Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Özet

Burada, murine dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde hem ekstra hem de hücre içi boyama tahlilleri kullanarak monosit/makrofaj ve T hücrealt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı ve tekrarlanabilir akış sitometri protokolünü tanımladık ve murine osteoartritin yerleşik bir cerrahi modelini kullanıyoruz.

Özet

Osteoartrit (OA) en yaygın kas-iskelet sistemi hastalıklarından biridir, ağrı ve fiziksel sınırlamalar muzdarip hastaları etkileyen. Son kanıtlar, hem T-hücreleri hem de monositler/makrofajlar potansiyel olarak OA patogenezi ile ilişkili olan hastalığın potansiyel inflamatuar bileşenini göstermektedir. Daha ileri çalışmalar, Th1, Th2, Th17 ve T-düzenleyici lenfositler ve M1, M2 ve sinovyum-doku-yerleşik makrofajlar gibi her iki inflamatuar hücre soyundan alt kümeleri için önemli bir rol öne çıkar. Ancak lokal sinovyal ve sistemik inflamatuar hücresel yanıt ile eklemdeki yapısal değişiklikler arasındaki etkileşim bilinmemektedir. T-hücrelerinin ve monositlerin/makrofajların OA'ya nasıl katkıda bulunduklarını tam olarak anlamak için, bu hücreleri ve alt kümelerini aynı anda sinovyal dokuda, sekonder lenfatik organlarda ve sistemli (dalak ve kemik iliği) sayısal olarak tanımlayabilmek önemlidir. Günümüzde, farklı inflamatuar hücre alt kümeleri hücre-yüzey belirteçleri çok renkli akış sitometri bu hücresel süreçleri araştıran güçlü bir teknik yapma bir kombinasyonu ile tespit edilebilir. Bu protokolde, sinovyal doku ve sekonder lenfatik organların hasadı ve tek hücreli süspansiyonların üretimi ile ilgili ayrıntılı adımları açıklıyoruz. Ayrıca, monositleri/makrofajları ve alt kümelerini tanımlamak için hem hücre dışı bir boyama testi hem de t-hücrelerini ve bunların alt kümelerini belirlemek için ürinen dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal dokuları sinovyal dokuları sifon larını satıyoruz. Bu protokolün her adımı optimize edildi ve test edildi, diğer cerrahi ve cerrahi olmayan OA fare modelleri için kullanılabilen son derece tekrarlanabilir bir test ile sonuçlandı.

Giriş

Osteoartrit (OA) eklem ile ilişkili tüm dokuların çeşitli patolojiler içeren zayıflatıcı ve ağrılı bir hastalıktır¹. Küresel nüfusun yaklaşık% 3.8 etkileyen^2,OA en yaygın kas-iskelet hastalıkları biridir ve 2020³tarafından dünya çapında 4^önde gelen sakatlık nedeni olmaktır. Post-travmatik OA eklem yaralanması ndan sonra ortaya çıkar ve tüm OA en az% 12 ve diz gibi duyarlı eklemlerde OA kadar% 25 için hesaplar^4,5. Ayrıca, eklem yaralanması fazla beş kat⁶OA yaşam boyu riskini artırır. Görünüşte benzer istikrarsızlık ile tüm yaralanmalar OA geliştirmek için devam edecek, ve bu nedenle uzun vadeli OA-risk sürücü faktörler tanımlayan zorlu kalır. Travma sonrası OA'yı önlemek ve/veya tedavi etmek, yaralanmaya özgü patolojiyi, nedenleri ve OA^1'eyatkın mekanizmaları araştırmak ve daha iyi tanımlamak için etkili tedaviler geliştirmek çok önemlidir.

OA ve tanımlayıcı kıkırdak yıkımı daha önce tamamen mekanik strese atfedildi ve bu nedenle, OA non-inflamatuar bir hastalık olarak kabul edildi². Ancak, daha yeni çalışmalar sinovyal membranların inflamatuar infiltrasyon ve Sağlıklı kontroller ile karşılaştırıldığında OA olan hastalarda sinovyal dokuda inflamatuar hücrelerin bir artış göstermiştir², OA potansiyel bir itici güç olarak inflamatuar bir bileşene ışık talan. Daha ileri çalışmalar cd4 + ve CD8 + T-hücre profili yanı sıra doğuştan gelen bağışıklık sisteminin monosit / makrofajlar anormallikleri OA 2 patogenezine katkıda bulunabileceğini göstermiştir^.,7 Bu anormallikler içine ayrıntılı araştırmalar çeşitli T hücre alt kümeleri için ilgili roller ortaya², Th1⁸gibi 8 , Th2⁹, Th17⁸ ve T düzenleyici (Treg) popülasyonları^10,11. Bu ikna edici kanıtlara rağmen, T-hücre yanıtlarının değiştirilmesi ile OA'nın gelişimi ve ilerlemesi arasındaki nedensel ilişki hala bilinmemektedir².

OA'da rol alan spesifik T hücrelerine ek olarak, son çalışmalar farklıpolarize/aktive makrofajların OA¹²patogenezi ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Özellikle kan monositlerinden kaynaklanan makrofajlar sinovyumda birikir ve oa gelişimi sırasında klasik olarak aktive edilmiş makrofajlara (M1) veya alternatif olarak aktive makrofajlara (M2) polarize olur, bu da monosit türevi makrofajlar ile OA¹³arasında bir korelasyon olduğunu ima eder. Buna karşılık, makrofajlar bazı alt kümeleri gelişme sırasında erken organları doldurmak ve teksit bağımsız madde¹⁴kendi sayılarını sürdürmek. Son zamanlarda, bu sinovyal doku yerleşik makrofajlar (STRMs)¹⁴için dar bir kavşak bariyer aracılık eklem koruyucu fonksiyon gösterilmiştir. Bu bulgular, özellikle makrofaj alt kümelerinde anormalliklerin OA gelişimi sırasında önemli bir rol oynayabilir göstermektedir. Ancak, bu inflamatuar hücresel yanıt ve travma sonrasında eklem yapısal değişiklikler arasındaki etkileşimleri bilinmemektedir.

Tarihsel olarak, sinovyal dokuda bağışıklık hücrelerinin analizi ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yaklaşımlar tarafından immünohistokimya (IHC) veya mRNA ekspresyonu ile sınırlı ydı^15,16. Ancak, hem IHC hem de RT-PCR aynı anda birden fazla farklı hücre türünü ve alt kümelerini belirleyebilme yeteneğine sahip değildir, böylece bu yöntemlerin uygulanabilirliğini sınırlandırmaktadır. Ayrıca, IHC doku küçük örneklerin analizi ile sınırlıdır ve fokal inflamatuar hücre birikimleri kaçırabilir. Son birkaç yıl içinde, çeşitli hücre tipleri için yüzey belirteçleri sayısız geliştirilmiştir, ve bağışıklık hücrelerinin alt kümeleri artık güvenilir bu belirteçlerin farklı kombinasyonları ile tespit edilebilir. Sürekli teknik ilerleme nedeniyle, akış sitometreler artık aynı anda büyük çok renkli antikor panelleri analizi sağlayan farklı florokromlar çok sayıda tespit yeteneğine sahiptir.

Akış sitometrisi, araştırmacılara, çok sayıda bağışıklık hücresinin ve alt kümelerinin tek hücre düzeyinde eşzamanlı olarak tanımlanmasını ve ölçülmesine olanak tanıyan güçlü bir teknik sağlar. Monositleri/makrofajları ve alt kümelerini tanımlamak için hem hücre dışı bir boyama testi geliştirdik hem de t-hücrelerini ve bunların alt kümelerini murin dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde tanımlamak için ekstra/hücre içi boyama testi geliştirdik ve optimize ettik. Bu protokolün her adımı optimize edilmiş ve diğer cerrahi ve cerrahi olmayan OA fare modelleri için kullanılabilir son derece tekrarlanabilir bir test¹⁷.

Protokol

Kuzey Sidney Yerel Sağlık Bölgesi Hayvan Etik Komitesi bu protokolde belirtilen tüm prosedürleri onayladı. Fareler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak barındırılır ve bakılır (Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Revize 2010). 10-12 haftalık tüm deneylerde erkek C57BL/6 fareler kullanıldı.

NOT: Post-travmatik OA'yı indüklemek için sağ eklemde medial menisküs (DMM) cerrahi destabilizasyonu yapıldı. Bu hayvan modeli ile ilgili ayrıntılı bilgi Glasson ve ark.¹⁸tarafından yayınlanmıştır. Kısacası, genel anestezi isofluran kullanılarak bir indüksiyon odasında indüklenir ve daha sonra bir burun konisi kullanılarak muhafaza edilir. Cerrahi bacak bir jilet ile tıraş edilir ve cerrahi site yıkanır ve kontaminasyonu en aza indirmek için etanol ile süzülür. Hayvan daha sonra ameliyat mikroskobuna taşınır ve steril bir havlu üzerine yerleştirilir ve bacak cerrahi site izole etmek ve kontaminasyonu en aza indirmek için steril kağıt perde ile kaplı. Mikroskop kullanılarak, 0.5 cm medial para-patella artrotomi yapılır, patella yanal luxated, ve infra-patella yağ yastığı medial menisko-tibial ligament ortaya çıkarmak için yükseltilmiş, hangi diseksiyon forceps ile transected. Eklem herhangi bir kan kaldırmak için steril salin ile kızarılır ve yara üç kat kapatılır - eklem kapsülü, deri altı doku (dikiş malzemesi kullanarak) ve deri (cerrahi doku tutkal kullanarak). Ancak, bu protokolde açıklanan yöntemler, OA'yı neden olmak için diğer modellere ve yöntemlere uygulanabilir. OA hayvanın her iki tarafında indüklenebilir, ve dokuların hasat ederken, ipsilateral hasat önemlidir (drenaj) lenf düğümleri.

1. Dalak, kontralateral kemik iliği, ipsilateral lenf düğümlerinin singenyat dokusunu boşaltmasının izolasyonu

1. Servikal çıkığı ile fareömöter. Fareyi bir kesişme mikroskobu altında bir supine pozisyonda yerleştirin ve% 70 etanol ile göğüs, karın ve bacaklar silin. Karın boşluğu bozulmadan bırakarak düz makas kullanarak karın uzunluğu için orta hatta dikkatle açık.
2. Hayvanın sağ tarafındaki deriyi deriye hafifçe çekin ve deriye bağlı deri altı yağ dokusunu bırakarak altta yatan kastan uzaklaştırın. Normalde, nazik çekiş tek başına kas deri ve altta yatan yağ dokusu ayıracaktır. Dokuları en aza ayırmak ve lenf düğümlerine zarar verme olasılığını azaltmak için gerekli gerginliği korumak için sporadik bağlılıklar ince makasla kesilmelidir. İki kavisli ince forceps kullanarak uyluk bulunan yağ dokusu yavaşça alay ederek üç damarların bir geçiş tanımlayın. Inguinal lenf düğümü geçiş te bulunur ve oval şekli ve biraz daha koyu rengi ile tanımlanabilir.
3. Ince diseksiyon forsepskullanarak inguinal lenf düğümü çıkarın. Kapsülü yırtmamaya dikkat et. Forseps ile lenf düğümü yüzeyinde kalan yağ çıkarın.
4. Karın boşluğunu açın ve dalağını tanımlayın. Dalağını ince makasla kesin. Aortu ve çatallanmayı ortaya çıkarmak için bağırsakları yavaşça kenara çekin ve kontaminasyon riskini en aza indirmek için onlara zarar vermemeye dikkat edin. Iliak lenf nod, abdominal aortun terminal segmentinde ve yaygın iliak arterin kökeninde yer alır. Sağ iliak lenf noduzunu çıkarın ve 1.3'te açıklandığı gibi devam edin.
5. Yavaşça her iki arka ekstremite deri kaldırın. Bıçak ve ince makas kullanarak kas dokusundan temizleyerek sol uyluk kesin. Dikkatle tüm kemik bozulmadan bırakarak hem stifle ve kalça eklemi kesmek ve femur kaldırın.
6. Sağ boğucu eklem patella tendonu belirleyin, sonra patella için quadriceps tendon proksimal yaklaşık 5mm maruz kalana kadar ince makas kullanarak bu bitişik kas dokusu proksimal kaldırın. Daha sonra, patella yaklaşık 3-4mm proksimal quadriceps tendonu ile kesilmiş bir sap oluşturmak ve ince forseps kullanarak yavaşça eklem uzak çekin. Bu femur eklem kapsülü eki kenarları görünür hale getirecek, ve dikkatle her iki tarafta eklem kapsülü kenarları boyunca kesilmiş bir neşter bıçak kullanarak, kaval kemiğine doğru giden femur başlayarak, hasat edilen sinovyal membran miktarını maksimize etmek için. Keserken kuadriseps tendonunda hafif bir çekiş sağlamak ve sinovyal doku bloğu sadece kaval kemiğine bağlı olduğunda duraklatmak önemlidir. Bu aşamada intraartiküler yağ yastığı şimdi açıkça patella distal görülebilir ve hafifçe bıçak kullanarak menisküs eklem ve ön kısmından ayrılabilir. Daha sonra, eklem kapsülü kalan kısmı boyunca kesilmiş (tibial kısmı) sinovyal doku bloğu kaldırmak için.
   NOT: Güvenilir sonuçlar alabilmek için bu adımın çok hassas bir şekilde yapılması gerekir. Diseksiyonu tamamladıktan sonra, "sinovyal doku bloğu" patella, patella tendon, infrapatellar yağ pedi, supra- ve infrapatellar girinti sinovyal astar ve kollateral ligamentler ilişkili eklem kapsül anterior oluşmalıdır. %0,9 tuzlu çözelti kullanarak diseksiyon sırasında tüm dokuları nemli tutun.
   NOT: Her sinovyal doku bloğu örneğini 1,5 ml RPMI 1640 orta içeren 24 kuyulu bir plakanın ayrı bir kuyuya yerleştirin. Bir kuyu ve havuz dokuları içine bir iyi hem iliak ve inguinal lenf düğümü birleştirin.

2. Her dokudan tek hücreli süspansiyonların üretimi

NOT: Akış analizi için yeterli hücre sayılarını sağlamak için iki fareden gelen sinovyal dokuların biraraya edilmesi gerekmektedir. Mevcut protokolde, benzetmeyi sürdürmek için tüm dokuları aynı iki fareden bir araya getirmek. Ayrıca her bir hayvan için iliak ve inguinal lenf nodları birleştirerek her örnek için toplam 4 lenf düğümü elde edildi. Genel olarak, bir hayvandan dalak, kemik iliği ve lenf düğümlerinde bulunan hücre sayıları akış analizi yapmak için yeterlidir ve protokol uygulanabilir. Ancak, dokuları kullanırken sadece bir hayvanlık döneminden itibaren ayarlanması gerekebilir.

1. Dalak
   1. İki havuzlu dalağını 15 mL'lik bir tüpün üzerine 70 m'lik bir hücresüze yerleştirin. Steril 3 mL şırınga pistonsu kullanarak dalağını kafes filtresinden hafifçe geçirin. Süzgeci sık sık %10 FBS ile desteklenen toplam 6 mL RPMI 1640 orta ile temizler.
   2. Hücreleri döndürün (500 x g, 5 dk, RT) ve kırmızı kan hücresi (RBC) lysis tampon 5 mL pelet resuspend. RT'de 5 dakika kuluçkaya yatve lisis tamponu 10 mL PBS ile seyrelterek reaksiyonu durdurun. Hücreleri döndürün (500 x g, 5 dk, RT) ve bu adımı bir kez veya daha fazla RBC pelet olana kadar tekrarlayın.
      NOT: Pıhtılaşmış hücreleri temizlemek için 30 m hücreli süzgeç kullanarak süspansiyonu iki tur lysing arasında 15 mL'lik yeni bir tüpe yeniden filtreleyin.
   3. Lysing tamamlandıktan sonra hücreleri döndürün (500 x g, 5 dk, RT), supernatant atın ve PBS 1 mL pelet resuspend. Trypan mavisi dışlama kullanarak hemositometredeki canlı hücre sayısını sayın.
2. Lenf düğümleri
   1. Dört havuzlu lenf düğümünü 15 mL'lik bir tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgecinin üzerine yerleştirin. Steril 3 mL şırınga pistonlu bir piston ile bastırarak lenf düğümlerini tek hücreli süspansiyona doğru hafifçe sürün. Süzgeci %10 FBS ile toplam 6 mL RPMI ile sık sık yıkayın.
   2. Hücreleri döndürün (500 x g, 5 dk, RT), supernatant atın ve PBS 500 μL pelet resuspend. Pıhtılaşmış hücreleri temizlemek için 30 μm hücreli süzgeç kullanarak süspansiyonu yeni bir 15 mL tüpe yeniden filtreleyin. Trypan mavisi dışlama kullanarak hemositometredeki canlı hücre sayısını sayın.
3. Kemik iliği
   1. Dikkatle kırılmadan bir doku başparmak forceps kullanarak bozulmamış femur kavramak. Kemiğin kızarmasını kolaylaştırmak için proksimal femurun ucunu keskin bir makasla kesin. Uyluk kemiğini döndürün ve femur intercondylar çentik ortasında 23 G iğne konumlandırın. Hafif basınç uygularken kemik boşluğuna girmek için intercondylar çentik bir delik açmak için başparmak ve işaret parmağı arasında iğne döndürün.
      NOT: Bazen kemik parçacıkları deliği deldikten sonra iğneyi engelleyebilir, yıkamadan önce iğnenin değişimi sırasında gereksiz yüksek basınçtan kaçınmak önerilir.
   2. 15 mL'lik bir tüpe yerleştirilen 70 μm'lik bir süzgeç üzerine 23 G iğneyle 10 mL'lik bir şırınga kullanarak %10 FBS (veya floş beyaza dönene kadar) 6 mL RPMI ile kemiği temizleyin. Kemik iliğini hücre süzgecinden 3 mL'lik bir şırınga ile hafifçe bastırın ve süzgeci 3 mL daha RPMI ile durulayın.
      NOT: Tüm ilik tamamen dışarı atıldıktan sonra kemikler beyaz görünmelidir.
   3. Hücreleri döndürün (500 x g, 5 dk, RT) ve 5 mL RBC lysis tamponunda peleti yeniden askıya alın. RT'de 5 dakika kuluçkaya yatve lisis tamponu 10 mL PBS ile seyrelterek reaksiyonu durdurun.
   4. Hücreleri döndürün (500 x g, 5 dk, RT), supernatant atın ve PBS 1 mL pelet resuspend. Pıhtılaşmış hücreleri temizlemek için 30 μm hücreli süzgeç kullanarak süspansiyonu yeni bir 15 mL tüpe yeniden filtreleyin. Trypan mavisi dışlama kullanarak hemositometredeki canlı hücre sayısını sayın.
4. Sinovyal doku
   1. Zar iki sinovyal doku blokları ince bir cerrahi makas ile küçük parçalar halinde. Orta daki numuneleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri ve sinovyal dokuları almak için rpmi ek 0.5 mL ile eski kuyu durulayın, şahin tüp (son hacim 2 mL) aktarın.
      İpucu: Bu adımda çapın genişlendiği bir transfer pipeti ve ucun kesilmesini kullanın.
   2. Enzim ivedini ve aliquot'u üretici talimatlarına göre yeniden oluştur (örn. Liberase). Nihai konsantrasyonu 1 Birim/mL (numune başına toplam 2 Birim) ile sonuçlandıracak yeterli enzim ekleyin. MACS rotator kullanarak 37 °C'de 2 saat boyunca sindirin.
   3. %10 FBS ile 8 mL RPMI ekleyerek sindirimi durdurun ve 70 m hücreli süzgeçten yeni bir 15 mL tüpe filtre hücre süspansiyonu. Eski 15 mL'lik tüpü %10 FCS orta ve filtre hücresi süspansiyonu ile 5 mL daha RPMI ile durulayın ve aynı hücresüzden yeni tüpe (15 mL son hacim) filtre uygulayın.
   4. Hücreleri döndürün (500 x g, 10 dk, RT), supernatant atın ve PBS 500 μL pelet resuspend. Trypan mavisi dışlama kullanarak hemositometredeki canlı hücre sayısını sayın.

3. Hücrelerin dağılımı

1. Doku tipi, hayvan kimliği ve belirlenmiş antikor paneli ile iki adet 96 kuyulu plakayı (U-alt şekli) etiketlayın. Bu protokolde toplam iki antikor paneli kullanılmaktadır: Monosit alt set paneli (hücre dışı boyama) ve T hücreli alt set paneli (hücre dışı ve hücre içi boyama).
2. İlgili tek hücresüspansiyonlarını kullanarak her kuyu başına 5 x 10⁵ hücre sağlayın.
   NOT: Deneyi kurarken, grup ve doku tipi başına beklenen hücrelerin mutlak sayısını değerlendirin (tedavi edilen hayvanların dokularda kontrol hayvanlarından daha yüksek hücre sayısına sahiptir). Tek hücresüspansiyonları üreten son adımda hücre peletini yeniden askıya alırken, 200°L'de 5 x 10⁵ konsantrasyonu ile bitirmek için uygun miktarda PBS seçin. Burada kullanılan 96 kuyulu plaka maksimum 300 μL tutabilir ve tipik olarak, 200 μL dökülme nedeniyle çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için idealdir.
3. Her panel ve doku tipi için, en az 5 x 10⁵ hücreleri açıkça işaretlenmiş kuyularda lekesiz kontroller olarak dağıtın.

4. Monosit Alt Set Paneli

1. Canlılık boyama yapın: Spin hücreleri (500 x g, 5 dk, 4 °C) bir plaka spinner kullanarak ve 1x PBS 200 μL ile hücreleri bir kez yıkayın. 1x PBS'de seyreltilmiş hücre impermade amin-reaktif boya (canlılık lekesi) bir stok çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, bu stok çözeltisinin 100 μL'lik hücre peletlerini yeniden askıya alın ve kuyu başına 2 μL'lik mutlak bir canlılık lekesi hacmi elde edin. 4 °C'de 15 dakika boyunca ışıktan korunur.
   NOT: Gerekli olan en uygun canlılık lekesi miktarı doz titrasyon eğrisi ile belirlenmelidir. Buna ek olarak, seyreltilmiş canlılık leke stok çözeltisi tek bir gün içinde kullanılmalı ve depolanmamalıdır. Canlılık lekesinin nasıl yeniden oluşturulacağını, seyrelteceği ve depolacağı hakkında daha fazla bilgi için üreticinin talimatlarına bakın.
2. Kuluçka sırasında, facs tampon uygun bir hacimde antikorkokteyl hazırlamak (Ca2 + ve Mg + serbest PBS içeren 0.1% BSA ve 0.02% sodyum azid). Hücreleri 200 μL FACS tampon, santrifüj (500 x g, 5 dk, 4 °C) ile iki kez yıkayın ve her peleti 100 μL antikor karışımı veya uygun kontrol karışımı ile yeniden askıya alın. 4 °C'de 30 dk boyunca ışıktan korunan kuluçka.
   NOT: Sodyum azitin hücreler için toksik olduğunu lütfen unutmayın. Mevcut protokolde akış tamponundaki sodyum azit konsantrasyonu çok düşüktür (%0.02). ve numuneler boyama dan hemen sonra çalıştırılır, herhangi bir soruna neden olmaz. Sıralanmış hücrelerin aşağı fonksiyonel tahliller planlanıyorsa, deneylerin her gün taze FACS tampon makyaj ve herhangi bir sodyum azit kullanmamak yararlı olabilir. Antikorlar çok sayıda kullanırken, sonuçları artırmak için antikorların kokteyl "Parlak Leke Tampon" uygun miktarda eklemek için tavsiye edilir.
3. Hücreleri 200 μL FACS arabelleği ile iki kez yıkayın ve 250 μL FACS + EDTA arabelleği (1 mM EDTA içeren FACS arabelleği) hücreleri yeniden askıya alın. Örnekleri etiketli FACS tüplere aktarın. Numuneleri 4 °C'de tutun ve elde edilene kadar ışıktan koruyun.
   NOT: Bağışıklık hücreleri yapışkan olma eğilimine sahiptir. Hem tıkanma riskini hem de doublet sayısını en aza indirmek için son akış arabellene 1 mM EDTA eklenmesi önerilir.

5. T Hücre alt set paneli

1. Canlılık boyama yapın: Spin hücreleri (500 x g, 5 dk, 4 °C) bir plaka spinner kullanarak ve 1x PBS 200 μL ile hücreleri bir kez yıkayın. 1x PBS'de seyreltilmiş hücre impermade amin-reaktif boya (canlılık lekesi) bir stok çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, bu stok çözeltisinin 100 μL'lik hücre peletlerini yeniden askıya alın ve kuyu başına 2 μL'lik mutlak bir canlılık lekesi hacmi elde edin. 4 °C'de 15 dakika boyunca ışıktan korunur.
2. Numuneleri kuluçkaya yatırırken, ekstrasellüler boyama antikor kokteylini uygun hacimde 1x FACS tamponu ile hazırlayın. Hücreleri 200 μL 1x FACS tamponu ile iki kez yıkayın, aşağı doğru döndürün (500 x g, 5 dk, 4 °C) ve her peleti 100 μL antikor karışımı veya uygun kontrol karışımı ile yeniden askıya alın. 4 °C'de 30 dk boyunca ışıktan korunan kuluçka.
3. Üreticinin talimatlarına uygun bir fiksasyon ve permeabilizasyon kiti ile hücre içi boyama gerçekleştirin. Hücreleri 200 μL 1x FACS arabelleği ile iki kez yıkayın ve 200 μL fiksasyon arabelleğinde yeniden askıya alın. 4 °C'de 40 dk boyunca ışıktan korunan kuluçka.
4. Kuluçka sırasında, 1x permeabilizasyon uygun bir hacimde antikorlar (hücre içi boyama) kokteyl hazırlamak ve tampon yıkama. Hücreleri dönerek (750 x g, 5 dk, 4 °C) toplayın ve hücreleri 200 μL 1x perm/yıkama tamponu yla iki kez yıkayın.
   NOT: Fiksasyon ve permeabilizasyon düzgün pelet biraz daha zor olma eğilimindedir hücrelerde sonuçlanır. Sonraki yıkama adımlarında hücre kaybını en aza indirmek için santrifüj kuvvetini 750 x g'yeyükseltin. Alternatif olarak daha uzun bir dönme döngüsü de uygulanabilir. Ancak, bu hücreleri hazırlamak için gerekli olan çok daha uzun bir süre neden olur.
5. Spin hücreleri (750 x g, 5 dk, 4 °C) ve her pelet i100 μL antikor karışımı veya uygun kontrol karışımı ile resuspend. 4 °C'de 40 dk boyunca ışıktan korunan kuluçka.
6. Hücreleri 200 μL 1x perm/yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve 250 μL FACS + EDTA tamponu yla hücreleri yeniden askıya alın. Örnekleri etiketli FACS tüplere aktarın. Numuneleri 4 °C'de tutun ve elde edilene kadar ışıktan koruyun.
   NOT: Her antikor için bir doz titrasyon eğrisi gerçekleştirilerek optimal konsantrasyonun belirlenmesi gerekir. Antikorlar arasındaki konsantrasyon büyük ölçüde farklılık gösterir: CD3 ve CD80 1:1 seyreltme faktörü ile kullanılırken, CD11b ve CD4 1:6400 seyreltme faktörü ile kullanılmıştır. Antikor konsantrasyonu titrrating deneyler sırasında kullanılacak hücrelerin aynı sayıda kullanın.

6. Tazminat, uygun kontroller ve gating

1. Denemeyi ayarlama
   1. Bir kez optimal antikor konsantrasyonu spektral örtüşme ayarlamak için tazminat için lekesiz ve tek lekeli kontrolleri çalıştırın tespit edilmiştir.
      NOT: Tüm kompanse denetimlerini hem hücreler hem de tazminat boncuklarıyla çalıştırın. Tazminat için en parlak sonuçları (en yüksek Pozitif olayların En Yüksek MFI'si) ne üretirse onu kullanın. MFI ortalama floresan yoğunluğu anlamına gelir ve genellikle tanımlamak ve üretilen sinyal ortalama yoğunluğu tanımlamak ve böylece, antikor ifade düzeyini tanımlamak için kullanılır.
   2. Yeni bir çok renkli deneme başlatırken floresan eksi bir (FMO) denetimleri ve izotip denetimleri çalıştırın. FMO ile ilgili daha fazla bilgi daha önce¹⁹yayınlanmıştır .
   3. Her doku tipinin lekesiz kontrollerinde lökosit popülasyonunun saptanması için optimum İleri Dağılım Alanı (FSC-A) gerilimini ve Yan Dağılım Alanını (SSC-A) belirleyin.
      NOT: Fiksasyon ve permeabilizasyon işlemi hücrenin boyutlarını değiştirir. Böylece Monocyte Alt Set Paneli ve T Hücre Alt Kümesi Paneli için FSC-A ve SSC-A gerilimleri önemli ölçüde farklılık gösterir. T Hücre Alt Kümesi Paneli için en uygun voltajları bulmak için, FSC-A ve SSC-A değerlerini ayarlarken CD3 ve arka kapı ile lökosit popülasyonlarına doğru tek boyanmış hücreleri kullanın.
2. Gating stratejisi
   1. Optimal FSC-A ve SSC-A gerilimi belirlendikten sonra lökosit popülasyonuna bir ana kapı açın.
      NOT: Her denemeden önce sitometreyi üreticinin talimatlarına göre kalibrasyon boncuklarını kullanarak kalibre edin ve lekesiz boncuklar çalıştırın. Farklı zaman noktalarına sahip lökosit popülasyonları karşılaştırılabilir FSC ve SSC özelliklerine sahip olmalıdır (doku tipleri arasında hafif farklılıklar beklenmelidir ve normal). FSC ve SSC önemli sorun sitometre ve örnek üretimi ateş değişirse.
   2. Doublets hariç: Çizim FSC-A (y-ekseni) ve FSC-H (x-ekseni). Singlets bu arsa bir diyagonal olarak görünür. Tek kişilik kapı.
   3. Ölü hücreyi hariç tut: Çizim FVS510 (canlılık lekesi) (x ekseni) ve FSC-A (y ekseni). Ölü hücreler olumlu olaylar olarak görünür, böylece canlı hücrelere geçit.
      NOT: Gerçek negatif hücreler lekesiz kontrollerde görünür olacaktır. Böylece, lekeli numunelerden önce lekelenmemiş kontrolleri çalıştırırken her örnek kümesi için bu kapıyı ayarlayın. Daha fazla gating araştırılır antikor paneli ve hücre tipine bağlıdır. Bu protokolde kullanılan her panel için gating stratejileri sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 4'tebulunabilir.

Sonuçlar

Hem monosit alt kümesi panelinin hem de T hücre alt kümesi panelinin temsil sonuçları aşağıda açıklanmıştır.

Şekil 1, DMM tedavi edilen hayvanların kemik iliğinden toplanan bağışıklık hücreleri üzerindeki monosit alt kümesi paneli için hiyerarşik gating stratejisini göstermektedir. Aynı strateji diğer tüm doku tiplerinde kullanılmış ve doğrulanmış. Deney ihcaredilirken, monosit/makrofajları tanımlamak ve T-hücreleri ve enkazl...

Tartışmalar

Bu protokolde tanımlanan yöntemler, minrik dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku daki monosit/makrofajve T-hücrelerinden çeşitli alt kümeleri güvenilir bir şekilde tanımlamak için tasarlanmış ve test edilmiştir . Mevcut protokol kolayca farklı doku tipleri araştırmak için değiştirilebilir, veya diğer hücre tipleri antikoralışverişi tarafından, ve OA alternatif murine modelleri için kullanılabilir. Diğer doku tipleri test edilirken, bağışıklık hücrelerinin yüzey belirte...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst	BD	566385	Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	Monocyte Panel
Liberase, Research Grade	Roche	5401127001	Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg	BD	564985	Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg	BD	562454	Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg	BD	742274	T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg	BD	565250	Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg	BD	563061	T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg	BD	557596	T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg	BD	552775	T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg	BD	565480	T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg	BD	565261	T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg	BD	740664	T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg	BD	563687	Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg	BD	563332	T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg	BD	565411	Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg	BD	560408	T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg	BD	563414	Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg	BD	560593	Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg	BD	560600	Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg	BD	564143	T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg	BD	562894	T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer	N/A	N/A	Buffers	Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100Tst	BD	562574	Buffers