تحريض الخلايا اللبتومينينالتي تعديل عن طريق الحقن داخل الجمجمة

Summary

نحن نصف حقن داخل الجمجمة التي تستخدم إبرة عازمة في الطرف التي يمكن تثبيتها في الجمجمة، وبالتالي القضاء على خطر تلف parenchyma الكامنة. ويمكن استخدام هذا النهج لرسم خرائط المصير الوراثي والتلاعب في الخلايا اللولبية وتتبع حركة السائل النخاعي.

Abstract

يصف البروتوكول المبين هنا كيفية حقن الحلول بأمان ويدويًا من خلال الصهريج ماجنا مع القضاء على خطر تلف parenchyma الأساسية. توصي البروتوكولات المنشورة سابقًا باستخدام إبر مستقيمة يجب خفضها إلى 1-2 مم كحد أقصى من سطح الدورة. إن الانخفاض المفاجئ في المقاومة بمجرد ثقب الغشاء الجافي يجعل من الصعب الحفاظ على الإبرة في وضع ثابت. بدلا ً من ذلك، تستخدم طريقتنا إبرة منحنية عند الطرف الذي يمكن تثبيته ضد العظم القذالي للجمجمة، وبالتالي منع الحقنة من اختراق الأنسجة بعد تعامس الغشاء الجاف. الإجراء بسيط وقابل للتكرار ولا يسبب إزعاجًا طويل الأمد في الحيوانات التي يتم تشغيلها. نحن نصف استراتيجية الحقن داخل الجمجمة في سياق رسم خرائط المصير الوراثي للخلايا اللبتومينينجية الوعائية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام نفس التقنية لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية، مثل التحقيق في دور اللبتومينينج في التنمية العصبية وانتشار التهاب السحايا البكتيري، من خلال الاستئصال الوراثي للجينات المتورطة بشكل مفترض في هذه الظواهر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج الإجراء مع نظام ضخ آلي للتسليم المستمر واستخدامه لتتبع حركة السائل النخاعي عن طريق حقن الجزيئات الموسومة بفلورية.

Introduction

الخلايا الليبومينينجية هي مجموعة تشبه الخلايا الليفية من الخلايا المنظمة في طبقة رقيقة تتراكب في الدماغ وتعبر عن الجينات المتورطة في ربط الكولاجين (على سبيل المثال، Dcn و Lum)،وفي إنشاء حاجز في الدماغ بيننجيال (على سبيل المثال، Cldn11)^1،2. الخلايا اللبتومينينجية متورطة في مجموعة واسعة من الوظائف الفسيولوجية، من الرقابة الصارمة على تصريف السائل النخاعي³ إلى توجيه السلف العصبي في الدماغ^{النامية 4,5}. وقد اقترحت دراسة حديثة أيضا أن اللبتومينينجيات في حديثي الولادة قد تؤوي الخلايا شعاعية مثل غليا التي تهاجر إلى parenchyma الدماغ وتتطور إلى الخلايا العصبية القشرية وظيفية⁶.

وتقع الخلايا اللبتومينينجيال على مقربة من الخلايا الفلكية السطحية ومشاركتها معهم، فضلا عن استروجليا parenchymal الأخرى، والتعبير عن connexin-30 (Cx30)⁷. يسمح الإجراء الجراحي المبين أدناه بوضع علامات واسعة النطاق ومحددة لهذه الخلايا الرجالية عبر تسليم الإندوكسيفين لمرة واحدة في الصهريج ماجنا من الفئران المعدلة وراثياً معبرة بشكل مشروط عن tdTomato في Cx30⁺ الخلايا (أي باستخدام نظام CreER-loxP لرسم خرائط المصير). Endoxifen هو المستقلب النشط من تاموكسيفين ويحفز إعادة تركيب الخلايا التعبير ية عن CreER بنفس الطريقة التي يفعل تاموكسيفين. ومع ذلك ، فمن الحل الموصى به للتطبيق الموضعي لأنه يذوب في 5-10 ٪ DMSO ، بدلا من تركيزات عالية من الإيثانول. بالإضافة إلى ذلك ، لا يعبر endoxifen حاجز الدماغ meningeal ، وبالتالي تمكين إعادة تركيب محددة من الخلايا اللولبية ، دون وضع علامات على السكان Cx30⁺ astroglial الأساسية (انظر النتائج التمثيلية).

تهدف التقنية المعروضة هنا إلى حقن المركب يدويًا وبأمان في السائل النخاعي ، عبر الوصول المباشر إلى الصهريج ماجنا. على عكس الإجراءات الأخرى الأكثر توغلًا التي تتطلب عملية جراحية في القحف ، يسمح هذا النهج بغرس المركبات دون التسبب في تلف الجمجمة أو parenchyma في الدماغ. وبالتالي ، فإنه لا يرتبط مع تحريض ردود الفعل الالتهابية الناجمة عن تنشيط خلايا غليا parenchymal. على غرار استراتيجيات الحقن الأخرى الموصوفة قبل^8,9,10, يعتمد النهج الحالي على التعرض الجراحي لغشاء الدورة القذالي atlanto الذي يغطي الصهريج ماجنا , بعد تشريح حاد لعضلات الرقبة المتراكبة. ومع ذلك ، على عكس الإجراءات الأخرى ، نوصي باستخدام إبرة عازمة عند الطرف ، والتي يمكن تثبيتها ضد العظام القذالية أثناء الإدارة. وهذا سيمنع خطر اختراق الإبرة عميقة جدا وإتلاف المخيخ الكامنة والنخاع.

هذا الإجراء الجراحي متوافق مع تحقيقات تتبع النسب التي تهدف إلى رسم خرائط التغيرات في هويات الخلايا وطرق الهجرة من خلال طبقات parenchymal. كما يمكن تكييفه مع دراسات الاستئصال الوراثية التي تهدف إلى التحقيق في دور الخلايا اللبتومينينجية في الصحة والمرض ، مثل مساهمتها في التنمية القشرية⁵ أو انتشار التهاب السحايا البكتيري^3،11. وأخيرا، يمكن استخدامه لتتبع حركة السائل النخاعي عندما يقترن تسليم التراصد الفلوري في الحيوانات البرية.

Protocol

تمت الموافقة على العمليات الجراحية المقدمة بموجب هذا القانون من قبل ستوكهولم نورا Djurförsöksetiska Nämnd ونفذت بالاتفاق مع المواصفات المقدمة من معهد البحوث (معهد كارولينسكا، السويد).

ملاحظة: يمكن تكييف الحقن داخل الجمجمة بمرونة لأغراض بحثية متعددة. نحن نقدم أدناه إجراء وضعت لتسمية بكفاءة الخلايا leptomeningeal لرسم خرائط مصير على أساس حقن endoxifen في خط الماوس المعدلة وراثيا تحمل R26R-tdTomatoe¹² وCreER، وهذا الأخير تحت المروج Cx30¹³. ويمكن أن يتم وضع العلامات على هذه الخلايا من خلال حقن البنى الفيروسية باستخدام نفس الإجراء المبين أدناه. وأخيرا، يمكن استخدام هذا النهج لتتبع تدفق السائل النخاعي، عن طريق ضخ الترايات الفلورية.

1. إعداد نظام الحقن

ملاحظة: نوصي بإجراء العملية في غرفة جراحية مناسبة، وفي ظروف معقمة. يمكن تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام الحرارة (الأوتوكلاف، معقم الزجاج) أو تعقيمها باستخدام مطهر كيميائي رفيع المستوى إذا كانت حساسة للحرارة. شطف الأدوات قبل استخدامها عند استخدام التطهير الكيميائي أو السماح لهم بالتبريد عند تعقيمها مع الحرارة.

1. باستخدام ملقط، ثني إبرة حقنة الحقن إلى 30 درجة في 3 ملم من الطرف.
   ملاحظة: استخدام حقن هاملتون مع إبرة 30 G متشابكة.
2. إعداد 1 ملغ / مل من محلول endoxifen، المخفف في 10٪ DMSO وملء الحقنة مع إبرة عازمة.
   ملاحظة: إدارة 5 ميكرولتر من المركب لضمان التعرض على نطاق واسع للخلايا الرجالية في الماوس C57Bl/6j الكبار (حوالي 25-30 ز)، على الرغم من التجارب التجريبية التي تختبر تركيزات مختلفة وأحجام الحقن قد تكون ضرورية عند علاج الحيوانات من مختلف الأعمار والسلالات.
3. ضبط حامل رأس الماوس بحيث تكون قطعة الفم في حوالي 30 درجة من سطح الجدول الجراحي.
   ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام إطار مجسم مع تثبيت من ثلاث نقاط (أي الأذنين والفم) لهذا الإجراء. في هذه الحالة ، ومع ذلك ، سيتم إصلاح الحيوان فقط مع قطعة الفم ، في حين يمكن تمديد قضبان الأذن تحت أطراف الحيوان الأمامية واستخدامها لدعم جسم الحيوان أثناء الإجراء.

2. تحريض التخدير

1. بالنسبة للتخدير اتّصاليّاً، استخدم التركيزات وطرق الإدارة التي أوصت بها الوحدة البيطرية في المؤسسة المحلية.
2. بالنسبة للتخدير الاستنشاقي ، مثل الإسوفلوران ، قم بإعداد وحدة الإدارة وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة.
3. مع إيزوفران، تعيين تركيز المركب في 4٪ لتحريض التخدير.
4. تسليم الهواء بمعدل 400 مل/ دقيقة.
5. السماح للقسم للتخدير لملء الغرفة مع مخدر لبضع دقائق ووضع الماوس في الغرفة بعد ذلك.
   ملاحظة: للتجارب الحالية، استخدمنا الكبار (> 2 أشهر من العمر وحوالي 30 ز) الفئران المعدلة وراثيا من الذكور والإناث تحمل Cx30-CreER و R26R-tdTomato، وولدت على خلفية C57Bl/6j.
6. مراقبة الحيوان أثناء تحريض التخدير. يجب أن يبطئ نمط التنفس عندما يكون الماوس تحت التخدير الكامل.
7. إزالة الحيوان من الغرفة والتحقق من قمع منعكس مخلب عن طريق قرص بدقة الكفوف الخلفية.
   ملاحظة: قد يكون رد الفعل لا يزال موجودا ولكن تأخر بضع ثوان. إذا كان هذا هو الحال، وضع الحيوان مرة أخرى في الغرفة حتى تم تحقيق قمع كامل من رد فعل مخلب.
8. إعطاء مسكن (على سبيل المثال، كاربروفين، 5 ملغ/كغ من خلال الحقن تحت الجلد) للمساعدة في إدارة الألم بعد الجراحة.

3. تحديد موقع الحيوان لإجراء

1. أصلح رأس الحيوان على حامل الرأس. لتحسين إمكانية الوصول إلى الصهريج ماجنا ، ضع جسم الحيوان عند حوالي 30 درجة من سطح الطاولة والرأس بعنوان لأسفل ، لإنشاء زاوية 120 درجة مع بقية الجسم وتمديد الجزء الخلفي من الرقبة لتسهيل الوصول إلى الصهريج ماجنا(الشكل 1A).
2. إضافة المناشف الورقية تحت الحيوان لدعم جسمه طوال العملية.
3. تأمين تسليم التخدير من خلال قطعة الفم وتقليل تركيز الإيزوفدران إلى 2.5٪ وتسليم الهواء إلى 200 مل / دقيقة.
4. تطبيق مرهم العيون.

4. التعرض للسيستيرنا ماجنا

1. اعمل على التصغير في الجزء الخلفي من رقبة الحيوان وتعقيم المنطقة بـ 70% من الإيثانول والبيتادين.
2. باستخدام مقص الجراحية، إجراء شق خط الوسط (حوالي 7 ملم في الطول) بدءا من مستوى العظام القذالية وتمديدها الخلفي.
3. يفصل بلطف الأنسجة الضامة السطحية وعضلات الرقبة سحب جانبية من خط الوسط مع ملاقط تلميح غرامة. وهذا سوف يعرض الغشاء الجافي الذي يتراكب على الصهريج ماجنا ، على شكل مثلث مقلوب.
4. استخدم رماح امتصاص معقمة أو مسحات قطنية للتحكم في أي نزيف ناتج.
5. وضع فاصل جراحي صغير للحفاظ على عضلات الرقبة سحبت جانبا وتمكين التصور من الصهريج ماجنا طوال العملية.

5. الحقن داخل الجمجمة

1. للوصول إلى الصهريج ماجنا، حدد نهاية القذالي للعظم القذالي وأدخل الإبرة التي كانت عازمة في السابق مباشرة تحتها.
   ملاحظة: سيكون هناك انخفاض مفاجئ في المقاومة كما يتم ثقب الغشاء الجاف. ومع ذلك، فإن غيض من إبرة تخترق فقط قليلا تحت سطح الجلد، وذلك بفضل شكله مدمن مخدرات.
2. بمجرد أن يتم مبومة الدورة ، اسمح للطرف المنحني للإبرة باختراق تحت سطح الدورة عن طريق سحب الحقنة برفق إلى أعلى وبالتوازي مع جسم الحيوان ، من أجل "ربط" الإبرة بالجمجمة (انظر الشكل 1B). وهذا يضمن استقرار أفضل، وسوف تمنع الإبرة من اختراق أعمق، وبالتالي تجنب خطر إتلاف المخيخ الكامنة أو النخاع.
3. حقن المركب ببطء لتجنب التداخل مع التدفق الطبيعي للسائل النخاعي الطبيعي.
   ملاحظة: اعتمادا على الغرض من التجربة، قد يختلف معدل التسريب. إذا كان معدل التسريب البطيء والمطرد مطلوبًا (على سبيل المثال ، عند استخدام الإجراء لتتبع حركة السائل النخاعي) ، فقد يكون من المستحسن استخدام نظام ضخ صغير آلي بالاقتران مع الحقنة.
4. بعد الحقن، والسماح للإبرة بقية في الموقع لمدة 1 دقيقة وإزالته بعناية. استخدام ملقط تلميح غرامة للمساعدة في التراجع عن الإبرة من موقفها مدمن مخدرات.
   ملاحظة: استخدام إبرة رقيقة (على سبيل المثال، 30 G) لا يؤدي إلى تلف كبير في الغشاء السحادي، وما يترتب على ذلك من تدفق السائل النخاعي. إذا كانت أحجام أكبر إبرة مطلوبة, نوصي بوقف تسرب السوائل عن طريق تطبيق الضغط في موقع الحقن باستخدام طرف القطن المعقم.

6- اختتام الإجراءات والرعاية اللاحقة للعملية الجراحية

1. إزالة الفاصل والسماح للعضلات للعودة إلى موقفها الأصلي تراكب الغشاء الجاف.
2. أغلق شق الجلد باستخدام بضع قطرات من مادة لاصقة للسيانوكريلات.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدم الغرز القابلة للامتصاص (على سبيل المثال، 5-0 غرز الفيكريل) وأغلق شق الجلد بغرز متقطعة.
3. تطبيق مخدر موضعي (على سبيل المثال، 100 ميكرولتر من الليدوكائين 5٪ ) في موقع الشق.
4. إزالة الحيوان من حامل ووضعها في قفص نظيف وضعه على وسادة التدفئة. مراقبة الحيوان حتى يستعيد وعيه.
   ملاحظة: لا يتوقع أن يسبب هذا الإجراء ألمًا أو ضيقًا طويل الأمد في الحيوان. ومع ذلك ، يجب مراقبة الماوس عن كثب في الأيام الأولى بعد الجراحة ويمكن اتخاذ تدابير لتخفيف الألم كلما ارتئي ذلك ضروريًا ، ووفقًا للتوصيات المقدمة من الوحدة البيطرية في مؤسستك.

النتائج

حقن intracisternal من endoxifen في الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن CreER تحت المروج Cx30¹³ ومراسل الفلورسنت لا يمكن اختزالها يسمح لإعادة تركيب محددة من الخلايا اللبتومينينغيال دون وضع علامة على السطح المجاورة Cx30 التعبير والخلايا الفلكية parenchymal في القشرة(الشكل...

Discussion

البروتوكول المبين هنا يقدم إجراء مباشر واستنساخ لتسمية الخلايا اللولبية لرسم خرائط المصير. نحن نستخدم حقن intracisternal من endoxifen، المستقلب النشط من تاموكسيفين، للحث على التعبير عن مراسل tdTomato الفلورسنت في Cx30-CreER. R26R-tdTomato الفئران^12,13.

بالمقارنة مع ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia unit	Univentor 410	8323102	Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane)	Baxter Medical AB	000890
Betadine	Sigma-Aldrich	PVP1
Carprofen	Orion Pharma AB	014920	Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue	Carl Roth	0258.1	Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue	Stoelting	50479
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Endoxifen	Sigma-Aldrich	E8284
Ethanol 70%	Histolab	01370
Hamilton syringe (30 G beveled needle)	Hamilton	80300
Lidocaine	Aspen Nordic	520455
Mouse head holder	Narishige International	SGM-4	With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Shaver	Aesculap	GT420
Sterile absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator	World Precision Instrument	501897
Tweezers	Dumont	11251-35
Viscotears	Bausch&Lomb Nordic AB	541760