Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ציטומיטרי זרימה מפורט ושחזור כדי לזהות מונוציט / מקרופאג ותת-תאים T-ערכות באמצעות שניהם אקסטרה-ותוך תאי כתמים כתמים בתוך הטחול murine, מח עצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial, ניצול מודל כירורגי מבוסס של דלקת מפרקים ניוונית מורין.

Abstract

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא אחת המחלות הנפוצות ביותר של השלד והגוף, המשפיעה על חולים הסובלים מכאב ומגבלות פיזיות. ראיות אחרונות מצביעות על מרכיב דלקתי פוטנציאלי של המחלה, עם שני תאי T ו monocytes / מקרופאגים פוטנציאל הקשורים פתוגנזה של OA. מחקרים נוספים הניחו תפקיד חשוב עבור ערכות משנה של תוחומים תאי דלקתיים, כגון Th1, Th2, Th17, ו לימפוציטים T-רגולטוריים, ו M1, M2, ו סינוביום-רקמת-תושב מקרופאגים. עם זאת, האינטראקציה בין התגובה הסלולרית המקומית והמערכתית והשינויים המבניים במפרק אינה ידועה. כדי להבין באופן מלא כיצד תאי T ומונוציטים/מקרופאגים תורמים ל-OA, חשוב להיות מסוגלים לזהות באופן כמותי תאים אלה ואת תת-התת-סטים שלהם בו זמנית ברקמת סינוביאלית, באיברים לימפה משניים ובאופן שיטתי (הטחול ומח העצם). כיום, ניתן לזהות את תת-קבוצות המשנה של תאים דלקתיים שונים על-ידי שילוב של סמנים של פני תא, מה שהופך את ציטומטריית זרימה מרובת צבעים לטכניקה רבת עוצמה בחקירת תהליכים תאיים אלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים צעדים מפורטים לגבי הקציר של רקמת סינוביאלית ואיברים לימפה משניים, כמו גם דור של מתלים תא יחיד. יתר על כן, אנו מציגים גם תסיסה כתמים חוץ תאית כדי לזהות מונוציטים / מקרופאגים ואת תת-ערכות שלהם, כמו גם תסיסה כתם חוץ-תאי נוסף כדי לזהות T-תאים ואת תת-ערכות שלהם בתוך הטחול murine, מח העצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial. כל שלב בפרוטוקול זה היה אופטימיזציה ונבדק, וכתוצאה מכך תוואי מאוד לשחזור שניתן להשתמש בו עבור דגמי עכבר OA כירורגיים ולא כירורגיים אחרים.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה מתישה וכואבת מעורבים פתולוגיות שונות של כל הרקמות הקשורות למפרק1. OA היא אחת ממחלות השלד והקודמותהנפוצותביותר, והיא תהפוך לגורם הרביעי המוביללנכות ברחבי העולם עד 20203. OA פוסט טראומטי מתרחש לאחר פציעה משותפת ומחשבונות לפחות 12% של כל OA ועד 25% של OA במפרקים רגישים כגוןהברך 4,5. יתר על כן, פציעה משותפת מגבירה את הסיכון לכל החיים של OA על ידי יותר מחמשפעמים 6. לא כל הפציעות עם חוסר יציבות דומה לכאורה ימשיך לפתח OA, ולכן הגדרת גורמים המניעים את הסיכון לטווח ארוך OA נשאר מאתגר. זה חיוני על מנת לפתח טיפולים יעילים כדי למנוע ו / או לטפל OA פוסט טראומטי, כדי לחקור ולהגדיר טוב יותר את הפתולוגיה ספציפית לפציעה, גורמים, ומנגנונים הנטייה OA1.

OA והרס הסחוס המגדיר שלה יוחס בעבר כולו ללחץ מכני, ולכן, OA נחשב מחלה לא דלקתית2. עם זאת, מחקרים עדכניים יותר הראו חדירה דלקתית של קרום synovial ועלייה של תאים דלקתיים ברקמת synovial בחולים עם OA לעומתפקדים בריאים 2, שפיכת אור על רכיב דלקתי ככוח מניע פוטנציאלי בOA. מחקרים נוספים הראו כי חריגות הן CD4+ ו CD8+ T-cell פרופיל, כמו גם מונוציטים / מקרופאגים של המערכת החיסונית המולדת עשוי לתרום פתוגנזה של OA2,7. חקירות מפורטות של חריגות אלה חשפו תפקידים רלוונטיים עבור קבוצות משנה שונות של תאי T2, כגון Th18, Th29, Th178 ו- T רגולציה (Treg)אוכלוסיות 10,11. למרות ראיות משכנעות אלה, הקשר סיבתי בין שינוי של תגובות T-cell לבין הפיתוח וההתקדמות של OA עדיין לא ידוע2.

בנוסף לתאי T ספציפיים שיש תפקיד בOA, מחקרים אחרונים מראים כי מקרופאגים מקוטבים/מופעלים באופן דיפרנציאלי עשויים להיות משויכים פתוגנזה של OA12. בפרט, מקרופאגים שמקורם מונוציטים בדם מצטברים בסינוביום ומקוטבים לקרופאגים המופעלים באופן קלאסי (M1) או לחילופין מקרופאגים מופעלים (M2) במהלך פיתוח OA, מה המרמז על מתאם בין מקרופאגים נגזרים מונוציטים לבין מקרופאגיםOA 13. לעומת זאת, קבוצות משנה מסוימות של מקרופאגים מאכלסות איברים בשלב מוקדם במהלך הפיתוח ומקיים את מספרן בעניין עצמאימונוצייט 14. לאחרונה, פונקציית הגנה משותפת בתיווך מחסום צומת הדוק הוצגה עבור מקרופאגים אלה תושב רקמות synovial (STRMs)14. ממצאים אלה מצביעים על כך שחריגות מסוימות בתת-ערכות מקרופאג' עשויות לשחק תפקיד מכריע במהלך הפיתוח של OA. עם זאת, האינטראקציות בין תגובה תאית דלקתית זו לבין השינויים המבניים במפרק בעקבות טראומה אינן ידועות.

מבחינה היסטורית, ניתוח של תאים חיסוניים ברקמת הסינוביאלי הוגבל לביטוי חיסוני (IHC) או mRNA על ידי תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך (RT-PCR)מתקרב 15,16. עם זאת, הן IHC והן RT-PCR חסר את היכולת לזהות סוגי תאים שונים מרובים ואת קבוצות המשנה שלהם בו זמנית, ובכך, הגבלת הישימות של שיטות אלה. יתר על כן, IHC מוגבל לניתוח של דגימות קטנות של רקמות, עלול לפספס הצטברויות תאים דלקתיים מוקד. במהלך השנים האחרונות, מספר עצום של סמני פני השטח עבור סוגי תאים שונים פותחו, ותת קבוצות של תאים חיסוניים כעת ניתן לזהות באופן אמין על ידי שילובים ברורים של סמנים אלה. בשל התקדמות טכנית יציבה, ציטומטר זרימה מסוגלים כעת לזהות מספר רב של fluorochromes שונים בו זמנית המאפשר ניתוח של לוחות נוגדנים צבעוניים גדולים.

ציתום זרימה מספק לחוקרים טכניקה רבת עוצמה המאפשרת זיהוי וכמות בו-זמנית של מספר רב של תאים חיסוניים ותת-ערכות שלהם ברמת התא היחיד. פיתחנו ואופטימל גם תסה כתמים חוץ תאיים כדי לזהות מונוציטים / מקרופאגים ואת subsets שלהם, כמו גם תסיסה כתם נוסף / תאי כדי לזהות T-תאים ואת תת קבוצות שלהם בתוך טחול מורין, מח עצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial. כל שלב של פרוטוקול זה היה אופטימיזציה ונבדק וכתוצאה מכך אחסון לשחזור מאוד שניתן להשתמש עבור מודלים אחרים של עכבר OA כירורגי ולא כירורגי17.

Protocol

ועדת האתיקה של בעלי החיים של מחוז הבריאות המקומי של צפון סידני אישרה את כל ההליכים המוזכרים בפרוטוקול זה. עכברים מאוקרנים ולטפל בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה תוקן 2010). עבור כל הניסויים בני 10-12 שבועות, עכברים זכרים C57BL/6 נוצלו.

שים לב: כדי לגרום OA פוסט טראומטי, חוסר יציבות כירורגית של מניסקוס מדיאלי (DMM) במפרק החנוק הימני בוצע. מידע מפורט על מודל זה של בעלי חיים פורסם על ידי גלאסון ואח '18. בקיצור, הרדמה כללית מושרה בתא אינדוקציה באמצעות איזופלוראן ולאחר מכן נשמר באמצעות קונוס האף. הרגל הכירורגית מגולחת עם סכין גילוח ואת האתר הכירורגי נשטף ונאקה עם אתנול כדי למזער את הזיהום. לאחר מכן החיה מועברת למיקרוסקופ ההפעלה ומונחת על מגבת סטרילית והרגל עטופה בנייר סטרילי כדי לבודד את האתר הכירורגי ולמזער את הזיהום. באמצעות המיקרוסקופ, כריתת תקתקת הברך para-patella מדיאלי 0.5 ס"מ עשויה, הברך לוקס לרוחב, ואת כרית שומן אינפרא-פטלה מוגבה לחשוף את הרצועה מנדיאלי מניקור-tibial, אשר transected עם מפסי ניתוח. המפרק סמוק בתמיסת מלח סטרילית כדי להסיר דם והפצע סגור בשלוש שכבות – כמוסה משותפת, רקמה תת עורית (באמצעות חומר תפר) ועור (באמצעות דבק רקמות כירורגיות). עם זאת, ניתן להחיל שיטות המתוארות בפרוטוקול זה על מודלים ושיטות אחרים לצורך OA. OA יכול להיות מושרה בכל צד של החיה, וכאשר קצירת רקמות, חשוב לקצור את בלוטות הלימפה ipsilateral (ניקוז).

1. בידוד הטחול, מח עצם מולטרלי, בלוטות הלימפה ipsilateral מנקז את החנוק ואת רקמת synovial

  1. להמתת עשן את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. מניחים את העכבר בתמומת עליונות מתחת למיקרוסקופ לנתח ולנגב את החזה, הבטן והרגליים עם 70% אתנול. פתח בזהירות את העור בקו האמצע לאורך הבטן באמצעות מספריים ישרות והותיר את חלל הבטן ללא פגע.
  2. משוך בעדינות את העור בצד ימין של החיה הרחק מהשריר הבסיסי ומשאיר את רקמת השומן התת עורית המחוברת לעור. בדרך כלל, מתיחה עדינה לבדה תפריד את העור ואת רקמת השומן הבסיסית מהשריר. יש לחתוך את הדבקות הספורדית במספריים עדינות על מנת לשמור על המתח הדרוש כדי להפריד בין רקמות למינימום ולהפחית את הסיכוי לפגיעה בבלוטות הלימפה. זהה חצייה של שלושה כלי דם על-ידי הקנטה עדינה של רקמת השומן הממוקמת בירך באמצעות שני ממחצויות עדינות מעוקלות. צומת הלימפה ההגיוני ממוקם במעבר ותו לא ניתן לזהותו על ידי צורתו ההפוכה וצבעו הכהה מעט יותר.
  3. הסר את בלוטת הלימפה במפשעה באמצעות מפסי ניתוח עדינים. תיזהר לא לקרוע את הקפסולה. הסר את השומן הנותר על פני השטח של בלוטת הלימפה עם המשטחים.
  4. פתח את חלל הבטן וזיהוי הטחול. חותכים את הטחול עם מספריים משובחות. משכו בעדינות את המעיים הצידה כדי לחשוף את חבי החושקים ואת הדו-ריתור שלו נזהרים שלא לפגוע בהם, כדי למזער את הסיכון לזיהום. צומת הלימפה איליאק ממוקם בקטע המסוף של אב העורקים בבטן ואת המקור של עורק הכסל המשותף. הסר את בלוטת הלימפה הימנית והמשך כמתואר ב- 1.3.
  5. הסר בעדינות את העור של שני הגפיים האחוריות. לנתח את עצם הירך השמאלית על ידי ניקוי אותו רקמת שריר באמצעות הלהב ומספריים בסדר. נתק בזהירות הן את מפרק החנוק והן את מפרק הירך והותיר את כל העצם שלמה והסר את עצם הירך.
  6. זהה את גיד הברך של מפרק החנק הימני, ולאחר מכן הסר את רקמת השריר ה סמוכה proximal לזה באמצעות מספריים בסדר עד כ 5 מ"מ של פרוקסימלי גיד quadriceps כדי הברך נחשפת. לאחר מכן, לחתוך דרך גיד quadriceps כ 3-4mm proximal כדי ליצור ידית ושימוש מקציצות עדינים בעדינות למשוך אותו מן המפרק. זה יהיה להפוך את הקצוות של חיבור הקפסולה המשותפת עצם הירך גלוי, ובתוך שימוש להב אזמל לחתוך בזהירות לאורך הקצוות של הקפסולה המשותפת משני הצדדים, החל בעצם הירך הולך לכיוון השוקה, על מנת למקסם את כמות קרום synovial שנקטף. בעוד חיתוך חשוב לשמור על מתיחה עדינה על גיד quadriceps ולהשהות כאשר בלוק רקמה synovial מחובר רק השוקה. בשלב זה כרית השומן התוך-רטיקולרית נראית כעת בבירור דיסטלית לפניית הברך ונהרסה בעדינות מההיבט המפרק והאנטרני של המניסי באמצעות הלהב. לאחר מכן, לחתוך לאורך החלק הנותר של הכמוסה המשותפת (חלק טיבי) כדי להסיר את בלוק רקמת synovial.
    הערה: שלב זה צריך להיעשות בדיוק מאוד כדי לאפשר תוצאות אמינות. לאחר השלמת הקרע, "בלוק רקמת synovial" צריך להיות מורכב של הברך, גיד הברך, כרית שומן infrapatellar, supra- ו infrapatellar שקעים רירית synovial ו הקדמי כמוסה משותפת הקשורים לרצועות הצדדיות. לשמור על כל הרקמות לחות במהלך הניתור באמצעות תמיסת מלח 0.9%.
    הערה: מקם כל דגימת בלוק רקמות synovial בבאר נפרדת של צלחת עם תווית 24 באר המכילה 1.5 מ"ל של RPMI 1640 בינוני. מערבבים גם את הכסל וגם את בלוטת הלימפה המפשעה לבאר אחת ואת רקמות הבריכה משני עכברים.

2. דור של מתלים של תא יחיד מכל רקמה

הערה: על מנת להבטיח מספרי תאים מספיקים לניתוח זרימה רקמות synovial משני עכברים צריך להיות הבריכה. בפרוטוקול הנוכחי, מאגר כל הרקמות מאותם שני עכברים כדי לשמור על אנלוגיה. יתר על כן, בלוטות הלימפה iliac ו- inguinal שולבו עבור כל בעל חיים וכתוצאה מכך סך של 4 בלוטות הלימפה עבור כל מדגם. באופן כללי, מספרי תאים בטחול, מח עצם ובלוטות לימפה מאדם אחד מספיקים כדי לבצע ניתוח זרימה ואת הפרוטוקול ניתן להחיל. עם זאת, בעת שימוש ברקמות מתוך 100 זמני שימוש בבעלי חיים בלבד, ייתכן שיהיה צורך להתאים את עצמו.

  1. הטחול
    1. מניחים את שני הטחולים המאגרים על מסננת תא 70 μm על גבי צינור 15 מ"ל. בעדינות macerate הטחול דרך מסנן רשת באמצעות בוכנה סטרילי 3 מ"ל מזרק. לשטוף את מסננת לעתים קרובות עם סך של 6 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS.
    2. סובבו את התאים (500 x g, 5 דקות, RT) ופנסו מחדש את הכדור ב-5 מ"ל של מאגר תסיסה של תאי דם אדומים (RBC). דגירה במשך 5 דקות ב RT ולעצור את התגובה על ידי דילול מאגר lysis עם 10 מ"ל של PBS. סובב את התאים (500 x g, 5 דקות, RT) וחזור על שלב זה פעם או עד שלא יהיו יותר RBC.
      הערה: לסנן מחדש את המתלים באמצעות מסננת תא 30 μm לתוך צינור חדש 15 מ"ל בין שני סיבובים של lysing כדי להסיר תאים קרישה.
    3. לאחר השלמת הליזל, סובבו את התאים (500 x g, 5 דקות, RT), השליכו כדורי supernatant ו-resuspend ב-1 מ"ל PBS. לספור את מספר התאים החיים על hemocytometer באמצעות הדרה כחול Trypan.
  2. בלוטות הלימפה
    1. מניחים את ארבעת בלוטות הלימפה המאגרות על מסננת תא 70 μm על גבי צינור 15 מ"ל. בעדינות להקניט את בלוטות הלימפה בנפרד לתוך מתלה תא יחיד על ידי לחיצה עם בוכנה סטרילית 3 מ"ל מזרק. לשטוף את מסננת לעתים קרובות עם סך של 6 מ"ל של RPMI עם 10% FBS.
    2. סובב את התאים (500 x g, 5 דקות, RT), בטל את הסופרנטנט ופנס מחדש את הכדור ב-500 μL של PBS. לסנן מחדש את המתלים באמצעות מסננת תא 30 μm לתוך צינור חדש 15 מ"ל כדי להסיר תאים קרישה. לספור את מספר התאים החיים על hemocytometer באמצעות הדרה כחול Trypan.
  3. מח העצם
    1. תפוס בזהירות את עצם הירך השלמה באמצעות מפס אצבע רקמה מבלי שבירה אותו. חותכים את הקצה של עצם הירך הפרוקסימלית עם מספריים חדות כדי להקל על שטיפה של העצם. סובבו את עצם הירך והניצו מחט 23 G באמצע העצם הבין-נדילרית. תוך החלת לחץ עדין לסובב את המחט בין האגודל והאצבע המורה על מנת לקדוח חור חריץ intercondylar להיכנס לחלל העצם.
      הערה: לפעמים חלקיקי העצם יכולים לחסום את המחט לאחר קידוח החור, כדי למנוע לחץ גבוה מיותר במהלך שטיפה של מחט לפני שטיפה מומלץ.
    2. לשטוף את העצם עם 6 מ"ל של RPMI עם 10% FBS (או עד הסומק הופך לבן) באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 23 G על מסננת תא 70 μm הממוקם על צינור 15 מ"ל. לחץ בעדינות על מח העצם דרך מסננת התא עם בוכנה של מזרק 3 מ"ל ולשטוף את מסננת עם עוד 3 מ"ל של RPMI.
      הערה: העצמות אמורות להיראות לבנות לאחר שכל מח העצם נשטף לחלוטין.
    3. סובבו את התאים (500 x g, 5 דקות, RT) ופנסו מחדש את הכדור ב-5 מ"ל של מאגר סיס RBC. דגירה במשך 5 דקות ב RT ולעצור את התגובה על ידי דילול מאגר lysis עם 10 מ"ל של PBS.
    4. סובב את התאים (500 x g, 5 דקות, RT), בטל את הסופרנטנט וישנה מחדש את הכדור ב-1 מ"ל PBS. לסנן מחדש את המתלים באמצעות מסננת תא 30 μm לתוך צינור חדש 15 מ"ל כדי להסיר תאים קרישה. לספור את מספר התאים החיים על hemocytometer באמצעות הדרה כחול Trypan.
  4. רקמת השינוביאלית
    1. לקוביות שני רקמת הסינוביאלי בלוקים לחתיכות זעירות עם מספריים כירורגי בסדר. מעבירים את הדגימות עם מדיום לצינור של 15 מ"ל. לשטוף את הבאר הישנה עם 0.5 מ"ל נוספים של RPMI כדי לקבל תאים שנותרו ורקמות synovial, להעביר צינור בז (כרך סופי 2 מ"ל).
      טיפ: השתמש בפיפטת העברה וחתוך את הקצה שבו הקוטר מתרחב בשלב זה.
    2. אנזים מחדש ו aliquot על פי הוראות היצרן (למשל, Liberase). להוסיף אנזים מספיק כדי לגרום ריכוז סופי של 1 יחידה / מ"ל (סך של 2 יחידות לכל מדגם). לעכל ב 37 °C עבור 2 שעות באמצעות מסובב MACS.
    3. לעצור את העיכול על ידי הוספת 8 מ"ל של RPMI עם 10% FBS ולסנן מתלה תא באמצעות מסננת תא 70 μm לתוך צינור חדש 15 מ"ל. לשטוף את הצינור הישן 15 מ"ל עם עוד 5 מ"ל של RPMI עם 10% FCS בינוני ולסנן מתלה תא דרך מסננת תא זהה לתוך הצינור החדש (נפח סופי 15 מ"ל).
    4. סובבו את התאים (500 x g, 10 דקות, RT), השליכו את הסופרנטנט ופנסו מחדש את הכדור ב-500 μL של PBS. לספור את מספר התאים החיים על hemocytometer באמצעות הדרה כחול Trypan.

3. הקצאת תאים

  1. תייג שתי צלחות 96 באר (צורת U-bottom) עם סוג של רקמה, מזהה בעלי חיים, ואת לוח הנוגדנים המיועד. בסך הכל נעשה שימוש בשני לוחות נוגדנים בפרוטוקול זה: החלונית 'קבוצת משנה מונוצייט' (כתמים חוץ-תאיים) וחלונית תת-תאי T (כתמים תאיים נוספים ותוך תאיים).
  2. ספק 5 x 105 תאים לכל באר באמצעות מתלים תא יחיד המתאימים.
    הערה: בעת הגדרת הניסוי, להעריך את המספר המוחלט של תאים הצפוי לכל קבוצה וסוג רקמות (בעלי חיים מטופלים יש ספירת תאים גבוהה יותר ברקמות מאשר בעלי חיים שליטה). בעת שימוש חוזר את גלולת התא במהלך השלב האחרון של יצירת מתלים תא יחיד, לבחור כמות מתאימה של PBS על מנת בסופו של דבר עם ריכוז של 5 x 105 לכל 200 μL. צלחת 96-באר בשימוש כאן יכול להכיל מקסימום של 300 μL ובדרך כלל, 200 μL הוא אידיאלי כדי למזער את הסיכון של זיהום צולב עקב שפיכה.
  3. עבור כל לוח וסוג רקמות, להפיץ לפחות 5 x10 5 תאים כפקדים לא מוכתמים בארות שסומנו בבירור.

4. החלונית 'ערכת משנה מונוצייט'

  1. לבצע כתמים בכדאיות: תאי סיבוב (500 x g, 5 דקות, 4 °C) באמצעות טווה צלחת ולשטוף את התאים פעם אחת עם 200 μL של 1 x PBS. הכן תמיסת מלאי של צבע תא-inmpermeant אמין-תגובתי (כתם קיימא) מדולל 1:50 ב 1x PBS. לאחר מכן, לתוסף מחדש את כדורי התא עם 100 μL של פתרון מניות זה וכתוצאה מכך נפח מוחלט של 2 μL של כתם הכדאיות לכל באר. דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מוגנת מפני אור.
    הערה: הכמות האופטימלית של כתם כדאיות הדרושה צריכה להיקבע על ידי ביצוע עקומת טיתור מינון. בנוסף, יש להשתמש בפתרון מלאי כתם קיום מדולל ביום אחד ולא להיות מאוחסן. עיין בהוראות היצרן לקבלת מידע נוסף אודות אופן ההתכנסות מחדש, לדלל ולאחסן את כתם הכדאיות.
  2. במהלך הדגירה, הכינו את קוקטייל הנוגדנים בנפח המתאים של מאגר FACS (Ca2+ ו-Mg+ PBS חינם המכיל 0.1%BSA ו-0.02% נתרן אזיד). לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μL של מאגר FACS, צנטריפוגה (500 x g, 5 דקות, 4 ° C) ולתהות מחדש כל גלולה עם 100 μL של תערובת נוגדנים או תערובת שליטה מתאימה. דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מוגנת מפני אור.
    הערה: שים לב כי נתרן אזיד רעיל לתאים. בפרוטוקול הנוכחי ריכוז נתרן אזיד במאגר הזרימה הוא נמוך מאוד (0.02%) דגימות פועלות מיד לאחר הכתמה כך, לא גורם לכל בעיה. אם מתוכננות מגרויות פונקציונליות במורד הזרם של תאים ממוינות, זה עשוי להיות מועיל כדי לפצות על מאגר FACS טרי בכל יום של ניסויים ולא להשתמש בכל נתרן אזיד. בעת שימוש בהמון נוגדנים, מומלץ להוסיף כמות מתאימה של "מאגר כתמים מבריק" לקוקטייל של נוגדנים כדי לשפר את התוצאות.
  3. לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μL של מאגר FACS ולהיכנס מחדש את התאים ב 250 μL של FACS + מאגר EDTA (מאגר FACS המכיל EDTA 1 mM). העבר דגימות לצינורות FACS מסומנים. שמור דגימות ב 4 °C ומוגן מפני אור עד לרכישה.
    הערה: לתאים חיסוניים יש נטייה להיות דביקים. כדי למזער הן את הסיכון לחסימה והן את מספר הכפילים, מומלץ להוסיף EDTA של 1 מ"מ למאגר הזרימה הסופי.

5. החלונית 'קבוצת משנה של תא T'

  1. לבצע כתמים בכדאיות: תאי סיבוב (500 x g, 5 דקות, 4 °C) באמצעות טווה צלחת ולשטוף את התאים פעם אחת עם 200 μL של 1 x PBS. הכן תמיסת מלאי של צבע תא-inmpermeant אמין-תגובתי (כתם קיימא) מדולל 1:50 ב 1x PBS. לאחר מכן, לתוסף מחדש את כדורי התא עם 100 μL של פתרון מניות זה וכתוצאה מכך נפח מוחלט של 2 μL של כתם הכדאיות לכל באר. דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מוגנת מפני אור.
  2. תוך דגירה הדגימות, להכין את קוקטייל נוגדן כתמים חוץ תאיים בנפח המתאים של 1x FACS מאגר. לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μL של 1 x FACS מאגר, לסובב אותם (500 x g, 5 דקות, 4 ° C) ולתהוס כל גלולה עם 100 μL של תערובת נוגדנים או תערובת בקרה מתאימה. דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מוגנת מפני אור.
  3. בצע את הכתמים התוך תאיים עם ערכת קיבעון ויציבות בהתאם להוראות היצרן. לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μL של 1 מאגר FACS ולנוע מחדש ב 200 μL של מאגר קיבעון. דגירה במשך 40 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
  4. במהלך הדגירה, הכינו את קוקטייל הנוגדנים (כתמימה תאית) בנפח מתאים של 1x חמלה וחוצץ כביסה. לאסוף תאים על ידי ספינינג (750 x g, 5 דקות, 4 °C) ולשטוף תאים פעמיים עם 200 μL של 1 x סלם / מאגר כביסה.
    הערה: קיבעון ותוצאות חפוז בתאים שנוטים להיות קצת יותר קשה גלולה כראוי. על מנת למזער את אובדן התאים במהלך שלבי הכביסה הבאים, הגדל את הכוח הצנטריפוגלי ל- 750 x g. לחלופין, ניתן גם להחיל מחזור ספינינג ארוך יותר. עם זאת, פעולה זו תגרום לזמן ארוך הרבה יותר כי יש צורך להכין את התאים.
  5. תאי ספין (750 x g, 5 דקות, 4 °C) ולתוסת מחדש כל גלולה עם 100 μL של תערובת נוגדנים או תערובת שליטה מתאימה. דגירה במשך 40 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
  6. לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μL של 1x סל סלור / מאגר כביסה ולשטוף מחדש את התאים ב 250 μL של FACS + מאגר EDTA. העבר דגימות לצינורות FACS מסומנים. שמור דגימות ב 4 °C ומוגן מפני אור עד לרכישה.
    הערה: עבור כל נוגדן הריכוז האופטימלי צריך להיקבע על ידי ביצוע עקומת טיתור מינון. ריכוז בין נוגדנים יכול להיות שונה באופן דרסטי: CD3 ו- CD80 שימש עם גורם דילול של 1:1, בעוד CD11b ו CD4 שימש עם גורם דילול של 1:6400. בעת titrating ריכוז הנוגדנים להשתמש באותו מספר תאים שישמש במהלך הניסויים.

6. פיצוי, בקרות מתאימות וגטים

  1. הגדרת הניסוי
    1. לאחר ריכוז הנוגדנים האופטימלי נקבע לרוץ ללא רבב ופקדים מוכתמים יחיד לפיצוי כדי להתאים לחפיפה ספקטרלית.
      הערה: הפעל את כל פקדי הפיצוי הן עם תאים והן עם חרוזי פיצוי. השתמש בכל מה שיוצר את התוצאות הבהירות ביותר (MFI הגבוה ביותר של אירועים חיוביים) לפיצוי. MFI מייצג עוצמת פלואורסץ ממוצעת והוא משמש לעתים קרובות כדי לתאר ולהגדיר את העוצמה ממוצעת של האות שנוצר ובכך, רמת ביטוי נוגדנים.
    2. הפעל פקדי פלואורסץ מינוס אחד (FMO) ופקדי isotype בעת הפעלת ניסוי רב-צבעי חדש. פרטים נוספים לגבי FMO פורסמו בעבר19.
    3. קבע את המתח האופטימלי של אזור פיזור קדמי (FSC-A) ואת מתח אזור פיזור צד (SSC-A) כדי לזהות את אוכלוסיית הלוקוצייט בפקדים לא מוזהמים של כל סוג רקמות.
      הערה: תהליך קיבעון ויציבות משנה את ממדי התא. לפיכך, מתחי FSC-A ו- SSC-A עבור לוח קבוצת המשנה Monocyte ולוח קבוצת המשנה T Cell שונים במידה ניכרת. כדי למצוא את המתחים האופטימליים עבור לוח קבוצת המשנה T Cell, השתמש בתאים שהושתימו ב- CD3 ובשער אחורי לעבר אוכלוסיות הלוקוצייט תוך התאמת ערכי FSC-A ו- SSC-A.
  2. אסטרטגיית גתות
    1. לאחר שנקבע מתח FSC-A ו-SSC-A האופטימלי, הקים שער ראשי על אוכלוסיית הלוקוצייט.
      הערה: לפני כל ניסוי כייל את הציטומטר באמצעות חרוזי כיול לפי הוראות היצרן והפעילחרוזים לא מוכתמים. אוכלוסיות Leukocyte של נקודות זמן שונות צריך להיות מאפייני FSC ו SSC דומים (הבדלים קלים בין סוגי רקמות צפויים ונורמליים). אם FSC ו SSC משתנה צרות ניכרות לירות cytometer ודור מדגם.
    2. אל תכלול כפיות: התוויית FSC-A (ציר y) ו- FSC-H (ציר x). סינגלים מופיעים כאלכסון של עלילה זו. שער על סינגלים.
    3. אל תכלול תא מת: התוויית FVS510 (כתם קיימות) (ציר x) ו- FSC-A (ציר y). תאים מתים יופיעו כאירועים חיוביים, ובכך שער על תאים חיים.
      הערה: תאים שליליים אמיתיים יהיו גלויים בפקדים לא מוכתמים. לפיכך, התאם שער זה עבור כל קבוצה של דוגמאות בעת הפעלת הפקדים הלא מוכתמים לפני דגימות מוכתמות. תסנות נוספת תלויה בלוח הנוגדנים ובסוג התא הנחקר. ניתן למצוא אסטרטגיות גטינג עבור כל פאנל המשמש בפרוטוקול זה בדמות 1 ובאיור 4, בהתאמה.

תוצאות

תוצאות מייצגות הן מהחלונית 'ערכת משנה מונוצייט' והן מחלונית קבוצת המשנה T-cell מתוארות להלן.

איור 1 ממחיש את אסטרטגיית ההתארגנות ההיררכית עבור לוח תת-הזמן החד-צייטי על תאים חיסוניים שנאספו ממח העצם של בעלי חיים שטופלו ב-DMM. אותה אסטרטגיה שימשה ו אומתה בכל סוגי הר...

Discussion

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה תוכננו ונבדקו כדי לזהות באופן אמין תת-קבוצות שונות הן מונוציטים / מקרופאגים T-תאים בתוך הטחול murine, מח עצם, בלוטות הלימפה, רקמת סינוביאלית במודל murine של דלקת מפרקים ניוונית (OA). הפרוטוקול הנוכחי ניתן לשנות בקלות כדי לחקור סוגי רקמות שונים, או סוגי תאים אחרים על ידי ...

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לאנדרו לים, Ph.D. וג'יילס בסט, Ph.D. על עזרתם בהקמת ציטומטר זרימה. פרויקט זה נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) הוענק PH.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
APC anti-mouse CD194 (CCR4)BioLegend131212T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000TstBD566385Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µgBD564406T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µgBD564406Monocyte Panel
Liberase, Research GradeRoche5401127001Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µgBD564985Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µgBD562454Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µgBD742274T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µgBD565250Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µgBD563061T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µgBD557596T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µgBD552775T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µgBD565480T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µgBD565261T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µgBD740664T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µgBD563687Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µgBD563332T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µgBD565411Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µgBD560408T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µgBD563414Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µgBD560593Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µgBD560600Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µgBD564143T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µgBD562894T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing BufferN/AN/ABuffersDescription in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100TstBD562574Buffers

References

  1. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
  2. Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
  3. Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
  4. Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
  5. Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
  6. Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
  7. Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
  8. Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
  9. Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
  10. Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
  11. Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
  12. Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
  13. Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
  14. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
  15. Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
  16. Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
  17. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  20. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  21. Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  22. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  23. Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
  24. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  25. Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
  26. Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

158T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved