Индукция Leptomeningeal клеток Модификация через интрасистскую инъекцию

Резюме

Мы описываем intracisternal инъекции, которая использует иглу согнуты на кончике, которые могут быть стабилизированы к черепу, тем самым устраняя риск повреждения основной parenchyma. Этот подход может быть использован для генетического отображения судьбы и манипуляций лептоменангеновых клеток и для отслеживания движения спинномозговой жидкости.

Аннотация

В описанном здесь протоколе описывается, как безопасно и вручную вводить растворы через цистерну Магна, устраняя при этом риск повреждения основной паренхимы. Ранее опубликованные протоколы рекомендуют использовать прямые иглы, которые должны быть снижены до максимум 1-2 мм от поверхности dural. Внезапное падение сопротивления после того, как dural мембрана была проколота делает его трудно поддерживать иглу в устойчивом положении. Наш метод, вместо этого, использует иглу согнуты на кончике, которые могут быть стабилизированы против затылочной кости черепа, тем самым предотвращая шприц от проникновения в ткани после перфорации dural мембраны. Процедура проста, воспроизводима и не вызывает длительного дискомфорта у оперированных животных. Мы описываем стратегию инъекций в контексте генетической судьбы, отображающей сосудистые лептоменингеальные клетки. Кроме того, тот же метод может быть использован для решения широкого круга научных вопросов, таких, как зондирование роли лептоменингов в нейроразвитии и распространении бактериального менингита, путем генетической абляции генов, которые, как предполагается, причастны к этим явлениям. Кроме того, процедура может быть объединена с автоматизированной инфузионной системой для постоянной доставки и использована для отслеживания движения спинномозговой жидкости через инъекцию флуоресцентно обозначенных молекул.

Введение

Leptomeningeal клетки фибробласт-как популяция клеток организованы в тонком слое наложения мозга и выражения генов, причастных к коллагена перекрестные (например, Dcn и Лам), и в создании мозга менингеального барьера (например, Cldn11)^1,2. Лептоменингеальные клетки вовлечены в широкий спектр физиологических функций, от строгого контроля над спинномозговой жидкости дренаж^{ажиотажа 3} для руководства нейронных прародителей в развивающихся мозга^4,5. Недавнее исследование также предложило, что лептоменинги у новорожденного могут гавани радиальных глиаподобных клеток, которые мигрируют в мозг паренхимы и развиваются в функциональные корковые нейроны⁶.

Лептоменингеальные клетки расположены в непосредственной близости от поверхностных астроцитов и делятся с ними, а также другими паранхимальной астроглией, выражением коннексина-30 (Cx30)⁷. Хирургическая процедура, описанная ниже, позволяет широко и специфическую маркировку этих менингеальных клеток с помощью одноразовой доставки эндоксифена в⁺ цистерну магны трансгенных мышей, условно выражающих tdTomato в клетках Cx30 (т.е., с помощью системы CreER-loxP для картирования судьбы). Эндоксифен является активным метаболитом тамоксифена и индуцирует рекомбинацию Клеток, выражающих CreER, так же, как и тамоксифен. Это, однако, рекомендуемое решение для местного применения, поскольку он растворяется в 5-10% DMSO, вместо высоких концентраций этанола. Кроме того, эндоксифен не пересекает мозг-менингеальный барьер, тем самым позволяя специфическую рекомбинацию лептоменингеальных клеток, без маркировки лежащих в основе Cx30^- астроглиальной популяции (см. Представитель Результаты).

Техника, представленная здесь, направлена на ручной и безопасной инъекции соединения в спинномозговой жидкости, через прямой доступ к цистерны magna. В отличие от других, более инвазивных процедур, требующих краниотомии, этот подход позволяет наполнить соединения без нанесения ущерба черепу или мозгу паренхимы. Таким образом, это не связано с индукцией воспалительных реакций, вызванных активацией клеток паренхимальной глии. Как и другие стратегии инъекций, описанные до^8,9,10, нынешний подход опирается на хирургическое воздействие atlanto-затылочной дурфальной мембраны, охватывающей цистерну магны, после тупого вскрытия наложения мышц шеи. Однако, в отличие от других процедур, мы рекомендуем использовать иглу, согнутую на кончике, которая может быть стабилизирована против затылочной кости во время введения. Это предотвратит риск проникновения иглы слишком глубоко и повреждения основного мозжечка и медуллы.

Эта хирургическая процедура совместима с исследованиями отслеживания линий, которые направлены на отображение изменений в идентичности клеток и маршрутах миграции через паранхимальные слои. Он также может быть адаптирован к генетическим исследованиям абляции, которые намерены зондировать роль лептоменингеальных клеток в здоровье и болезни, такие как их вклад в корковое развитие⁵ или распространение бактериального менингита^3,11. Наконец, он может быть использован для отслеживания движения спинномозговой жидкости в сочетании с доставкой флуоресцентных трассаторов у диких животных.

протокол

Представленные в настоящее время хирургические процедуры были одобрены Стокгольмским Норре Джурсёксетиской Нюмнди и проведены в согласии со спецификациями, предоставленными научно-исследовательским институтом (Каролинский институт, Швеция).

ПРИМЕЧАНИЕ: Инрасистальная инъекция может быть гибко адаптирована для различных исследовательских целей. Мы представляем ниже процедуры, разработанной для эффективной маркировки leptomeningeal клеток для судьбы отображения на основе инъекции endoxifen в трансгенной линии мыши проведения R26R-tdTomato¹² и CreER, последний под Cx30 промоутер¹³. Маркировка этой популяции клеток может быть достигнута путем инъекций вирусных конструкций с использованием той же процедуры, изложенной ниже. Наконец, этот подход может быть использован для отслеживания спинномозговой жидкости потока, путем вливания флуоресцентных трассаторов.

1. Подготовка системы инъекций

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуем проводить процедуру в подходящем хирургическом кабинете и в асептических условиях. Хирургические инструменты могут быть стерилизованы с помощью тепла (автоклав, стеклянный стерилизатор) или дезинфицировать с помощью высокоуровневого химического дезинфицирующего средства, если они чувствительны к жаре. Промыть приборы перед использованием при применении химической дезинфекции или дать им остыть при дезинфекции с теплом.

1. Используя щипцы, согните иглу шприца для инъекций до 30 градусов при 3 мм от кончика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте шприцы Hamilton с 30 G сбитом иглой.
2. Приготовьте 1 мг/мл раствора эндоксифена, разбавленного 10% DMSO и заполните шприц согнутой иглой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Администрирование 5 зЛ соединения для обеспечения широкого воздействия менингеальных клеток во взрослой c57Bl/6j мыши (около 25-30 г), хотя экспериментальные эксперименты, которые проверяют различные концентрации и объемы инъекций может быть необходимо при лечении животных разных возрастов и штаммов.
3. Отрегулируйте держатель головки мыши так, что часть рта на приблизительно 30 «от поверхности хирургического таблицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры также может использоваться стереотаксическая рамка с трехточечной фиксацией (т.е. ушами и ртом). В этом случае, однако, животное будет исправлено только с частью рта, в то время как ухо баров может быть продлен под передние конечности животного и использоваться для поддержки тела животного во время процедуры.

2. Индукция анестезии

1. Для инъекционных анестезий, использование концентраций и способов управления рекомендованы ветеринарной единицы в местном учреждении.
2. Для ингаляционной анестезии, таких как изофлюран, подготовьте административный блок в соответствии со спецификациями производителя.
3. При изофруране установленная концентрация соединения на уровне 4% для индукции анестезии.
4. Доставка воздуха со скоростью 400 мл/мин.
5. Разрешить анестезии блок для заполнения камеры с анестезией в течение нескольких минут и поместить мышь в камеру после этого.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для нынешних экспериментов мы использовали взрослых (2 месяца и примерно 30 г) мужских и женских трансгенных мышей, несущих Cx30-CreER и R26R-tdTomato, и выведенных на фоне C57Bl/6j.
6. Мониторинг животного во время индукции анестезии. Дыхание должна замедлиться, когда мышь находится под полной анестезией.
7. Удалите животное из камеры и проверьте на подавление рефлекса лапы, деликатно щипая задние лапы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекс все еще может присутствовать, но задерживается на пару секунд. Если это так, поместите животное обратно в камеру до полного подавления лапы рефлекс был достигнут.
8. Администрирование анальгетика (например, карпрофен, 5 мг/кг через подкожную инъекцию) для оказания помощи послеоперационному обезболиванию.

3. Позиционирование животного для процедуры

1. Закрепите голову животного на держатель для головы. Для улучшения доступности цистерны magna, положение тела животного примерно на 30 "от поверхности стола и головы, названной вниз, чтобы установить угол 120" с остальной частью тела и расширить задней части шеи, чтобы облегчить доступ к цистерны магны (Рисунок 1A).
2. Добавить бумажные полотенца под животное, чтобы поддержать его тело на протяжении всей процедуры.
3. Безопасная доставка анестезии через рот кусок и уменьшить концентрацию изофлуран до 2,5% и доставки воздуха до 200 мл/ мин.
4. Нанесите офтальмологическую мазь.

4. Экспозиция Цистерны Магна

1. Бритье задней части шеи животного и дезинфицировать области с 70% этанола и бетадин.
2. Используя хирургические ножницы, выполните разрез средней линии (около 7 мм в длину), начиная с уровня затылочной кости и расширяя ее задним щипцем.
3. Аккуратно отделить поверхностные соединительной ткани и мышцше вытягивая боком от средней линии с тонкой наконечником пинцета. Это позволит разоблачить dural мембраны наложения цистерны magna, в форме перевернутого треугольника.
4. Используйте стерильные копья поглощения или ватные тампоны, чтобы контролировать любое резистское кровотечение.
5. Позиция небольшой хирургический сепаратор для поддержания мышц шеи вытащил в сторону и позволяют визуализации цистерны magna на протяжении всей процедуры.

5. Инрасистская инъекция

1. Чтобы получить доступ к цистерны магны, определить каудаальный конец затылочной кости и вставить иглу, которая ранее была согнута сразу под.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Там будет внезапное падение сопротивления, как dural мембрана проколота. Тем не менее, кончик иглы будет проникать лишь немного под менингеальной поверхности, благодаря своей зацепленным формами.
2. После того, как dura была перфорирована, позвольте изогнутой кончик иглы проникнуть под поверхностью дюрара, осторожно потянув шприц вверх и параллельно телу животного, для того, чтобы "крючок" иглы к черепу (см. Рисунок 1B). Это обеспечит лучшую стабильность и предотвратит проникновение иглы глубже, тем самым избегая риска повреждения основного мозжечка или медуллы.
3. Вводят соединение медленно, чтобы избежать вмешательства в естественный поток спинномозговой жидкости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от цели эксперимента, скорость инфузии может варьироваться. Если требуется медленный и устойчивый инфузионный темп (например, при использовании процедуры для отслеживания движения спинномозговой жидкости), может быть целесообразным использовать автоматизированную систему микроинфузии в сочетании со шприцем.
4. После инъекции, пусть игла отдыхана в месте в течение 1 мин и тщательно удалить его. Используйте мелкие щипцы наконечник, чтобы помочь опрокидыванию иглы из его крючковатого положения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование тонкой иглы (например, 30 G) не приводит к существенному повреждению менингеальной мембраны и последующему оттоку спинномозговой жидкости. Если требуются большие размеры игл, мы рекомендуем остановить утечку жидкости, применяя давление в месте инъекции с помощью стерильного кончика хлопка.

6. Заключение процедуры и послеоперационного ухода

1. Удалите сепаратор и позвольте мышцам вернуться к исходной позиции, накладывающей на дуральную мембрану.
2. Закройте разрез кожи с помощью нескольких капель цианоакрилата клея.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, используйте абсорбируемые швы (например, 5-0 швы vicryl) и закройте разрез кожи с прерванными швами.
3. Нанесите местную анестезию (например, 100 л 5% лидокаина) на место разреза.
4. Удалите животное из держателя и поместите в чистую клетку, расположенную на грелке. Следите за животным, пока оно не придет в сознание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура не должна вызывать длительную боль или страдания у животного. Тем не менее, мышь должна быть тщательно проверена в течение первых послеоперационных дней и меры по облегчению боли могут быть предприняты, когда это сочтет необходимым, и в соответствии с рекомендациями, предоставленными ветеринарным подразделением в вашем учреждении.

Результаты

Инрасистальная инъекция эндоксифена у трансгенных мышей, выражающих CreER под промоутером Cx30¹³ и индуцированным флуоресцентным репортером, позволяет проводить специфическую рекомбинацию лептоменингеальных клеток без маркировки соседней поверхности Cx30 и...

Обсуждение

Протокол, изложенный здесь представляет собой простую и воспроизводимую процедуру для обозначения лептоменингеальных клеток для картирования судьбы. Мы используем инрасистскую инъекцию эндоксифена, активного метаболита тамоксифена, чтобы вызвать выражение флуоресцентного репорте...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia unit	Univentor 410	8323102	Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane)	Baxter Medical AB	000890
Betadine	Sigma-Aldrich	PVP1
Carprofen	Orion Pharma AB	014920	Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue	Carl Roth	0258.1	Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue	Stoelting	50479
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Endoxifen	Sigma-Aldrich	E8284
Ethanol 70%	Histolab	01370
Hamilton syringe (30 G beveled needle)	Hamilton	80300
Lidocaine	Aspen Nordic	520455
Mouse head holder	Narishige International	SGM-4	With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Shaver	Aesculap	GT420
Sterile absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator	World Precision Instrument	501897
Tweezers	Dumont	11251-35
Viscotears	Bausch&Lomb Nordic AB	541760