comprendere appieno il modo in cui le cellule T e i monociti/macrofagi contribuiscono all'OA, è importante essere in grado di identificare quantitativamente queste cellule e i loro sottoinsiemi contemporaneamente nel tessuto sinoviale, negli organi linfatici secondari e sistemicamente (la milza e il midollo osseo). Al giorno d'oggi, i diversi sottoinsiemi di cellule infiammatorie possono essere identificati da una combinazione di marcatori di superficie cellulare che fanno della citometria del flusso multi colore una potente tecnica nello studiare questi processi cellulari. In questo protocollo, descriviamo passi dettagliati per quanto riguarda il raccolto di tessuto sinoviale e organi linfatici secondari, nonché la generazione di sospensioni a singola cellula. Inoltre, presentiamo sia un saggio di colorazione extracellulare per identificare i monociti/macrofagi e i loro sottoinsiemi, sia un saggio di colorazione extra e intracellulare per identificare le cellule T e i loro sottoinsiemi all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale. Ogni fase di questo protocollo è stata ottimizzata e testata, con conseguente analisi altamente riproducibile che può essere utilizzata per altri modelli di mouse OA chirurgici e non chirurgici.

Introduzione

L'osteoartrite (OA) è una malattia debilitante e dolorosa che coinvolge varie patologie di tutti i tessuti associati all'articolazione¹. Colpisce circa il 3,8% della popolazione mondiale², OA è una delle malattie muscolo-scheletriche più diffuse ed è quello di diventare la^{4a causa leader di} disabilità in tutto il mondo entro il 2020³. L'OA post-traumatico si verifica dopo un infortunio articolare e rappresenta almeno il 12% di tutto l'OA e fino al 25% di OA in articolazioni suscettibili come^{il ginocchio 4,5}. Inoltre, lesioni articolari aumenta il rischio di vita di OA di più di cinque volte⁶. Non tutti gli infortuni con instabilità apparentemente simile andranno a sviluppare OA, e quindi la definizione dei fattori che guidano il rischio di OA a lungo termine rimane difficile. È fondamentale per sviluppare trattamenti efficaci per prevenire e/o trattare l'OA post-traumatico, per indagare e definire meglio la patologia, le cause e i meccanismi specifici della lesione che predispongono all'OA¹.

OA e la sua distruzione della cartilagine che definisce è stata precedentemente attribuita interamente allo stress meccanico e, pertanto, OA è stata considerata una malattia non infiammatoria². Tuttavia, studi più recenti hanno mostrato un'infiltrazione infiammatoria delle membrane sinoviali e un aumento delle cellule infiammatorie nel tessuto sinoviale nei pazienti con OA rispetto ai controlli^{sani 2}, facendo luce su un componente infiammatorio come potenziale forza motrice in OA. Ulteriori studi hanno indicato che le anomalie sia nel profilo delle cellule T CD4 che in quello del CD8, nonché nei monociti/macrofagi del sistema immunitario innato possono contribuire alla patogenesi di OA^2,7. Indagini dettagliate su queste anomalie hanno rivelato ruoli rilevanti per vari sottoinsiemi di cellule T², come Th1⁸, Th2⁹, Th17⁸ e T regulatory (Treg)^{popolazioni 10,11}. Nonostante questa prova convincente, la relazione causale tra l'alterazione delle risposte delle cellule T e lo sviluppo e la progressione dell'OA è ancora sconosciuta².

Oltre a specifiche cellule T che hanno un ruolo nell'OA, studi recenti suggeriscono che macrofagi polarizzati/attivati in modo differenziale possono essere associati alla patogenesi dell'OA¹². In particolare, i macrofagi provenienti dai monociti del sangue si accumulano nel sinovio e si polarizzano in macrofagi attivati in modo classico (M1) o in alternativa macrofagi attivati (M2) durante lo sviluppo dell'OA, implicando una correlazione tra macrofagi derivati da monociti e OA¹³. Al contrario, alcuni sottoinsiemi di macrofagi popolano gli organi precocemente durante lo sviluppo e si autosufficiano il loro numero in una materia indipendente^{monocita 14}. Recentemente, una funzione di protezione articolare mediata da una barriera a giunzione stretta è stata mostrata per questi macrofagi residenti con tessuto sinoviale (STRMs)¹⁴. Questi risultati indicano che le anomalie in particolare i sottoinsiemi di macrofagio possono svolgere un ruolo cruciale durante lo sviluppo dell'OA. Tuttavia, le interazioni tra questa risposta cellulare infiammatoria e i cambiamenti strutturali nell'articolazione successiva al trauma sono sconosciute.

Storicamente, l'analisi delle cellule immunitarie nel tessuto sinoviale era limitata all'immunohistochimica (IHC) o all'espressione dell'mRNA mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR)^{si avvicina 15,16}. Tuttavia, sia IHC che RT-PCR non hanno la capacità di identificare più tipi di cellule diverse e i loro sottoinsiemi contemporaneamente, limitando così l'applicabilità di questi metodi. Inoltre, L'IHC è limitato all'analisi di piccoli campioni di tessuto e può perdere accumuli di cellule infiammatorie focali. Nel corso degli ultimi anni, è stata sviluppata una miriade di marcatori di superficie per vari tipi di cellule, e sottoinsiemi di cellule immunitarie possono ora essere identificati in modo affidabile da combinazioni distinte di questi marcatori. A causa del costante progresso tecnico, i citometri di flusso sono ora in grado di identificare una moltitudine di diversi fluorocromi che consentono contemporaneamente l'analisi di grandi pannelli anticorpali multicolore.

La citometria del flusso fornisce ai ricercatori una potente tecnica che consente l'identificazione simultanea e la quantificazione di una moltitudine di cellule immunitarie e dei loro sottoinsiemi a livello di singola cellula. Abbiamo sviluppato e ottimizzato sia un saggio di colorazione extracellulare per identificare monociti/macrofagi e i loro sottoinsiemi, sia un saggio di colorazione extra/intracellulare per identificare le cellule T e i loro sottoinsiemi all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale. Ogni fase di questo protocollo è stato ottimizzato e testato con conseguente un saggio altamente riproducibile che può essere utilizzato per altri modelli di mouse OA chirurgici e non^{chirurgici 17}.

Protocollo

Il Comitato Etico Animale del Distretto Sanitario Locale di Sydney Settentrionale ha approvato tutte le procedure menzionate nel presente protocollo. I topi sono alloggiati e curati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali di laboratorio (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/6 maschi di 10-12 settimane.

NOTA: Per indurre oA post-traumatica, è stata eseguita la destabilizzazione chirurgica del menisco mediale (DMM) nell'articolazione di soffocamento destra. Informazioni dettagliate su questo modello animale sono state pubblicate da Glasson et^al. In breve, l'anestesia generale è indotta in una camera di induzione utilizzando isoflurane e successivamente mantenuta utilizzando un cono naso. La gamba chirurgica viene rasata con una lama di rasoio e il sito chirurgico viene lavato e tamponato con etanolo per ridurre al minimo la contaminazione. L'animale viene quindi spostato al microscopio operativo e posto su un asciugamano sterile e la gamba drappeggiata con drappeggio di carta sterile per isolare il sito chirurgico e ridurre al minimo la contaminazione. Utilizzando il microscopio, viene realizzata una para-patella artrotomia mediale di 0,5 cm, la rotula luxated lateralmente, e il cuscinetto grasso infra-patella elevato per esporre il legamento menisco-tibiale mediale, che viene transected con forcelle di dissezione. L'articolazione viene lavata con salina sterile per rimuovere il sangue e la ferita viene chiusa in tre strati : capsula articolare, tessuto sottocutaneo (utilizzando materiale di sutura) e pelle (utilizzando colla tissurale chirurgica). I metodi descritti in questo protocollo, tuttavia, possono essere applicati ad altri modelli e metodi per indurre OA. OA può essere indotto in entrambi i lati dell'animale, e quando si raccolgono i tessuti, è importante raccogliere i linfonodi ipsilateri (drenaggio).

1. Isolamento della milza, midollo osseo contralaterale, linfonodi ipsilaterali che drenano il tessuto soffocante e sinoviale

1. Eutanasia del topo per lussazione cervicale. Posizionare il topo in una posizione supina sotto un microscopio sezionante e pulire il torace, l'addome e le gambe con il 70% di etanolo. Aprire con attenzione la pelle sulla linea mediana per la lunghezza dell'addome utilizzando forbici dritte lasciando intatta la cavità addominale.
2. Tirare delicatamente la pelle sul lato destro dell'animale lontano dal muscolo sottostante lasciando il tessuto adiposo sottocutaneo attaccato alla pelle. Normalmente, la trazione delicata da sola separerà la pelle e il tessuto adiposo sottostante dal muscolo. Le aderiscezioni sporadiche devono essere tagliate con forbici fini al fine di mantenere la tensione necessaria per separare i tessuti al minimo e ridurre la possibilità di danneggiare i linfonodi. Identificare un incrocio di tre vasi prendendo delicatamente in giro il tessuto adiposo situato sulla coscia utilizzando due forcelle curve sottili. Il linfonodo inguinale si trova all'incrocio e può essere identificato dalla sua forma ovoide e dal colore leggermente più scuro.
3. Rimuovere il linfonodo inguinale usando le forcepi di sezionazione fine. Fare attenzione a non rompere la capsula. Rimuovere il grasso rimanente sulla superficie del linfonodo con le force e le force.
4. Aprire la cavità addominale e identificare la milza. Tagliare la milza con forbici fini. Tirare delicatamente l'intestino da parte per esporre l'aorta e la sua biforcazione facendo attenzione a non danneggiarli, al fine di ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Il linfonodo iliacco è situato nel segmento terminale dell'aorta addominale e l'origine dell'arteria iliaca comune. Rimuovere il linfonodo iliac destro e procedere come descritto al 1.3.
5. Rimuovere delicatamente la pelle di entrambi gli arti posteriori. Dizionare il femore sinistro pulerlo dal tessuto muscolare usando la lama e le forbici fini. Scollegare con attenzione sia l'articolazione soffocare che l'articolazione dell'anca lasciando intatto l'intero osso e rimuovere il femore.
6. Identificare il tendine rotuleo dell'articolazione soffocante destra, quindi rimuovere il tessuto muscolare adiacente prossimale a questo utilizzando forbici fini fino a quando circa 5mm di tendine quadricipite prossima alla rotula è esposto. Successivamente, tagliare il tendine del quadricipite circa 3-4mm prossimale alla rotula per formare una maniglia e utilizzando le forcelli sottili tirare delicatamente lontano dall'articolazione. Questo renderà visibili i bordi dell'attaccamento della capsula articolare al femore, e utilizzando una lama del bisturi tagliata con cura lungo i bordi della capsula articolare su entrambi i lati, a partire dal femore che va verso la tibia, al fine di massimizzare la quantità di membrana sinoviale che viene raccolta. Durante il taglio è importante mantenere una trazione delicata sul tendine del quadricipite e mettere in pausa quando il blocco di tessuto sinoviale è attaccato solo alla tibia. In questa fase il cuscinetto di grasso intraarticolare è ora chiaramente visibile distale alla rotula e può essere delicatamente staccato dall'articolazione e dall'aspetto anteriore del menisci utilizzando la lama. Successivamente, tagliare lungo la parte rimanente della capsula articolare (porzione tibicale) per rimuovere il blocco di tessuto sinoviale.
   NOTA: Questo passaggio deve essere fatto in modo molto preciso per consentire risultati affidabili. Dopo aver completato la dissezione, il "blocco di tessuto sinoviale" dovrebbe consistere nella rotula, nel tendine della rotula, nel cuscinetto grasso inppoderale, nel rivestimento sinoviale supra e infrapatellar e nella capsula articolare associata anteriore ai legamenti collaterali. Mantenere tutti i tessuti umida durante la dissezione utilizzando la soluzione salina dello 0,9%.
   NOTA: Inserire ogni campione di blocco di tessuto sinoviale in un pozzo separato di una piastra da 24 possidbili etichettata contenente 1,5 ml di RPMI 1640 medio. Unire sia il liaco che il linfonodo inguinale in un pozzo e mettere in comune i tessuti di due topi.

2. Generazione di sospensioni a singola cellula da ciascun tessuto

NOTA: Per garantire un numero sufficiente di cellule per l'analisi del flusso, è necessario mettere in comune i tessuti sinoviali di due topi. Nell'attuale protocollo, mettere in comune tutti i tessuti degli stessi due topi per mantenere l'analogia. Inoltre, i linfonodi iliac e inguinali sono stati combinati per ogni animale con un totale di 4 linfonodi per ogni campione. In generale, i numeri cellulari nella milza, nel midollo osseo e nei linfonodi di un animale sono sufficienti per condurre l'analisi del flusso e il protocollo può essere applicato. Tuttavia, quando si utilizzano tessuti da un solo animale, potrebbe essere necessario regolare i tempi di llysing.

1. La milza
   1. Posizionare le due milza in pool su un colino a cellule da 70 m sopra un tubo da 15 mL. Macerare delicatamente le milza attraverso il filtro mesh utilizzando uno stantuffo sterile di siringa da 3 mL. Lavare frequentemente il colino con un totale di 6 mL di RPMI 1640 medio integrato con 10% FBS.
   2. Far girare le cellule (500 x g, 5 min, RT) e risspendere il pellet in 5 mL di globuli rossi (RBC) lysis buffer. Incubare per 5 min a RT e fermare la reazione diluendo il tampone di lisi con 10 mL di PBS. Ruotare le celle (500 x g, 5 min, RT) e ripetere questo passaggio una volta o fino a quando non ci sono più RBC nel pellet.
      NOTA: Rifilo la sospensione utilizzando un colino per cellule da 30 m in un nuovo tubo da 15 mL tra i due cicli di laliggio per rimuovere le cellule coagulate.
   3. Una volta completata la lissidazione, far girare le celle (500 x g, 5 min, RT), scartare il supernatant e risalire il pellet in 1 mL di PBS. Contare il numero di celle vive su un emocitometro utilizzando l'esclusione blu Trypan.
2. I linfonodi
   1. Posizionare i quattro linfonodi in pool su un colino a cellule di 70 m sopra un tubo da 15 mL. Prendere delicatamente in giro i linfonodi a parte in una sospensione a singola cellula premendo con uno stantuffo sterile di siringa da 3 mL. Lavare frequentemente il colino con un totale di 6 mL di RPMI con 10% FBS.
   2. Far girare le cellule (500 x g, 5 min, RT), scartare il supernante e risuspendere il pellet in 500 L di PBS. Rifilo la sospensione utilizzando un colino per cellule da 30 m in un nuovo tubo da 15 mL per rimuovere le cellule coagulate. Contare il numero di celle vive su un emocitometro utilizzando l'esclusione blu Trypan.
3. Il midollo osseo
   1. Afferrare con cura il femore intatto usando un pollice tissutale senza fratturarlo. Tagliare l'estremità del femore prossimale con una forbice affilata al fine di facilitare lo sciacquone dell'osso. Girare il femore e posizionare un ago di 23 G al centro della tacca interconditare del femore. Durante l'applicazione di una leggera pressione ruotare l'ago tra il pollice e l'indice per praticare un foro nella tacca interconditare per entrare nella cavità ossea.
      NOTA: A volte le particelle dell'osso possono ostruire l'ago dopo aver forato il foro, per evitare un'alta pressione non necessaria durante lo sciacquone di un cambio di ago prima di sciacquare.
   2. Sciacquare l'osso con 6 mL di RPMI con 10% FBS (o fino a quando lo sciacquone diventa bianco) utilizzando una siringa da 10 mL con un ago da 23 G su un colino a cellule da 70 m che viene posto su un tubo da 15 mL. Premere delicatamente il midollo osseo attraverso il colino cellulare con uno stantuffo di siringa da 3 mL e sciacquare il colino con altri 3 mL di RPMI.
      NOTA: Le ossa dovrebbero apparire bianche una volta che tutto il midollo è stato lavato completamente.
   3. Ruotare le celle (500 x g, 5 min, RT) e rissuspendere il pellet in 5 mL di buffer di lysi RBC. Incubare per 5 min a RT e fermare la reazione diluendo il tampone di lisi con 10 mL di PBS.
   4. Far girare le celle (500 x g, 5 min, RT), scartare il supernante e risundere il pellet in 1 mL di PBS. Rifilo la sospensione utilizzando un colino per cellule da 30 m in un nuovo tubo da 15 mL per rimuovere le cellule coagulate. Contare il numero di celle vive su un emocitometro utilizzando l'esclusione blu Trypan.
4. Il tessuto sinoviale
   1. Tagliare a dadini i due blocchi di tessuto sinoviale in piccoli pezzi con una forbice chirurgica fine. Trasferire i campioni con mezzo in un tubo da 15 mL. Risciacquare il vecchio pozzo con ulteriori 0,5 mL di RPMI per ottenere le cellule rimanenti e tessuti sinoviali, trasferire al tubo di falco (volume finale 2 mL).
      SUGGERIMENTO: Utilizzare una pipetta di trasferimento e tagliare la punta in cui il diametro si allarga in questo passaggio.
   2. Ricostituire l'enzima e l'aliquot secondo le istruzioni del produttore (ad esempio, Liberase). Aggiungere un enzima sufficiente per ottenere una concentrazione finale di 1 unità/mL (un totale di 2 unità per campione). Digerire a 37 gradi centigradi per 2 h utilizzando un rotore MACS.
   3. Fermare la digestione aggiungendo 8 mL di RPMI con 10% FBS e filtrare le sospensioni delle cellule attraverso un colino a cellule da 70 m in un nuovo tubo da 15 mL. Risciacquare il vecchio tubo da 15 mL con altri 5 mL di RPMI con 10% di supporto FCS e filtrare le sospensioni delle cellule attraverso lo stesso colino cellulare nel nuovo tubo (15 mL volume finale).
   4. Far girare le cellule (500 x g, 10 min, RT), scartare supernante e risuspendere il pellet in 500 L di PBS. Contare il numero di celle vive su un emocitometro utilizzando l'esclusione blu Trypan.

3. Allocazione delle cellule

1. Etichettare due piastre da 96 alimenti (forma U-bottom) con tipo di tessuto, ID animale e pannello anticorpale designato. In questo protocollo vengono utilizzati in totale due pannelli anticorpo: pannello sottoinsieme Monocite (colorazione extracellulare) e pannello sottoinsieme di cellule T (colorazione extra e intracellulare).
2. Fornire 5 x 10^{5 celle} per pozzo utilizzando le rispettive sospensioni a singola cellula.
   NOTA: durante l'impostazione dell'esperimento, valutare il numero assoluto di cellule previsto per gruppo e tipo di tessuto (gli animali trattati hanno un numero di cellule più elevato nei tessuti rispetto agli animali di controllo). Quando si riempì il pellet cellulare durante l'ultima fase di generazione di sospensioni a singola cella, scegliere una quantità appropriata di PBS per ottenere una concentrazione di 5 x^{10 5} per 200 L. La piastra di 96 po 'ben utilizzata qui può contenere un massimo di 300 L e, in genere, 200 L è ideale per ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata a causa di fuoriuscite.
3. Per ogni pannello e tipo di tessuto, distribuire almeno 5 x 10⁵ cellule come controlli non contenuti in pozzi che sono stati chiaramente contrassegnati.

4. Pannello Sottoinsieme Monocite

1. Eseguire la colorazione della fattibilità: Girare le celle (500 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) utilizzando un filatore piatto e lavare le cellule una volta con 200 L di 1x PBS. Preparare una soluzione stock di colorante amine-reattivo cellulare (macchia di vitalità) diluito 1:50 in 1x PBS. Successivamente, risundere i pellet cellulari con 100 L di questa soluzione di stock con conseguente un volume assoluto di 2 L di macchia di vitalità per pozzo. Incubare per 15 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
   NOTA: La quantità ottimale di macchia di vitalità necessaria deve essere determinata eseguendo una curva di titolazione della dose. Inoltre, la soluzione di stoccaggio della macchia di vitalità diluita deve essere utilizzata in un solo giorno e non deve essere immagazzinata. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per ulteriori informazioni su come ricostituire, diluire e conservare la macchia di vitalità.
2. Durante l'incubazione, preparare il cocktail di anticorpi in un volume appropriato di tampone FACS (CA2 e MgTM PBS libero contenente 0,1% BSA e 0,02% azide di sodio). Lavare le cellule due volte con 200 L di tampone FACS, centrifuga (500 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) e risuspendere ogni pellet con 100 L della miscela di anticorpi o una miscela di controllo appropriata. Incubare per 30 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
   NOTA: Si prega di essere consapevoli del fatto che l'azide di sodio è tossico per le cellule. Nell'attuale protocollo la concentrazione di azide di sodio nel buffer di flusso è molto bassa (0,02%) e i campioni vengono eseguiti immediatamente dopo la colorazione, senza causare alcun problema. Se sono pianificati saggi funzionali a valle delle cellule ordinate, potrebbe essere utile creare un buffer FACS fresco ogni giorno di esperimenti e non utilizzare alcun azide di sodio. Quando si utilizza una moltitudine di anticorpi, si consiglia di aggiungere una quantità appropriata di "Brilliant Stain Buffer" al cocktail di anticorpi per migliorare i risultati.
3. Lavare le celle due volte con 200 L di buffer FACS e rispendere le cellule in 250 l di FACS - buffer EDTA (buffer FACS contenente 1 mM EDTA). Trasferire i campioni in tubi FACS etichettati. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi e protetti dalla luce fino all'acquisizione.
   NOTA: Le cellule immunitarie hanno la tendenza ad essere appiccicose. Per ridurre al minimo sia il rischio di blocco che il numero di doppiette si consiglia di aggiungere 1 mM EDTA al buffer di flusso finale.

5. T Pannello Sottoinsieme di celle

1. Eseguire la colorazione della fattibilità: Girare le celle (500 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) utilizzando un filatore piatto e lavare le cellule una volta con 200 L di 1x PBS. Preparare una soluzione stock di colorante amine-reattivo cellulare (macchia di vitalità) diluito 1:50 in 1x PBS. Successivamente, risundere i pellet cellulari con 100 L di questa soluzione di stock con conseguente un volume assoluto di 2 L di macchia di vitalità per pozzo. Incubare per 15 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
2. Durante l'incubazione dei campioni, preparare il cocktail di anticorpi di colorazione extracellulare in un volume appropriato di 1x tampone FACS. Lavare le cellule due volte con 200 L di 1x tampone FACS, girarle verso il basso (500 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) e risvegliare ogni pellet con 100 L della miscela di anticorpi o di un'adeguata miscela di controllo. Incubare per 30 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
3. Eseguire la colorazione intracellulare con un kit di fissazione e permeabilizzazione seguendo le istruzioni del produttore. Lavare due volte le celle con 200 L di 1x buffer FACS e rispendere in 200 L di buffer di fissaggio. Incubare per 40 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
4. Durante l'incubazione, preparare il cocktail di anticorpi (colorazione intracellulare) in un volume appropriato di 1x permeabilizzazione e tampone di lavaggio. Raccogliere le cellule ruotando (750 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) e lavando le cellule due volte con 200 L di 1x perm/buffer di lavaggio.
   NOTA: La fissazione e la permeabilizzazione si trassolvono in cellule che tendono ad essere un po' più difficili da pellet correttamente. Al fine di ridurre al minimo la perdita di cellule durante le successive fasi di lavaggio, aumentare la forza centrifuga a 750 x g. In alternativa potrebbe essere applicato anche un ciclo di filatura più lungo. Tuttavia, ciò si tradurrebbe in un tempo notevolmente più lungo necessario per preparare le cellule.
5. Celle di rotazione (750 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) e risuspendo ogni pellet con 100 L della miscela anticorpo o miscela di controllo appropriata. Incubare per 40 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
6. Lavare le cellule due volte con 200 L di 1x perm/buffer di lavaggio e rispendere le cellule in 250 L di FACS - buffer EDTA. Trasferire i campioni in tubi FACS etichettati. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi e protetti dalla luce fino all'acquisizione.
   NOTA: Per ogni anticorpo è necessario determinare la concentrazione ottimale eseguendo una curva di titolazione della dose. La concentrazione tra anticorpi può differire drasticamente: CD3 e CD80 sono stati utilizzati con un fattore di diluizione di 1:1, mentre CD11b e CD4 sono stati utilizzati con un fattore di diluizione di 1:6400. Quando si titrating la concentrazione di anticorpi utilizzare lo stesso numero di cellule che verranno utilizzati durante gli esperimenti.

6. Compensazione, controlli appropriati e gating

1. Impostazione dell'esperimento
   1. Una volta che la concentrazione ottimale di anticorpi è stata determinata eseguire controlli non macchiati e singoli controlli macchiati per la compensazione per regolare la sovrapposizione spettrale.
      NOTA: eseguire tutti i controlli di compensazione con entrambe le celle e perline di compensazione. Utilizzare tutto ciò che genera i risultati più brillanti (MFI più alto di eventi positivi) per la compensazione. MFI è l'acronimo di intensità media di fluorescenza ed è spesso usato per descrivere e definire l'intensità media del segnale generato e, quindi, il livello di espressione anticorpo.
   2. Eseguire la fluorescenza meno uno (FMO) controlli e controlli isotipi quando si avvia un nuovo esperimento multicolore. Ulteriori dettagli riguardanti FMO sono stati precedentemente pubblicati¹⁹.
   3. Determinare la tensione ottimale dell'area di dispersione in avanti (FSC-A) e la tensione SSC-A (Side Scatter Area) al fine di rilevare la popolazione di leucocitoli in controlli non macchiati di ogni tipo di tessuto.
      NOTA: il processo di fissazione e permeabilizzazione altera le dimensioni della cella. Pertanto, le tensioni FSC-A e SSC-A per il pannello Monocyte Subset e T Cell Subset Panel differiscono notevolmente. Per trovare le tensioni ottimali per il T Cell Subset Panel, utilizzare celle che sono state macchiate singole con CD3 e back gate verso le popolazioni di leucocati mentre si regolano i valori FSC-A e SSC-A.
2. Strategia di Gating
   1. Una volta determinata la tensione ottimale FSC-A e SSC-A, impostare un cancello primario sulla popolazione di leucocid.
      NOTA: Prima di ogni esperimento calibrare il citometro utilizzando perline di calibrazione secondo le istruzioni del produttore ed eseguire perline non contenute. Le popolazioni di leucocenza di diversi punti di tempo dovrebbero avere proprietà FSC e SSC comparabili (sono previste lievi differenze tra i tipi di tessuto e normali). Se FSC e SSC variano notevoli difficoltà sparare il citometro e la generazione del campione.
   2. Escludi doppi: stampa FSC-A (asse y) e FSC-H (asse x). Le singole vengono visualizzate come una diagonale di questo grafico. Cancello su singlet.
   3. Escludi cella morta: traccia FVS510 (macchia di vitalità) (asse x) e FSC-A (asse y). Le cellule morte appariranno come eventi positivi, quindi cancello su cellule vive.
      NOTA: le celle negative vere saranno visibili nei controlli non macchiati. Pertanto, regolare questo cancello per ogni set di campioni quando si eseguono i controlli non macchiati prima di campioni macchiati. L'ulteriore gating dipende dal pannello anticorpo e dal tipo di cellula che viene studiato. Le strategie di Gating per ogni pannello utilizzato in questo protocollo sono disponibili rispettivamente nella Figura 1 e nella Figura 4.

Risultati

Di seguito sono descritti i risultati rappresentativi del pannello Sottoinsieme monocito e del pannello Sottoinsieme di celle t.

La figura 1 illustra la strategia gerarchica di gating per il pannello del sottoinsieme di monociti sulle cellule immunitarie raccolte dal midollo osseo degli animali trattati con DMM. La stessa strategia è stata utilizzata e verificata in tutti gli altri tipi di tessuto. Durante l'impostazione dell'esperimento, è stata determinata la ...

Discussione

I metodi descritti in questo protocollo sono stati progettati e testati per identificare in modo affidabile vari sottoinsiemi sia da monociti/macrofagi che da cellule T all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale in un modello murino di osteoartrite (OA). L'attuale protocollo può essere facilmente modificato per studiare diversi tipi di tessuto, o altri tipi di cellule scambiando anticorpi, e può essere utilizzato per modelli murini alternativi di OA. Quando si testano altri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst	BD	566385	Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	Monocyte Panel
Liberase, Research Grade	Roche	5401127001	Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg	BD	564985	Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg	BD	562454	Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg	BD	742274	T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg	BD	565250	Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg	BD	563061	T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg	BD	557596	T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg	BD	552775	T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg	BD	565480	T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg	BD	565261	T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg	BD	740664	T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg	BD	563687	Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg	BD	563332	T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg	BD	565411	Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg	BD	560408	T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg	BD	563414	Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg	BD	560593	Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg	BD	560600	Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg	BD	564143	T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg	BD	562894	T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer	N/A	N/A	Buffers	Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100Tst	BD	562574	Buffers