אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

Summary

אנו מתארים הזרקה תאיים כי מעסיקה מחט כפוף בקצה כי ניתן לייצב את הגולגולת, ובכך לחסל את הסיכון של נזק על הבסיס הבסיסי. הגישה יכולה לשמש למיפוי הגורל הגנטי ומניפולציות של תאים לטומאנעיים ולמעקב אחר תנועת נוזל מוחי שדרתי.

Abstract

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר כיצד להזריק בביטחה ובאופן ידני פתרונות דרך הcisterna מגנה תוך סילוק הסיכון לנזק על הבסיס הבסיסי. פרוטוקולים שפורסמו בעבר ממליצים באמצעות מחטים ישר כי יש להוריד למקסימום של 1-2 מ"מ מהמשטח ריר. ירידה פתאומית התנגדות פעם קרום ריר כבר נוקב מקשה לשמור על המחט במצב קבוע. השיטה שלנו, במקום זאת, מעסיקה מחט כפופה לקצה שניתן לייצב כנגד עצם העורף של הגולגולת, ובכך למנוע ממזרק לחדור לתוך הרקמה לאחר ניקוב הקרום הריר. הנוהל הוא פשוט, מנוכל, ואינו גורם לאי נוחות ארוכת טווח בבעלי החיים המופעלים. אנו מתארים את אסטרטגיית ההזרקה תאיים בהקשר של מיפוי הגורל הגנטי של תאי כלי דם ללפטואנגים. אותה טכניקה יכולה, יתר על כן, להיות מנוצל כדי להתמודד עם מגוון רחב של שאלות מחקר, כגון בדיקה את התפקיד של לטומאנטינוגים ב-נוירופיתוח והתפשטות של דלקת קרום המוח בקטריאלי, באמצעות צריבה גנטית של גנים מעורבים בתופעות אלה. בנוסף, ההליך יכול להיות משולב עם מערכת אינפוזיה יצרנית עבור מסירה קבועה משמש למעקב אחר התנועה נוזל מוחי באמצעות הזרקה של מולקולות המסומנת באופן פלואורוסקופים.

Introduction

תאים לטומאננטאל הם האוכלוסייה הדומה ביותר של תאים מאורגנים בשכבה דקה על ידי הנחת המוח וביטוי גנים מעורבים קולגן הקישור (g., dcn ו לאם), ובהקמת מחסום מאנקרום המוח (g, Cldn11)^1,2. תאים לטומניניאל מעורבים במגוון רחב של תפקודים פיזיולוגיים, החל משליטה קפדנית על ניקוז נוזל השדרה השדרתי³ להדרכה של ושלתי עצביים במוח המתפתח^4,5. מחקר שנערך לאחרונה הציע גם כי לפטטואנגים ב היילוד עשוי הנמל הרדיאלי של התאים הרדיאליים להגר למוח בתוך מתוך מעגל ולהתפתח נוירונים בקליפת כליה⁶.

תאים לטומאנציטים ממוקמים בסמיכות לפני השטח אסטרוציטים ולשתף איתם, כמו גם בנוסף astrochymal אסטרוגליה, ביטוי של קונשין-30 (Cx30)⁷. הליך כירורגי המתואר להלן מאפשר התוויות נרחב וספציפי של התאים האלה מנאינטיים באמצעות מסירה חד פעמי של אנקסיפן לתוך cisterna מגנה של עכברים טרנסגניים מותנית ביטוי tdTomato ב Cx30⁺ תאים (כלומר, באמצעות creer-loxp מערכת עבור מיפוי הגורל). אנדוקסיפן הוא מטבוליט פעיל של טמוקסיפן ומעורר שילוב של תאים של מבטא CreER באותו אופן כמו טממוקסיפן. זה, עם זאת, את הפתרון המומלץ עבור יישום אקטואלי כי הוא מתמוסס ב 5-10% DMSO, במקום ריכוזים גבוהים של אתנול. בנוסף, אנדוקסיפן אינו חוצה את מחסום המוח, ובכך מאפשר שילוב מיוחד של תאי לפטומאל, ללא תיוג של אוכלוסיית Cx30⁺ astroglial המשמשת כבסיס (ראה תוצאות מייצגות).

הטכניקה המוצגת כאן מכוונת באופן ידני ובטוח להזריק את המתחם בנוזל השדרתי, דרך גישה ישירה לcisterna מגנה. שלא כמו אחרים, הליכים פולשניים יותר הדורשים פתיחת גולגולת, גישה זו מאפשרת להשרות תרכובות מבלי לגרום נזק לגולגולת או המוח מכימומה. כך, הוא אינו משויך אינדוקציה של תגובות דלקתיות המופעל על ידי הפעלת תאים של המוקף מעקב. בדומה לאסטרטגיות הזרקה אחרות שתוארו לפני^8,9,10, הגישה הנוכחית מסתמך על חשיפה כירורגית של קרום ריר העורף של atlanto-העורפית המכסה את cisterna מגנה, לאחר ניתוח קהה של שרירי הצוואר כיסה נחת. עם זאת, בניגוד להליכים אחרים, אנו ממליצים על שימוש במחט כפופה לקצה, אשר ניתן לייצב נגד עצם העורף במהלך הממשל. זה ימנע את הסיכון של המחט חודר עמוק מדי ופוגע המוח החלק האחורי ואת לשד.

הליך כירורגי זה תואם לחקירות מעקב אחר שושלת היוחסין המטרתן לבצע מיפוי שינויים בזהויות תאים ובנתיבי הגירה באמצעות שכבות של מסלולים. זה יכול גם להיות מותאם למחקרים הגנטי אבלציה שבכוונתך לחקור את התפקיד של תאים לטומאנאינאל בריאות ומחלות, כגון תרומתם להתפתחות קורטיקלית⁵ או התפשטות של דלקת קרום העין של חיידקים^3,11. לבסוף, זה יכול להיות מנוצל כדי לעקוב אחר תנועת נוזל השדרה השדרתי כאשר בשילוב עם משלוח של מעוקב פלורסנט בחיות מסוג wildtype.

Protocol

הליכים כירורגיים שהוצגו בזאת אושרו על ידי Stockholms Norra Dnförssetiska Nämnd ובוצע בהסכמה עם מפרטים שסופקו על ידי מכון המחקר (Karolinska מכון, שוודיה).

הערה: הזרקת התאיים ניתן להתאים בגמישות למטרות מחקר מרובים. אנו מציגים להלן הליך שפותח ביעילות תווית לטומטואנגים לפני מיפוי הגורל מבוסס על הזרקה של אנדוקסיפן בקו העכבר הטרנסגניים נושאת R26R-tdTomato¹² ו creer, האחרון תחת Cx30 יזם¹³. ניתן להשיג התוויות של אוכלוסיה זו של תאים באמצעות הזרקה של מבנים ויראליים באמצעות אותו ההליך המתואר להלן. לבסוף, גישה זו יכולה להיות מועסק עבור מעקב אחר זרימת נוזל מוחי שדרתי, על ידי אינפוזיה של מעוקב פלורסנט.

1. הכנת מערכת ההזרקה

הערה: אנו ממליצים לבצע את ההליך בחדר ניתוח מתאים, ובתנאים אספטי. כלים כירורגיים יכולים להיות מעוקר באמצעות חום (החיטוי, מעקר זכוכית מחוטא) או מחוטא באמצעות חיטוי כימי ברמה גבוהה אם הם רגישים לחום. לשטוף את המכשירים לפני השימוש בעת העסקת חיטוי כימי או לאפשר להם להתקרר כאשר מחוטא עם חום.

1. באמצעות מלקחיים, לכופף את המחט של מזרק הזריקה כדי 30 ° ב 3 מ"מ מהקצה.
   הערה: השתמש מזרקים המילטון עם מחט משופע 30 G.
2. הכינו 1 מ"ג/mL של פתרון אנדוקסיפן, מדולל 10% dmso ו-ילוי רקע את המזרק עם המחט הכפופה.
   הערה: מנהל 5 μL של המתחם כדי להבטיח חשיפה נרחבת של תאים ממנגים בעכבר C57Bl/6j למבוגרים (ca. 25-30 g), למרות ניסויים פיילוט כי בדיקת ריכוזים שונים אמצעי אחסון הזרקה עשוי להיות נחוץ בעת טיפול בבעלי חיים של גילאים שונים וזנים.
3. כוונן את מחזיק ראש העכבר כך שפיסת הפה תהיה בערך 30 ° מהמשטח של השולחן הכירורגי.
   הערה: ניתן להשתמש במסגרת סטריאוטקטיקה עם קיבוע של שלוש נקודות (כלומר, אוזניים ושפה) עבור הליך זה. אולם, במקרה זה, החיה תהיה קבועה רק עם פיסת הפה, בעוד שפסי האוזן יכולים להיות מורחבים תחת העצמות של בעל החיים ולשמש לתמיכה בגוף החיה במהלך ההליך.

2. אינדוקציה של הרדמה

1. לזריקות הרדמה, להשתמש בריכוזים ובמצבי הניהול המומלצים על ידי היחידה הוטרינרית במוסד המקומי.
2. למכשיר הרדמה, כגון isof, הכינו את יחידת הניהול בהתאם למפרט היצרן.
3. . ב -4% לצורך הרדמה
4. אספקת אוויר בקצב של 400 mL/min.
5. אפשר ליחידת ההרדמה למלא את החדר עם ההרדמה לכמה דקות ולמקם את העכבר בתא לאחר מכן.
   הערה: עבור הניסויים הנוכחיים, השתמשנו במבוגר (> 2 חודשים ובערך 30 g) עכברים מעבר זכר ונקבה הנושאים Cx30-CreER ו R26R-tdTomato, והתרבו על רקע C57Bl/6j.
6. לעקוב אחר החיה במהלך אינדוקציה של הרדמה. דפוס הנשימה אמור להאט כאשר העכבר נמצא תחת הרדמה מלאה.
7. הסר את בעל החיים מהתא ובדוק אם הדיכוי של הרפלקס בכף היד מצבטת בעדינות את הכפות האחוריות.
   הערה: ייתכן כי הרפלקס עדיין קיים אך מתעכב כמה שניות. אם זה המקרה, מניחים את בעל החיים בחדר עד שהדחקה המוחלטת של הרפלקס של הכפה הושגה.
8. ניהול כאבים (למשל, Carprofen, 5 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה תת עורית) כדי לסייע ניהול לאחר הניתוח כאב.

3. מיקום בעל החיים לפרוצדורה

1. התקן את ראשו של בעל החיים על מחזיק הראש. כדי לשפר את הנגישות cisterna מגנה, למקם את הגוף של החיה על כ 30 ° מהמשטח של השולחן ואת הראש שכותרתו כלפי מטה, כדי ליצור זווית של 120 ° עם שאר הגוף ולהאריך את גב הצוואר כדי להקל על הגישה לcisterna מגנה (איור 1א).
2. הוסיפו מגבות נייר מתחת לבעל החיים כדי לתמוך בגופה לאורך כל התהליך.
3. מאובטח משלוח הרדמה דרך פיסת הפה ולהפחית את הריכוז isof, כדי 2.5% ומשלוח האוויר 200 ml/min.
4. החלת משחה אופטלמולוגית.

4. חשיפת הCisterna מגנה

1. לגלח את העורף של החיה ולחטא את האזור עם 70% אתנול ובטאדין.
2. באמצעות מספריים כירורגי, לבצע חתך באמצע הדרך (ca. 7 מ"מ באורך) החל ברמה של עצם העורף והרחבת אותו באופן פוקטילי.
3. להפריד בעדינות רקמת חיבור שטחית ושרירי הצוואר משיכת הצידה מן הקו האמצע עם מלקחיים טיפים עדינים. זה יחשוף את קרום ריר מעל הנחת הcisterna מגנה, בצורת משולש הפוך.
4. השתמש בחניתות ספיגה סטרילית או בתחבושות כותנה כדי לשלוט על כל דימום התוצאה.
5. מיקום מפריד כירורגי קטן כדי לשמור על שרירי הצוואר משכה הצידה ולאפשר ויזואליזציה של cisterna מגנה במהלך ההליך.

5. הזרקה בתוך ההחדרה

1. כדי לקבל גישה cisterna מגנה, לזהות את קצה caudal של עצם העורף ולהכניס את המחט כי היה כפוף בעבר מיד מתחת.
   הערה: תהיה ירידה פתאומית ההתנגדות כמו קרום ריר מנוקב. עם זאת, קצה המחט יחדור מעט מתחת לפני השטח של המננגיאל, תודות לצורתו המכורה.
2. לאחר מחורר השכבה, הניחו לקצה העקום של המחט לחדור מתחת לפני השטח הריר על-ידי משיכת המזרק בעדינות כלפי מעלה ובמקביל לגוף החיה, כדי "לחבר" את המחט לגולגולת (ראה איור 1ב). זה יבטיח יציבות טובה יותר ותמנע את המחט מלחדור עמוק יותר, ובכך למנוע את הסיכון של פגיעה המוח החסר הבסיסית או לשד.
3. הכנס לאט את התרכובת כדי למנוע הפרעות בזרימה הטבעית של נוזל השידרה.
   הערה: בהתאם למטרת הניסוי, קצב העירוי עשוי להשתנות. אם שיעור העירוי האיטי והיציב נדרש (למשל, בעת שימוש בהליך למעקב אחר תנועת נוזל השדרה השדרתי), ייתכן שמומלץ להשתמש במערכת מיקרואינפוזיה יצרנית בשילוב עם המזרק.
4. לאחר ההזרקה, תן את המחט לנוח באתר 1 דקות ובזהירות להסיר אותו. השתמש מלקחיים עצה עדין כדי לסייע לנסיגה של המחט מן העמדה מכורה שלה.
   הערה: השימוש במחט דקה (למשל, 30 G) אינו מוביל לנזק משמעותי של קרום המנאינאל, והזרימה הזורמת של נוזל השדרתי. אם יש צורך במידות מחטים גדולות יותר, אנו ממליצים לעצור את דליפת הנוזלים על-ידי הפעלת לחץ באתר ההזרקה באמצעות קצה כותנה סטרילי.

6. הסכם הליך וטיפול שלאחר הניתוח

1. להסיר את המפריד ולאפשר לשרירים לחזור למיקום המקורי שלהם הנחת קרום ריר.
2. סגרו את חתך העור באמצעות מספר טיפות של דבק ציאנואקרילי.
   הערה: לחילופין, יש להשתמש בתפרים נספגים (למשל, 5-0 תפרים ולאחר תפר) ולסגור את חתך העור בתפרים מקוטע.
3. החל הרדמה מקומית (למשל, 100 μL של 5% לידוקאין) באתר החתך.
4. הסר את בעל החיים מן המחזיק ומקום בכלוב נקי ממוקם על כרית חימום. לעקוב אחר בעל החיים עד שהוא חוזר להכרתו.
   הערה: הנוהל אינו צפוי לגרום לכאב או למצוקה ארוכי-טווח בבעלי החיים. עם זאת, על העכבר להיות מנוטר באופן מדוק עבור הימים הראשונים של הניתוח ואמצעי הסיוע לכאב ניתן לעשות בכל פעם שהוא נראה הכרחי, ובהתאם להמלצות שסיפק היחידה הוטרינרית במוסד שלך.

תוצאות

הזרקה התאיים של אנדוקסיפן בעכברים טרנסגניים המבטא CreER תחת Cx30 יזם¹³ ו עיתונאי פלורסנט inducible מאפשר שילוב מסוים של תאים לטומאנואנציטים ללא תיוג השכנה Cx30-המבטא השכנות ו-משטח astrochymal בקליפת המוח (איור 1). על מנת לקבל גישה לcisterna מגנה, בעל החיים מורדם ממ...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מציג הליך פשוט וברור לתייג תאים לטומאנציאל מיפוי הגורל. אנו משתמשים הזרקה תאיים של אנדוקסיפן, מטבוליט פעיל של טממוקסיפן, כדי לגרום לביטוי של כתבת פלורסנט tdTomato ב Cx30-CreER; . R26R. עכברים^12,13-

לעומת פרוטוקולים אחרים המשמשים לקבלת ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia unit	Univentor 410	8323102	Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane)	Baxter Medical AB	000890
Betadine	Sigma-Aldrich	PVP1
Carprofen	Orion Pharma AB	014920	Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue	Carl Roth	0258.1	Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue	Stoelting	50479
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Endoxifen	Sigma-Aldrich	E8284
Ethanol 70%	Histolab	01370
Hamilton syringe (30 G beveled needle)	Hamilton	80300
Lidocaine	Aspen Nordic	520455
Mouse head holder	Narishige International	SGM-4	With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Shaver	Aesculap	GT420
Sterile absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator	World Precision Instrument	501897
Tweezers	Dumont	11251-35
Viscotears	Bausch&Lomb Nordic AB	541760