JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz kafatası stabilize edilebilir ucunda bir iğne bükülmüş bir intrasisternal enjeksiyon tarif, böylece altta yatan parankim hasar riskini ortadan kaldırarak. Bu yaklaşım, leptomeningeal hücrelerin genetik kader haritalanması ve manipülasyonları ve beyin-omurilik sıvısı hareketini izlemek için kullanılabilir.

Özet

Burada özetlenen protokol, altta yatan parankimhasar riskini ortadan kaldırırken sarnıç magna yoluyla güvenli ve elle çözelti enjekte nasıl açıklanır. Daha önce yayınlanan protokoller dural yüzeyden maksimum 1-2 mm indirilmelidir düz iğneler kullanmanızı öneririz. Dural membran delindikten sonra dirençteki ani düşüş, iğnenin sabit bir pozisyonda tutulmasını zorlaştırır. Yöntemimiz, bunun yerine, kafatasının oksipital kemiğine karşı stabilize edilebilen bir iğne bükülür, böylece dural zarın delinmesi sonrasında şırınganın dokuya girmesini önler. Prosedür basit, tekrarlanabilir ve işletilen hayvanlarda uzun süreli rahatsızlık neden olmaz. İntrasisternal enjeksiyon stratejisini vasküler leptomeningeal hücrelerin genetik kader haritasını çıkarmak bağlamında tanımlıyoruz. Aynı teknik, ayrıca, nörogelişimle leptomeninglerin rolünün araştırılması ve bakteriyel menenjitin yayılması gibi çok çeşitli araştırma sorularını ele almak için, bu fenomenlere dahil olan genlerin genetik ablasyonyoluyla kullanılabilir. Ayrıca, prosedür sürekli teslimat için bir otomatize infüzyon sistemi ile kombine edilebilir ve floresan etiketli moleküllerin enjeksiyonu yoluyla beyin omurilik sıvısı hareketini izlemek için kullanılır.

Giriş

Leptomeningeal hücreler, beyni büstü eden ve kollajen çapraz bağlama (örneğin, Dcn ve Lum)karıştığı genleri ifade eden ince bir tabaka halinde organize edilmiş ve beyin meningeal bariyerinin kurulmasında (örn. Cldn11)1,,2. Leptomeningeal hücreler fizyolojik fonksiyonların geniş bir yelpazede karıştığı, beyin omurilik sıvı drenaj üzerinde sıkı kontrol3 gelişmekte olan beyinde nöral atalarının rehberlikiçin 4,5. Yeni bir çalışma da yenidoğan leptomeningler beyin parankim içine göç ve fonksiyonel kortikal nöronlar6geliştirmek radyal glia benzeri hücreleri barındırabilir önerdi .

Leptomeningeal hücreler yüzey astrositleri yakın yer ve onlarla paylaşmak, yanı sıra diğer parenkimal astroglia, connexin-30 (Cx30)7ifadesi . Aşağıda özetlenen cerrahi işlem, transgenik farelerin sarnıca magna içine endoksifen bir kerelik teslim yoluyla bu menenjial hücrelerin yaygın ve spesifik etiketleme sağlar şartlı Cx30tdTomato ifade + hücreler (yani, kader haritalama için bir CreER-loxP sistemi kullanarak). Endoksifen Tamoksifen aktif bir metaboliti ve Tamoxifen yaptığı gibi creer ifade hücrelerinin rekombinasyon indükler. Ancak, yüksek etanol konsantrasyonları yerine %5-10 DMSO'da çözünde nedeniyle topikal uygulama için önerilen çözümdür. Ayrıca, endoksifen beyin-meningeal bariyeri geçmez, böylece leptomeningeal hücrelerin özel rekombinasyon sağlayan, altta yatan Cx30 etiketleme olmadan+ astroglial popülasyon (Temsili Sonuçlarbakınız).

Burada sunulan teknik, sarnıç magna doğrudan erişim yoluyla, beyin omurilik sıvısı bileşik el ile ve güvenli bir şekilde enjekte etmeyi amaçlamaktadır. Kraniyotomi gerektiren diğer, daha invaziv prosedürlerin aksine, Bu yaklaşım kafatası veya beyin parankim zarar vermeden bileşikler aşılamak için izin verir. Böylece, parankimal glia hücrelerinin aktivasyonu ile tetiklenen inflamatuar reaksiyonların indüksiyon uyruk ile ilişkili değildir. Önce açıklanan diğer enjeksiyon stratejileri benzer8,9,10, Mevcut yaklaşım sarnıç magna kapsayan atlanto-oksipital dural membran cerrahi maruz kalma dayanır, boyun kaslarının künt diseksiyon sonra. Ancak, diğer prosedürlerin aksine, biz uygulama sırasında oksipital kemik karşı stabilize edilebilir ucunda bükülmüş bir iğne kullanılmasını öneririz. Bu iğne çok derin nüfuz ve altta yatan beyincik ve medulla zarar riskini önleyecektir.

Bu cerrahi işlem, hücre kimliklerinde ve parankimal tabakalar yoluyla göç yollarındaki değişikliklerin haritalamasını amaçlayan soy izleme araştırmalarıyla uyumludur. Aynı zamanda sağlık ve hastalık leptomeningeal hücrelerin rolünü araştırmak niyetinde genetik ablasyon çalışmalara adapte edilebilir, kortikal gelişime katkıları gibi5 veya bakteriyel menenjit yayılması3,11. Son olarak, yaban tipi hayvanlarda floresan izleyicilerin teslimatı ile kombine edildiğinde beyin omurilik sıvısı hareketini izlemek için kullanılabilir.

Protokol

Burada sunulan cerrahi prosedürler Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd tarafından onaylanmış ve araştırma enstitüsü (Karolinska Enstitüsü, İsveç) tarafından sağlanan spesifikasyonlar ile uyum içinde yürütülmüştür.

NOT: İntrasisternal enjeksiyon esnek bir şekilde birden fazla araştırma amacıyla uyarlanabilir. Biz verimli r26R-tdTomato12 ve CreER taşıyan bir transgenik fare hattı nda endoksifen enjeksiyonu dayalı kader haritalama için leptomeningeal hücreleri etiketlemek için geliştirilen bir prosedür aşağıda mevcut, Cx30 organizatörü altında ikinci13. Bu hücre popülasyonunun etiketlenmesi, aşağıda özetlenen aynı prosedür kullanılarak viral yapılar enjeksiyonu ile elde edilebilir. Son olarak, bu yaklaşım floresan izleyicilerin infüzyonu ile beyin omurilik sıvısı akışını izlemek için istihdam edilebilir.

1. Enjeksiyon Sisteminin Hazırlanması

NOT: İşlemi uygun bir cerrahi odada ve aseptik koşullarda gerçekleştirmenizi öneririz. Cerrahi aletler ısı (otoklav, cam boncuk sterilizatör) kullanılarak sterilize edilebilir veya ısıya duyarlı iseler üst düzey kimyasal dezenfektan kullanılarak dezenfekte edilebilir. Kimyasal dezenfeksiyon kullanırken kullanmadan önce aletleri durulayın veya ısı ile dezenfekte edildiğinde soğumasını bekleyin.

  1. Forceps kullanarak, enjeksiyon şırıngasının iğnesini uçtan 3 mm'ye kadar 30° bükün.
    NOT: Hamilton şırıngalarını 30 G'lik bir iğneyle kullanın.
  2. 1 mg/mL endoksifen çözeltisi hazırlayın, %10 DMSO ile seyreltin ve şırıngayı bükülmüş iğneile doldurun.
    NOT: Yetişkin C57Bl/6j farede (yaklaşık 25-30 g) meningeal hücrelerin yaygın olarak maruz kalmasını sağlamak için bileşiğin 5 μL'sini uygulayın, ancak farklı yaş ve suştaki hayvanların tedavisinde farklı konsantrasyonları ve enjeksiyon hacimlerini test eden pilot deneyler gerekebilir.
  3. Fare baş tutucuyu, ağız parçasının cerrahi masanın yüzeyinden yaklaşık 30° uzakta olacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Bu işlem için üç noktalı fiksasyona sahip stereotaktik bir çerçeve (örn. kulaklar ve ağız) da kullanılabilir. Ancak bu durumda, hayvan sadece ağız parçası ile sabitlenir, kulak çubukları ise hayvanın ön ayakları altında uzatılabilir ve işlem sırasında hayvanın vücudunu desteklemek için kullanılabilir.

2. Anestezi İndüksiyonu

  1. Enjekte edilebilir anestezikler için, yerel kurumdaki veteriner birimi tarafından önerilen konsantrasyonları ve yönetim modlarını kullanın.
  2. Isoflurane gibi inhalasyonanestezileri için, yönetim birimini üreticinin özelliklerine göre hazırlar.
  3. Isofluran ile, anestezi indüksiyonu için% 4 bileşik konsantrasyonu ayarlayın.
  4. Havayı 400 mL/dk hızında teslim edin.
  5. Anestezi ünitesinin odayı anestezi ile doldurmasına izin verin ve fareyi daha sonra odaya yerleştirin.
    NOT: Mevcut deneyler için, biz yetişkin (>2 aylık ve yaklaşık 30 g) Erkek ve kadın transgenik fareler Cx30-CreER ve R26R-tdTomato taşıyan ve C57Bl/6j arka plan üzerinde yetiştirilen kullandık.
  6. Anestezi indüksiyonu sırasında hayvanı izleyin. Fare tam anestezi altında yken solunum şekli yavaşlamalıdır.
  7. Odasından hayvan çıkarın ve ince arka pençeleri pinching tarafından pençe refleks bastırma için kontrol edin.
    NOT: Refleks hala mevcut olabilir ama birkaç saniye gecikti. Bu durumda, pençe refleks tam bastırma elde edilene kadar odaya geri hayvan yerleştirin.
  8. Postoperatif ağrı yönetimine yardımcı olmak için analjezik (örneğin, Karprofen, deri altı enjeksiyon yoluyla 5 mg/kg) uygulayın.

3. Hayvanın Prosedüre Göre Konumlandırılması

  1. Hayvanın kafasını baş tutucuya doğru düzelt. Sarnıç magna'ya erişilebilirliği artırmak için, hayvanın vücudunu masa yüzeyinden yaklaşık 30° konumlandırın ve baş aşağı doğru başlıklı olarak, vücudun geri kalanıyla 120° bir açı oluşturmak ve sarnıç magnasına erişimi kolaylaştırmak için boynun arkasını uzatmak için(Şekil 1A).
  2. Prosedür boyunca vücudunu desteklemek için hayvanın altına kağıt havlu ekleyin.
  3. Ağız parçası ile anestezi iletimi güvenli ve isofluran konsantrasyonu azaltmak 2.5% ve hava teslimatı 200 ml/dak.
  4. Oftalmik merhem uygulayın.

4. Cisterna Magna pozlama

  1. Hayvanın boynunun arkasını tıraş edin ve %70 etanol ve Betadine ile bölgeyi dezenfekte edin.
  2. Cerrahi makas kullanarak, oksipital kemik seviyesinden başlayarak ve posteriora uzatan bir orta hat kesi (yaklaşık 7 mm uzunluğunda) gerçekleştirin.
  3. Hafifçe ince uç cımbız ile orta hattan yan alan yüzeysel bağ dokusu nu ve boyun kaslarını nazikçe ayırın. Bu sarsis magna, ters üçgen şeklinde böşenen dural membran ortaya çıkaracaktır.
  4. Ortaya çıkan kanamayı kontrol etmek için steril emilim mızrakları veya pamuklu bezler kullanın.
  5. Boyun kaslarını bir kenara çekti korumak ve işlem boyunca sarnıç magna görselleştirme sağlamak için küçük bir cerrahi ayırıcı konumlandırın.

5. İntrasisternal Enjeksiyon

  1. Sarnıç magna erişim elde etmek için, oksipital kemiğin kaudal ucunu belirlemek ve daha önce hemen altında bükülmüş olan iğne takın.
    NOT: Dural membran delinmiş gibi direnç ani bir düşüş olacaktır. Ancak, iğneucu sadece biraz meningeal yüzeyin altında nüfuz edecek, onun kancalı şekli sayesinde.
  2. Dura delindikten sonra, iğneyi kafatasına "kancalamak" için şırıngayı yavaşça yukarı ve hayvanın vücuduna paralel olarak çekerek iğnenin bükülmüş ucunun dural yüzeyin inmesine izin verin (Bkz. Şekil 1B). Bu daha iyi stabilite sağlayacak ve böylece altta yatan beyincik veya medulla zarar riskini önlemek, daha derin nüfuz gelen iğne önleyecektir.
  3. Beyin omurilik sıvısının doğal akışına müdahale önlemek için bileşiği yavaşça enjekte edin.
    NOT: Deneyin amacına bağlı olarak, infüzyon hızı değişebilir. Yavaş ve sabit infüzyon hızı gerekiyorsa (örneğin, beyin-omurilik sıvısı hareketini izlemek için prosedürü kullanırken), şırınga ile birlikte otomatize mikroinfüzyon sistemi kullanılması tavsiye edilebilir.
  4. Enjeksiyondan sonra, iğne nin 1 dk boyunca yerinde dinlenmesine izin verin ve dikkatlice çıkarın. İğnenin kancalı konumundan geri çekilmesine yardımcı olmak için ince uçlu çileler kullanın.
    NOT: İnce bir iğnenin (örn. 30 G) kullanılması menenjit zarının önemli ölçüde hasar görmesine ve bunun sonucunda beyin-omurilik sıvısının dışarı çıkışına yol açmaz. Daha büyük iğne boyutları gerekiyorsa, steril bir pamuk ucu kullanarak enjeksiyon yerinde basınç uygulayarak sıvı sızıntısıdurdurmanızı öneririz.

6. Prosedürün Sonuçlandırılması ve Ameliyat Sonrası Bakım

  1. Ayırıcıyı çıkarın ve kasların dural membranı böşeyen orijinal konumuna geri dönmelerine izin verin.
  2. Birkaç damla siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak deri kesisini kapatın.
    NOT: Alternatif olarak, emilebilir dikişler kullanın (örneğin, 5-0 vicryl dikişler) ve kesilen dikişler ile cilt kesisi kapatın.
  3. Kesi bölgesine lokal anesteziuygulayın (örn. %5 lidokain in100 μL) uygulayın.
  4. Tutucu dan hayvan çıkarın ve temiz bir kafes bir ısıtma yastığı üzerinde konumlandırılmış yerleştirin. Bilinci yerine gelene kadar hayvanı izle.
    NOT: İşlemin hayvanda uzun süreli ağrı veya sıkıntıya yol açması beklenmez. Bununla birlikte, fare ilk ameliyat sonrası gün boyunca yakından izlenmeli ve gerekli görüldüğünde ve kurumunuzdaki veteriner lik birimi tarafından verilen tavsiyelerdoğrultusunda ağrı kesici önlemler alınmalıdır.

Sonuçlar

Cx30 promotörü13 ve indükleyici floresan muhabiri altında CreER ifade transgenik farelerde endoksifen intrasisternal enjeksiyon ve kortekste komşu Cx30-ifade yüzeyi ve parenkimal astrositler etiketleme olmadan leptomeningeal hücrelerin özel rekombinasyon sağlar(Şekil 1). Sarnıç magna'ya erişmek için anesteziye değer hale gelen hayvan, vücudu ve kafası yaklaşık 120°'lik bir açıyla konumlandırılır ve böylece boy...

Tartışmalar

Burada özetlenen protokol, kader haritalaması için leptomeningeal hücreleri etiketlemek için basit ve tekrarlanabilir bir prosedür sunar. Biz endoksifen intrasisternal enjeksiyon kullanın, Tamoksifen aktif bir metaboliti, Cx30-CreER tdTomato floresan muhabiri ifade indüklemek için; R26R-tdDomatesfareleri 12,13.

Sarnıç magna9ile beyin-omurilik sıvısına erişim sağlamak için kullanılan diğer prot...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Teşekkürler

Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Kanser Derneği, İsveç Stratejik Araştırmalar Vakfı, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse ve Karolinska Institutet'te (StratRegen) Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp Stratejik Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia unitUniventor 4108323102Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane)Baxter Medical AB000890
BetadineSigma-AldrichPVP1
CarprofenOrion Pharma AB014920Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glueCarl Roth0258.1Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue GlueStoelting50479
DMSOSigma-AldrichD2650
EndoxifenSigma-AldrichE8284
Ethanol 70%Histolab01370
Hamilton syringe (30 G beveled needle)Hamilton80300
LidocaineAspen Nordic520455
Mouse head holderNarishige InternationalSGM-4With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
ScissorsFine Science Tools15009-08
ShaverAesculapGT420
Sterile absorption spearsFine Science Tools18105-01Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separatorWorld Precision Instrument501897
TweezersDumont11251-35
ViscotearsBausch&Lomb Nordic AB541760

Referanslar

  1. Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
  2. Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).
  3. Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
  4. Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
  5. Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
  6. Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
  7. De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
  8. Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
  9. Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  10. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
  11. Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
  12. Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
  13. Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
  14. Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
  15. Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
  16. Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 159Intrasisternal enjeksiyonLeptomeningesTransgenik fareKader haritalamaConnexin 30Beyin omurilik s v sSubaraknoid alan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır