تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)

Summary

CENP-A في كل مكان هو شرط مهم ل CENP-A ترسب في السنترومير، ورثت من خلال تخمير بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية. هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A) البروتين.

Abstract

دراسة بنية وديناميكيات الكينتوتشورات و centromeres مهم في فهم عدم استقرار الكروموسومات (CIN) وتطور السرطان. إن كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ "السنترومير" (أي هوية السنترومير) والمشاركة في الفصل الدقيق للكروموسومات هو سؤال أساسي. ويقترح أن يكون مؤشر الحمض النووي غير (علامة وراثية) هوية سنترومير، وCENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في السنترومير، موروثة من خلال التمدن بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية.

هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن يتم حث في كل مكان في ليسين مختلفة بسبب وضع علامات EYFP في البروتين المتحول CENP-A K124R. تم تحديد Lysine 306 (K306) في كل مكان في EYFP-CENP-A K124R بنجاح، والذي يتوافق مع الlysine 56 (K56) في CENP-A من خلال تحليل القياس الطيفي الشامل. ويناقش التحذير في استخدام GFP / EYFP أو وضع علامات على ارتفاع الوزن الجزيئي البروتين كأداة لتحليل وظيفة البروتين. كما يناقش الحد التقني الحالي للكشف عن النطاقات في كل مكان، وتحديد كل مكان في كل مكان (ق) محددة، وتصور في كل مكان في الخلايا الحية أو خلية واحدة محددة خلال دورة الخلية بأكملها.

طريقة تحليل قياس الطيف الشامل المعروضة هنا يمكن تطبيقها على البروتين CENP-A البشري مع علامات مختلفة وغيرها من البروتينات centromere-kinetochore. ويمكن التوصية بهذه الطرق الجمعية التي تتكون من عدة مقايسات/تحليلات للباحثين المهتمين بتحديد الأدوار الوظيفية للدمج في كل مكان.

Introduction

في معظم eukaryotes ، يجب أن تلتصق ميكروتيبولس المغزل إلى منطقة واحدة من كل كروموسوم ، يطلق عليه السنترومير. الكينتوشور هو مجمع من البروتينات التي تقع في السنترومير. دراسة توقيت حركات البروتين السنتروميري و kinetochore وبنية kinetochores و centromeres مهم لفهم عدم الاستقرار الكروموسوم (CIN) وتطور السرطان. وتتمثل الأسئلة الرئيسية في كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ "السنترومير" (أي هوية السنترومير) وكيفية مشاركتهم في الفصل الدقيق للكروموسومات. في معظم الأنواع، وجود نواة خاصة تحتوي على بروتين معين يشبه هيستون يسمى CENP-A يحدد هوية السنترومير. ولذلك، يُقترح أن يكون مؤشر CENP-A هو مؤشر غير الحمض النووي (علامة اللاجينية) لهوية الميرومير. من المهم توضيح آلية كيفية تعريف CENP-A لهوية السنترومير في البشر.

إن بروتين التعرف على تقاطع هوليداي (HJURP) هو شابرون CENP-A-محددة الذي يودع CENP-A في نوى 1^1،2،3. لقد سبق أن ذكرت أن مطلوب CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase لCENP-A في كل مكان على lysine 124 (K124) وتوطين centromere⁴. كما أن نتائجنا أظهرت أن التوظيف centromere من توليفها حديثا CENP-A يتطلب موجودة من قبل في كل مكان CENP-A⁵. وهكذا، تم تقديم نموذج يشير إلى أن CENP-A في كل مكان موروثة من خلال التملم بين الانقسامات الخلية.

وعلى النقيض من النتائج التي توصلنا إليها وتلك التي توصلنا إليها، فقد تم نشر النتائج السلبية المتعلقة بـ CENP-A وتوطينها في المنطقة الوسطى مؤخراً⁶. وادعى المقال أن CENP-A التعديلات على lysine 124 (K124) هي الاستغناء عن إنشاء، وصيانة، وظيفة طويلة الأجل من تينتروميرس الإنسان، استنادا إلى نتائجها السلبية تبين أن طفرة K124R لم تؤثر على CENP-A centrom توطين لا خلية قابلية البقاء⁶. ومع ذلك، هناك ما يكفي من النقاش في النتائج والاستنتاجات، وقد سبق أن وصفنا ما هي المشكلة التي يمكن أن تكون هناك في نشرتهم السابقة⁷. وينبغي إيلاء الاهتمام بأنهم تنصهر البروتينات مع CENP-A، التي لديها أوزان جزيئية أكبر بكثير من حجم CENP-A الذاتية: على سبيل المثال، تنصهر ~ 30 كيلو ادا المعزز البروتين الفلورسنت (EYFP) إلى ~ 16 كيلو ادا CENP-A وتحليل EYFP-CENP-A K124R البروتين الانصهار في نظامهم RPE-1^CENP-A-/F خروج المغلوب. لا يتوقع أن يرتبط K124 ubiquitin مباشرة إلى HJURP استناداً إلى التنبؤات الهيكلية⁴، ومع ذلك ، من المتوقع أن يكون لإضافة أحادية ubiquitin تأثير على بروتين التشكل من CENP-A. يمكن تغيير بروتين CENP-A التشكل من خلال وجود بروتين انصهار كبير ، وهذا التغيير التشكلي قد يخفي التغيرات الهيكلية الناجمة عن فقدان في كل مكان. نقترح أن الانصهار من البروتين كبير الحجم يدفع في كل مكان في lysine غير K124 في EYFP -CENP -A K124R متحولة وهذا في كل مكان في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R نمط ظاهري واحد متحولة. دليل على أن يحدث في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين المتحول K124R CENP-A مع بروتين كبير (EYFP) تم الإبلاغ عنها في نشرتنا السابقة⁸. ووجد أن علامات EYFP تحفز في كل مكان من موقع ليسين آخر من EYFP -CENP-A K124R وأن EYFP-CENP-A K124R يربط متحولة HJURP. ونتيجة لذلك ، فإن هذا ubiquitylation في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R الأصلي نمط ظاهري متحولة واحدة ، وكلاهما EYFP - CENP - A WT وK124R المسوخ أظهرت تعريب centromere (استخدمنا وقارنا pBabe - EYFP - CENP - A WT و K124R متحولة ، جنبا إلى جنب مع pBabe - EYFP control.). وأظهرت النتائج أن العلم الموسومة أو غير الموسومة CENP- A K124R المسوخ قاتلة ولكن يمكن إنقاذها من قبل الانصهار monoubiquitin، مما يشير إلى أن CENP-A في كل مكان هو لا غنى عنه لقابلية الخلية.

في السنوات الأخيرة، وضعت العديد من الدراسات المقايسات المختلفة لتحديد التعديلات ما بعد التحويل (PTMs) من البروتين CENP-A والبروتينات المركزية-كينتوشور الأخرى سواء في الجسم الحي وفي المختبر^9،10،11. مماثلة ل PTMs من بروتينات هيستون التي هي آلية رئيسية تنظم وظيفة الكروماتين، وتشارك أيضا PTMs من مكونات الكروماتين chromatin centromeric في آلية أساسية لتنظيم الهيكل العام ودالة centromeres. معظم مواقع CENP-A PTM محددة للنيات التي تحتوي على CENP-A، على الرغم من أن يتم حفظ عدد قليل منها في H3، مما يشير إلى أن تعديل هذه المخلفات تساهم في وظيفة centromere محددة. PTMs من CENP-A بما في ذلك الفسفر، أستيليشن، methylation، وفي كل مكان كانت قد ذكرت سابقا⁹، مما يشير إلى أن CENP-A يتعرض لمجموعة متنوعة من PTMs والمصفوفات الخاصة بهم الجمعي على الدلفين الأمينية وC-terminus هيستون أضعاف المجال. وقد كشفت عن أهمية CENP -A التعديلات في وظائف متعددة من قبل العديد من المجموعات بما في ذلك لنا. وتشمل هذه الوظائف CENP-A ترسب في centromeres، واستقرار البروتين، وتوظيف CCAN (الشبكة المرتبطة centromere التأسيسية)⁹. ومع ذلك، فإن الدراسات والنتائج المحدودة لـ CENP-A PTMs هي preformed حيث يتم إجراء مقارنات مع واحدة من النغمات الكنسية التي تنظم وظيفتها بشكل مباشر أو غير مباشر. كما أن التقارير التقنية التي تركز على منهجية تحديد هذه التدابير CENP-A PTMs محدودة أيضاً.

لأن CENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في¹²سنترومير ، ورثت من خلال dimerization بين انقسام الخلية⁵، ولا غنى عنه لقابلية الخلية⁸، فإن طريقة لتحديد CENP -A في كل مكان يكون من الضروري في المستقبل لدراسة النشاط الوظيفي ، وتحديد المواقع ، وهيكل من centromere. ولذلك، هنا نحن وصف تحليل الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن علامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة⁸. كما يتم عرض بروتوكولات من المقايسات وغيرها من التحليلات السيطرة (تحليل المناعةfluorescence، محك مستعمرة خارج نمو، وفي التحليل في كل مكان vivo) لمناقشة نتائج التحليل الرئيسي لقياس الطيف الشامل بشكل صحيح.

Protocol

1. ثقافة الخلية وvirus retro transfection من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّد

ملاحظة: يتم التعبير عن EYFP-CENP-A من pBabe-EYFP-CENP-A على مستوى بروتين مماثل إلى CENP-A الذاتية. يتم استبدال مجموع البروتين الخلوي CENP-A مع هذا EYFP-CENP-A بعد تعطيل CENP-A^-/F أليل بواسطة إعادة الكومبينيز Cre كما هو الحال في RPE-1 CENP-A-/- الخلايا⁶.

1. إعداد من فوقي يحتوي على الفيروس الرجعي باستخدام خلايا التعبئة والتغليف 293T.
   1. اليوم 0: انتشار خلايا التعبئة والتغليف 293T على لوحة ثقافة 6-جيدا (1.0 × 10⁶ خلايا / جيدا). الخلايا في علم الثقافة في DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-الستريبتوميسين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO₂ ل 24 ساعة.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، تحديد تجريبيا كثافة الخلية لاستخدامها في البذر.
   2. اليوم 1: إعداد رد فعل transfection حول 23 ساعة بعد انتشار (24 نقطة ساعة هو 0 نقطة ساعة من transfection). عبر العبارة بلازميد من كل pBabe-EYFP (B3182)، pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161)، وpBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (انظر الجدول 1).
   3. اختيار مزيج واحد من plasmids المساعد / التعبئة والتغليف المذكورة في الجدول 2 وإضافتها إلى أنابيب تحتوي على واحدة من plasmids المذكورة أعلاه. هناك في الغالب هذه 3 تركيبات للمساعد / التعبئة والتغليف plasmids(الجدول 2). عملت أي تركيبة في هذه التجارب وأظهرت كفاءة مماثلة transfection.
   4. إعداد 50 ميكرولتر من متوسط المصل المنخفض وخلط 2.0 ميكروغرام من كل pBabe-EYFP (B3182)، pBabe-EYFP-CENP-A WT (B316 وpBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (انظر الجدول 1)إضافة مزيج واحد من plasmids المساعد /التعبئة والتغليف المذكورة في الجدول 2 (انظر أدناه). احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. هذا الخليط هو الحل A.
   5. إعداد 50 ميكرولتر آخر من متوسط المصل المخفض وخلط 1.5 ميكرولتر من الكواشف عبر I و II على التوالي (جدول المواد). احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. هذا الخليط هو الحل B.
      ملاحظة: اختياريا، إضافة فقط 6.0 ميكرولتر من كاشف transfection الثالث (البولي ايثيلينمين [PEI]؛ 1.0 ملغ / مل) في الحل B أو إضافة 6.0 ميكرولتر من الكثيف الثالث بالإضافة إلى الكواشف عبر الأول والثاني في الحل B(جدول المواد).
   6. مزيج الحلول A و B معا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   7. بعد غسل الخلايا المستزرعة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، إضافة خليط من الحلول A وB (أي، الحمض النووي الدهون المعقدة) مباشرة إلى كل بئر من 6-بئر لوحة ثقافة التي لديها 500 ميكرولتر انخفاض مصل المتوسطة. التركيز النهائي للبقة هو 3.3 ميكروغرام / مل.
   8. بعد احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO₂ ل 4.5 ح، تغيير متوسطة إلى عالية الجلوكوز DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستريبتومايسين. وضع 2 مل / جيدا من المتوسط الثقافة بعد تغيير المتوسطة في لوحة ثقافة 6-well.
   9. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO₂ ل 48 ح بعد transfection. أداء عدوى الفيروس الرجعي في اليوم 3 باستخدام supernatant التي تحتوي على الفيروس الرجعي.
2. عدوى الفيروس الرجعي للخلايا المستهدفة CENP-A^-/F RPE-1.
   1. اليوم 2: قبل يوم واحد من الإصابة، انتشار الخلايا المستهدفة CENP-A^-/F RPE-1 إلى transfect في ثقافة 6-جيدا جيدا (2.25 × 10⁵ الخلايا / جيدا). الخلايا في DMEM الثقافة: F12 المتوسطة(جدول المواد)مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين.
      ملاحظة: تنتشر الخلايا لم مقايسات مُنَتَجِمَة المستعمرة، وفلورة المناعة، وتحليل البقعة الغربية كتحكم. للحصول على أفضل النتائج، تحديد تجريبيا كثافة الخلية لاستخدامها في البذر.
   2. اليوم 3 (يوم العدوى من الفيروس): في 48 ساعة بعد transfection من خلايا التعبئة والتغليف 293T، وجمع فائقة تحتوي على الفيروس وتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر (لا تستخدم مرشح 0.2 μm التي سوف القص مغلف الفيروس). من المستحسن استخدام مرشحات البولي إيثيرسولفون (PES).
   3. تصيب خلايا CENP-A^-/F RPE-1 بالفيروس. للحصول على بئر واحد من لوحة ثقافة 6-جيدا، إضافة 1 مل وسائل الإعلام الطازجة، 1 مل فيروس متكاثر والبوليبرين إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل. احتضان CENP-A^-/F RPE-1 الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO₂ لمدة 4 أيام حتى اليوم 7 بعد transfection.
      ملاحظة: يجب تحديد فترة الحضانة لنمو الخلايا CENP-A^-/F RPE-1 تجريبيًا باتباع التحليلات لتحقيق النتائج المثلى.

2. تحليل الفلوروسنس المناعي للخلايا التي تحتوي على pBabe-EYFP-CENP-A

1. اليوم 7: 4 أيام بعد عدوى الفيروس الرجعية من pBabe-EYFP-CENP-A يبني، وإزالة وسيلة الثقافة من قبل الطموح. شطف الخلايا مرة واحدة مع TBS (25 mM تريس-HCl، 7.5 pH؛ 125 mM NaCl). تطبيق TBS إلى جانب الآبار الثقافة لتجنب إزعاج سطح الخلايا.
   ملاحظة: يجب تحديد نقطة الوقت الأمثل لتثبيت الخلية تجريبياً. إشارات الفلوروس المناعي لكل من EYFP-CENP-A WT وK124R قابلة للكشف في السنترومير على الأقل 4 أيام بعد عدوى الفيروس الرجعية من pBabe-EYFP-CENP-A يبني حتى بدون عدوى Cre (البيانات غير مبينة، الشكل 1C-E للبيانات مع عدوى Cre).
2. أداء تثبيت الخلية الميثانول وصبغ المناعةfluorescence كما هو موضح سابقا¹³.
3. كما تستخدم الأجسام المضادة الأولية المضادة للجسم المضاد GFP (1:1,000 تخفيف) والأجسام المضادة CENP-B (نسبة التخفيف من 1:200) لعلامة موقع السنترومير في TBS تحتوي على مصل الماعز 4٪ (انظر جدول المواد للأجسام المضادة المستخدمة).
4. إزالة زيادة تصاعد المتوسطة مع منشفة ورقية وختم حواف الغطاء مع طلاء الأظافر في الخطوة الأخيرة.
5. الرجوع إلى الطريقة¹³ الموصوفة سابقاً لمراقبة صورة الفلورة المناعية، والاكتساب، وتحديد الكم، وتحليل الإشارات المتبقية من EYFP-CENP-A في السنترومير.
6. تنفيذ عملية الحصول على الصور ومعالجتها بما في ذلك فك التكوير، وتحديد الكم، والتحليل باستخدام البرامج A أو البرامج B1 و B2 (انظر جدول المواد). اختياريا استخدام برامج C1-C3 (انظر جدول المواد)لمجهر المسح الضوئي ليزر confocal.
   ملاحظة: راجع 2.6.1 في ملفات ترميز تكميلية لكافة الأوامر المستخدمة في البرنامج A. انظر 2.6.2 في ملفات الترميز التكميلية لكافة الأوامر المستخدمة في البرامج B1 و B2.

3. مستعمرة مُقايسات النمو باستخدام pBabe-EYFP-CENP-A بعد عدوى فيروس الرجعية-Cre

ملاحظة: سبب إجراء هذا الفحص هو مقارنة صلاحية الخلية بين EYFP-CENP-A WT و K124R متحولة بعد تعطيل CENP-A^-/F الأليل بواسطة Cre إعادة الكومبينيز (بعد استبدال إجمالي البروتين الخلوي CENP-A).

1. الفيروس الرجعية transfection من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّد.
   1. تنفيذ العدوى بالفيروسة الرجعية للخلايا CENP-A^-/F RPE-1 كما هو موضح في القسم 1. الخلايا في DMEM الثقافة: F12 المتوسطة مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين ستربتوميسين لمدة 72 ساعة بعد عدوى الفيروس.
   2. بعد ثلاثة أيام من عدوى الفيروس الرجعية من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّاد (في اليوم 6)، إضافة blasticidin S (10 ميكروغرام/مل) في الآبار التي تحتوي على الخلايا العابرة لعدوى لاستخدامها في مقايسات مستعمرة خارج والسيطرة التجارب. تزرع الخلايا على الأقل بعد 14 يوما من عدوى الفيروس في وجود blasticidin S. تغيير المتوسطة التي تحتوي على blasticidin S كل 5 أيام.
      ملاحظة: إذا وصلت الخلايا إلى حوالي 80٪ التقاء قبل البذر للملمع مستعمرة (3.2.7. و 3.2.8)، مرور الخلايا في 1:2 و 1:5 نسبة عن طريق التربسيني والطلاء في لوحة ثقافة 6 جيدا.
   3. جمع الخلايا للطخة الغربية في اليوم 7 لتأكيد التعبير البروتين من pBabe-EYFP-CENP-A يبني دون عدوى كري. إجراء تحليل البقعة الغربية كما هو موضح في القسم 4. وتظهر النتائج في الشكل 1B (الممرات 1-4).
   4. لمستعمرة مقايسة مع عدوى فيروس Cre، والحفاظ على الخلايا التي تنمو لمدة 14 يوما بعد عدوى الفيروس في وجود blasticidin S (أي، تنمو الخلايا في blasticidin S التي تحتوي على المتوسطة حتى يوم 17 للنتائج المقدمة هنا).
2. عدوى فيروس الرجعية كري من pBabe-بورو-كري
   ملاحظة: يوم 0 في الخطوة 3.2.1 يتوافق مع يوم 13 من في المقطع 3.1.
   1. يوم 0 إلى يوم 3: تنفيذ transfection الفيروسة الرجعية من CENP^{-A -/F} RPE-1 الخلايا باستخدام pBabe-puro-Cre (B3027) كتعبير plasmid (انظر القسم 1 للحصول على التفاصيل). تأكد من إضافة البلاستيسيدين S (10 ميكروغرام/مل) في الوسط المُزَمِر.
   2. اليوم 4: الخلايا التربسينيزي لفصله عن لوحة. لوحة 500 أو 5000 خلية في ثلاث ية في لوحة ثقافة 6-جيدا. الخلايا في DMEM الثقافة: F12 المتوسطة مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين-الستربتوميسين.
   3. اليوم 5: إضافة blasticidin S (10 ميكروغرام / مل) إلى الوسط ثقافة. ل5000 أو 500 خلية ' الطلاء, حدد الخلايا مع blasticidin S (10 ميكروغرام / مل) 3-24 يوما (حتى اليوم 14 في [3.2.7]) أو 3-28 يوما (حتى يوم 18 في [3.2.8]) بعد عدوى الفيروس من الانشاءات (pBabe-EYFP-CENP-A الانشاءات).
      ملاحظة: في هذه المستعمرة مُقايسة النمو، يتم إضافة transfection من pBabe-puro-Cre جنبا إلى جنب مع transfection من pBabe-EYFP-CENP-A. يتم تنفيذ نقل pBabe-EYFP-CENP-A في 3.1. يتم تنفيذ transfection من pBabe-puro-Cre في 3.2.1.
   4. اليوم 10 (7 أيام بعد عدوى فيروس الرجعية كري): جمع الخلايا لتحليل النشاف الغربية لتأكيد استنفاد البروتين من CENP-A الذاتية بعد عدوى فيروس الرجعية-كري و/ أو تعبير البروتين من pBabe-EYFP-CENP-A يبني في نفس اليوم 10.
   5. تنفيذ النشاف الغربية كما هو موضح في القسم 4 في نفس اليوم 10. وتظهر النتائج في الشكل 1B (الممرات 5-7).
   6. إجراء تحليل مناعي (القسم 2 أعلاه) للتأكد من أن كل من EYFP-CENP-A WT وK124R المترجمة إلى centromere 7 أيام بعد تعطيل CENP-A 1000 endnp المتبقية. وتظهر النتائج في الشكل 1C-1E.
   7. اليوم 14: أداء مقايسة المستعمرة خارج مع لوحة بذر مع 5000 الخلايا. إصلاح الخلايا لمدة 10 دقيقة في الميثانول وصمة عار لمدة 10 دقيقة في حل البنفسجي الكريستال (2.3٪ البنفسجي الكريستال، 0.1٪ أوكسالات الأمونيوم، 20٪ الإيثانول (انظر الشكل 2B). عد عدد المستعمرات باستخدام برنامج OpenCFU (انظر الشكل 2C).
   8. اليوم 18: استخدام لوحة بذر مع 500 خلية. إصلاح وخلايا البقع كما هو موضح في الخطوة 3.2.7 (انظر الشكل 2B). عد عدد المستعمرات (انظر الشكل 2C).

4. الغربية لطخة التحليل باستخدام pBabe -EYFP-CENP-A

ملاحظة: راجع الطريقة¹³ الموصوفة سابقاً لتحليل البقعة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها في الشكل 1B والشكل 2A وجدول المواد للبروتينات EYFP-CENP-A. Table of Materials

1. عزل البروتينات عن طريق lysing الخلايا المزروعة مع عدوى فيروس مختلف. ثم، استخدام 20 ميكروغرام من البروتين في بئر واحد من هلام صفحة SDS. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF كما هو موضح سابقا¹³.
2. غسل الغشاء 3x بعد الاحتضان مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية. كشف وتحليل نطاقات البروتين على الغشاء مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء و / أو التصوير chemiluminescence للكشف عن المناعة. وتظهر هذه النتائج في الشكل 1B والشكل 2A.
   1. للحصول على نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء للكشف عن وتحليل نطاقات البروتين، راجع الخطوة 4.2.1 في ملفات التشفير التكميلية.
   2. استخدم مصوّر chemiluminescence للكشف عن نطاقات البروتين وتحليلها، راجع الخطوة 4.2.2 في ملفات التشفير التكميلية. لهذا النظام، استخدم الركيزة chemiluminescent (ECL) الحساسة للغاية(جدول المواد).
   3. اختياريا، استخدم لطخة الغربية تجريد العازلة لتجريد من الأجسام المضادة قبل المحتضنة من غشاء PVDF و reblot مع الأجسام المضادة المختلفة لدور المقبل من التحليل الغربي. تحديد تجريبيا الوقت الأمثل الحضانة ودرجة الحرارة لاستخدامها.

5. خلية الثقافة، transfection، وفي vivo في كل مكان مقايسات باستخدام pQCXIP-EYFP-CENP-A

ملاحظة: مستوى البروتين من EYFP-CENP-A أعرب عن من pQCXIP-ناقلات هو ~ 10x أعلى من مستوى البروتين CENP-A الذاتية. إن استخدام هذا المتجه يسهل التحلل المناعي لكمية أعلى من بروتينات EYFP-CENP-A، ومراقبة نطاقات EYFP-CENP-A، وتحديد كل مكان للبروتين EYFP-CENP-A (EYFP-CENP-A) من خلال تحليل قياس الطيف الكتلي.

1. Transfection لفي vivo في كل مكان مقايسات باستخدام pQCXIP -EYFP-CENP-A.
   1. البذور 36.2 × 10⁵ CENP -A^-/F RPE-1 الخلايا في طبق ثقافة الأنسجة 10 سم. الخلايا في علم الثقافة في DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-الستريبتوميسين.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، حدد تجريبيًا كثافة الخلايا التي سيتم استخدامها في البذر. إعداد ما لا يقل عن 2 أطباق لعينة واحدة مناعي (IP) للحصول على ما لا يقل عن 1 ملغ من البروتين الكلي.
   2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO₂ ل 18 ساعة.
   3. في 17 ساعة بعد البذر، وإعداد الكواشف transfection.
   4. جعل الحل عن طريق خلط 6.7 ميكروغرام بلازميد من كل pQCXIP-EYFP (B3252)، pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254)، pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256)(الجدول 1)في 335 μL من مصل متوسط مخفض، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إضافة 6.7 μg plasmid من pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) إلى جميع العينات.
      ملاحظة: يتم سرد كافة المتجهات في الجدول 1.
   5. جعل الحل B عن طريق خلط 10.1 ميكرولتر من الكواشف عبر I و II، على التوالي في 335 ميكرولتر انخفاض مصل المتوسطة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: خطوة اختيارية هي إضافة فقط 40.2 ميكرولتر مكشاف لمعالجة المعادن III (البولي ايثيلينمين [PEI]؛ 1.0 ملغ /مليلتر) في الحل B أو إضافة 40.2 ميكرولتر مكشاف 3 بالإضافة إلى كاشفات transfection I و II في الحل B(جدول المواد).
   6. مزيج الحلول A و B معا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   7. بعد غسل الخلايا المستزرعة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، إضافة خليط من الحلول A و B (أي، الحمض النووي الدهون المعقدة) مباشرة إلى كل من الفردية 10 سم طبق زراعة الأنسجة التي لديها 3.35 مل μL انخفاض مصل المتوسطة.
      ملاحظة: التركيز النهائي هو 1.67 ميكروغرام / مل من البلازميد.
   8. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ ل4.5 h. بعد 4.5 ساعة، قم بتغيير متوسط إلى عالي الجلوكوز DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بينسلين-ستريبتوميسين.
   9. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ ل 48 ساعة بعد transfection. جمع الخلايا لإعداد الخلية lysates.
2. إعداد البروتين الخرز ملزمة مع الأجسام المضادة للجسم العالمي.
   1. خذ 25 ميكرولتر (50٪ v/v) من البروتين A حبات لتفاعل واحد مناعي (IP). غسل مع A1 العازلة (جدول المواد)على الأقل 3x لإزالة EtOH، وجعل 50% حل مع A1 العازلة (20 mM تريس-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; كاملة EDTA خالية من مثبطات البروتياز كاشف).
   2. إضافة 2.0 μL من الأجسام المضادة لـ GFP (Anti#76: الأجسام المضادة محلية الصنع) إلى الخرزات المعدة أعلاه وإضافة 10x حجم A1 العازلة مقارنة مع صافي حجم الخرز.
   3. أداء تناوب من نهاية إلى نهاية في 4 درجة مئوية لمدة 4-18 ساعة. يجب تحديد الوقت الأمثل لدوران من نهاية إلى نهاية على أساس تجريبي على أساس كفاءة مناعي.
   4. الطرد المركزي الخرز في 100 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة غير منضم فائقة. إضافة A1 العازلة لإعادة جعل 50٪ (الخامس / الخامس) حل من الخرز. استخدم 25 ميكرولتر (50٪ v/v) من هذا الحل لتفاعل واحد من IP.
3. مناعي (IP) باستخدام البروتين خرزات sepharose ملزمة بالأجسام المضادة لـ GFP.
   1. الخلايا الLyse التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.1.9 في A1 العازلة بواسطة sonication وتجميد ذوبان العملية.
   2. قياس تركيزات البروتين وتطبيع كميات البروتين بين عينات IP مختلفة. إزالة 5٪ من العينة من كل أنبوب لتشغيل عينة إدخال 5٪ في SDS-PAGE.
      ملاحظة: يمكن تجميد عينة الإدخال بنسبة 5٪ في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية، إذا لم يتم تحميلها في غضون يوم واحد.
   3. مزيج بقية 95٪ lysate مع 25 ميكرولتر (50٪ v/v) من البروتين A حبات ملزمة للأجسام المضادة للجسم المضاد لـ GFP التي تم إعدادها في الخطوة 5.2. أداء تناوب من نهاية إلى نهاية في 4 درجة مئوية لمدة 4-18 ساعة.
      ملاحظة: يجب تحديد طول الوقت الأمثل لتناوب نهاية إلى نهاية تجريبياً.
   4. بروتين الطرد المركزي حبات مع البروتين ملزمة به (أي، مناعي) مع 100 × ز لمدة 1 دقيقة، وإزالة نابيرانت. اغسل cipcipitates المناعية مع العازلة A1 عن طريق الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 1 دقيقة.
   5. مزيج من 5٪ المدخلات وبقية 95٪ من cippreitates المناعي مع 2x و 4x SDS-PAGE تحميل العازلة¹⁴، على التوالي. يغلي هاتان العينتان لمدة 5 دقائق ثم قم بتحميلها على 10.0% denaturing SDS-polyacrylamide هلام لكهربية في الممرات المختلفة. استخدم جل SDS-PAGE أكبر (على سبيل المثال، 17 سم × 15 سم) للكهربية. إذا كانت العينات تعمل في هلام أصغر، قد لا يكون من الممكن مراقبة نطاقات واضحة /واضحة في كل مكان.
   6. إجراء تحليل البقعة الغربية كما هو موضح في القسم 4 باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها في التقرير السابق⁸. وتظهر النتيجة في الشكل 2A.
   7. استخدام لطخة الغربية تجريد العازلة لتجريد من الأجسام المضادة قبل المحتضنة من غشاء PVDF و reblot مع الأجسام المضادة المختلفة للجولة المقبلة من تحليل البقعة الغربية.

6. قياس الطيف الشامل لتحديد موقع في كل مكان من EYFP - CENP - K124R متحولة

1. نقل لتحاليل قياس الطيف الكتلي باستخدام pQCXIP-EYFP-CENP-A.
   1. بذور CENP-A^-/F RPE-1 الخلايا في طبق ثقافة الأنسجة 10 سم. تحقق من أن كثافة الخلية هي 36.2 × 10⁵ خلايا لكل طبق. الخلايا في علم الثقافة في DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-الستريبتوميسين. إعداد ما لا يقل عن 20 أطباق لعينة واحدة مناعية (IP)، للحصول على ما لا يقل عن 10 ملغ من البروتين الكلي (انظر 5.3).
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، تحديد تجريبيا كثافة الخلية لاستخدامها في البذر.
   2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO₂ ل 18 ح. إعداد الكواشف transfection ~ 23 ساعة بعد انتشار (24 نقطة ساعة هو 0 نقطة ح من transfection).
   3. في 17 ساعة بعد البذر، وإعداد الكواشف transfection وخلايا transfect كما (4.1.3). الخلايا المصابة pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) وpQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
   4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO₂ ل 48 ساعة بعد transfection. جمع الخلايا لخلايا الخلايا.
   5. خلايا اللاي في A1 العازلة وإجراء المناعة كما (5.2) و (5.3). تشغيل هذين من lysitation المناعي كما يلي (6.1.6) و (6.1.7).
      ملاحظة: في (6.1.6) ، تشغيل العينة في المواد الهلامية تريس الجليسين القياسية. في (6.1.7) ، تشغيل العينة في 4 ٪ - 12 ٪ المتاحة تجاريا بروتين الهلام Bis-Tris. انظر أيضا المناقشة.
   6. احتفظ بعينة واحدة لـ 10% من إجمالي المثبطات المناعية لتأكيد EYFP-CENP-A في كل مكان ولتحديد موضع EYFP-CENP-A في كل مكان على وجه التحديد كما هو موضح في القسم 5. تشغيل هذه العينة في المواد الهلامية تريس-جليكين القياسية. تم تنفيذ SDS-PAGE ولطخة غربية كـ (5.3).
   7. احتفظ بعينة أخرى لـ 90% من إجمالي المثبطات المناعية لتحليل قياس الطيف الكتلي. تشغيل هذه العينة داخل اثنين من الآبار المتاحة تجاريا 4٪ -12٪ الهلام البروتين Bis-Tris. أداء Coomassie الأزرق تلطيخ باستخدام حل Coomassie الأزرق. مكوس وقطع منطقة هلام من 50-70 كيلوDa (المفترض أحادية UB-EYFP-CENP-A K124R المنطقة). استخدام هذه المنطقة هلام لتحليل الطيف الشامل.
2. تحليل قياس الطيف الكتلي باستخدام الهضم في الجل.
   1. الزهر كل شريحة هلام من الفائدة في قطع صغيرة (1 مم²) ووضعها في 0.5 مل من أنابيب البروتين ملزمة منخفضة.
   2. غسل مع 100 μL 50٪ (الخامس / الخامس) الأسيتريتريل في 25 mM NH₄HCO₃، دوامة 10-15 دقيقة ، تدور أسفل ، والتخلص من افرنح ، كرر 3x.
   3. تركيز العينة باستخدام مقاعد البدلاء فراغ المكثف لمدة 30 دقيقة لتجفيف القطع هلام.
   4. إضافة 10 μL من 10 نانوغرام / μL تسلسل التربسين الصف والسماح لقطع هلام لإعادة الترطيب لمدة 5 دقائق.
   5. إضافة 25 mM NH₄HCO₃ فقط بما يكفي لتغطية القطع هلام، digest في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   6. نقل هضّب هضّب إلى أنبوب سيليكوني نظيف 0.65 مل. إضافة 50٪ (v/v) الأسيتونيتريل/5٪ (الخامس / الخامس) حمض الفليك (30 ميكرولتر أو ما يكفي لتغطية)، دوامة 10 دقيقة، تدور ونقلها إلى نفس أنبوب الاستخراج. كرر 3x.
   7. إضافة 10 ميكرولتر الأسيتونيتريل إلى القطع هلام, دوامة 5 دقيقة, وتدور إلى أسفل. نقل المُنَاَع إلى نفس الأنبوب.
   8. تركيز العينات باستخدام تركيز فراغ benchtop إلى 2 ميكرولتر، إضافة 8 ميكرولتر 3٪ (الخامس / الخامس) الأسيتونتريل /2٪ (v/v) حمض الفليك إلى العينة، دوامة لمدة 15 دقيقة، وتدور في 16،000 س ز لمدة 30 دقيقة. العينات جاهزة لتحليل الطيف الشامل.
   9. إجراء عملية الحصول على بيانات MS باستخدام نظام كروماتوغرافي سائل(جدول المواد)بالإضافة إلى أداة قياس الطيف الكتلي (جدول المواد).
   10. حقن 8 ميكرولتر من عينة المعاد تشكيلها على مسار لوني السائل المرحلة العكسية (RPLC) العمود.
   11. فصل الببتيدات مع 2-80% التدرج من المذيب B في 60 دقيقة. تأكد من أن التدرج يتكون من نسبة متزايدة من المذيب B من 2٪ إلى 22٪ في 40 دقيقة، 22٪ إلى 35٪ المذيب B في 12 دقيقة، ثم الصعود إلى 80٪ المذيب B في 4 دقائق، وأخيرا عقد في 80٪ المذيب B لآخر 4 دقائق.
       ملاحظة: المذيب A يحتوي على 0.1٪ حمض فورميك و 2٪ الأسيتونيتريل، المذيب B يحتوي على 0.1٪ حمض فورميك و 98٪ الأسيتريتريل. وتظهر جميع التركيزات على أنها وحدة تخزين/حجم.
   12. جمع بيانات قياس الطيف الكتلي باستخدام وضع الاكتساب المعتمد على البيانات. باختصار، جمع أطياف التصلب العصبي المتعدد في 350-1500 م / z ل250 مللي ثانية حدد أعلى 50 السلائف المكثفة مع تهمة 2-5 لمزيد من التفتت. جمع أطياف MS /MS في 100-2000 م / z ل 100 مللي ثانية، استبعاد الأيونات السلائف من إعادة اختيار لمدة 15 ثانية.
   13. للبحث عن قاعدة البيانات، افتح البرنامج التجاري (راجع جدول المواد)لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي على سطح المكتب.
   14. لإجراء بحث جديد، انقر على زر"LC"في القائمة العلوية. ثم انقر فوق "إضافة" زر لتحميل الأصلي MS ملفات البيانات الخام.
   15. حدد "معرف البروتين البشري" في " طريقةالمثل" كأسلوب البحث في قاعدة البيانات. البحث في ملفات البيانات الأولية MS الأصلي مقابل قاعدة بيانات UniProt Homo Sapiens (التي تحتوي على 160,566 تسلسل, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
   16. تعيين المعلمات البحث على النحو التالي: حدد التربسين كما انزيم الهضم، والسماح لما يصل إلى 3 الانقسامات المفقودة، 4 تعديلات و 2-5 التهم لكل الببتيد. تعيين خطأ الكتلة تصل إلى 20 جزء في المليون للبحث الأول، و 0.02 Da للأيونات المجزأة. تحديد عتبات معدل اكتشاف زائف (FDR) للبروتين والببتيد ومواقع التعديل أقل من 1٪. تعيين كافة المعلمات الأخرى في البرنامج إلى القيم الافتراضية (انظر الشكل 3 لتحليل قياس الطيف الشامل).
   17. انقر على الزر "حفظ باسم" على يمين القائمة العلوية، وحدد مجلدا لتخزين نتائج البحث، وأدخل اسم البحث وانقر على "حفظ" زر.
   18. انقر على الزر "معالجة" على يمين القائمة العلوية لبدء البحث. بعد انتهاء البحث، سيتم تخزين البيانات التي تحتوي على اسم البحث الذي تم إدخاله تلقائيًا في المجلد المحدد. يمكن فتح البيانات بسهولة بواسطة برنامج F.
   19. للحصول على أطياف MS/MS لأي ببتيد معين، انقر نقراً مزدوجاً فوق نتائج البحث لفتحه بواسطة Software F. أولا، انقر فوق البروتين في قائمة البروتين في الجزء العلوي من القائمة، ثم انقر فوق الببتيد في منتصف القائمة. يتم عرض MS / MS من هذا الببتيد في الجزء السفلي من القائمة.
   20. لتصدير وحفظ أطياف MS/MS، انقر بزر الماوس الأيمن فوق أطياف MS/MS في أسفل القائمة، وحدد نسخة ثم لصقها في ملف مناسب مثل تنسيق PPT أو doc.

النتائج

EYFP-CENP-A K124 متحولة يظهر في كل مكان، والتفاعل مع HJURP، وليس هناك عيوب في توطين centromere لا الفتك الخلية. هنا تم إعادة تشكيل النظام الذي أبلغ عنه Fachinetti et al. (2017)^6: في خلايا الإنسان diploid (RPE-1) التي تحمل واحدة تعطلت وواحدة ''floxed'' CENP-A أليل(CENP-A^-/F),تم التعبير عن EYFP-CENP-A من ن?...

Discussion

هنا وصفنا طرق تحليل القياس الطيفي الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن وضع العلامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة⁸. في نتائجنا، نجحنا في تحديد في كل مكان على lysine 306 (K306) في EYFP-CENP-A K124R، وهذا هو المقابلة لايزين 56 (K56) في CENP-A من خلال ت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes	Eppendorf	022431064	For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish	BIOFIL/JET, China	700224	10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6-well culture plate
CentriVap	LABCONCO	-	Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm	Eksigent Technologies	805-00120	Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE	100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS	63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope	Leica	-	motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source	Leica		External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)	Surgipath	105	Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus	Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences	31071010	Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D	Eksigent Technologies	-	liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher	NP0335BOX	The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	-	Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera	Hamamatsu	C10600-10B	CCD camera
PAP Pen	Binding Site	AD100.1	For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM	VWR	25382-166	10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size)	Junyi, China	JY-SCZ6+	Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted	VWR International	48312-013	Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody	Novus Biologicals	H00001059-B01P	Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH	ABCAM	ab37168	Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH	Invitrogen	PA1987	Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody	ANTI #76 (Homemade antibody)		Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10)	Roche	11815016001	Rat monoclonal antibody
anti-HJURP	Proteintech Group	15283–1-AP	Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin	Bethyl Laboratories	A300-317A-1	Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33996-185	Microtip for sonication
Buffer A1	-	-	20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11-873-580-001	Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250	BBI Life Sciences	CAS 6104-59-2	Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)	SigmaI-Aldrich	HT90132-1L	For colony staining
DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	For nuclear staining
DMEM: F12 Medium	ATCC	30-2006	DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Life Technologies/Gibco	10082	FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol	Fisher	A412-4	Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)	Fisher Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)	Non-fat skim milk
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	Reduced serum media
p-phenylenediamine	SIGMA-SLDRICH	P6001	For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid	Fisher/Gibco	15-140	Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION	SIGMA-SLDRICH	P 8920	Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml	Polysciences	23966–2	Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads	GE Healthcare/Amersham	17-0963-03	Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	PI21059	Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo	34095	Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)	-	-	Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software	Olympus	-	Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software	Olympus	-	Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18	Olympus	-	Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0	LI-COR Biosciences	-	Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System	Bio-Rad	-	Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System	LI-COR Biosciences	-	Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware	-	-	For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software	Improvision/PerkinElmer	-	Software A
ProteinPilot Software version 4.5	AB SCIEX	-	Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software	Bio-Rad	-	Software E
TripleTOF 5600+ System	AB SCIEX	-	Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)	PerkinElmer	-	Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)	PerkinElmer	-	Software B2