ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

Summary

CENP-מהווה מהווה דרישה חשובה עבור CENP-A התצהיר ב צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, והכרחי לקיום תאים. כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון.

Abstract

לימוד המבנה והדינמיקה של קינטומטלות וצנטורמרים חשובים בהבנת אי יציבות כרומוזומלית (CIN) והתקדמות הסרטן. כיצד המיקום הכרומוזומים ותפקודו של מרכז הריכוז (כלומר, זהות צנטוררה) נקבעים ומשתתפים בהפרדה מדויקת של כרומוזום היא שאלה יסודית. CENP-A מוצע להיות אינדיקטור non-DNA (מארק אפיגנטי) של זהות מרוכזת, ו-CENP-A אובידילציה נדרש עבור CENP-A התצהיר על צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, הכרחי הכדאיות התא.

כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי אובילילציה ב ליזין שונים נגרמת בגלל תיוג EYFP ב-K124R מוטציה חלבון CENP. ליזין 306 (K306) אוביזלציה ב-EYFP-K124R התגלתה בהצלחה, המתאימה ליזין 56 (K56) ב-CENP-A באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה. אזהרה נדונה בשימוש GFP/EYFP או תיוג של חלבון משקל מולקולרי גבוה ככלי לנתח את הפונקציה של חלבון. המגבלה הטכנית הנוכחית נדונה גם לאיתור להקות אוביקווילבטים, זיהוי אוביקווילציה ספציפיים לאתר, ויזואליזציה של אובידלציה בתאים חיים או תא יחיד מסוים במהלך מחזור התא כולו.

השיטה של ניתוח ספקטרומטר המסה המוצג כאן ניתן להחיל על האנושי CENP-חלבון עם תגים שונים ושאר מרכז החלבונים-הקיטוכורה. ניתן להמליץ על שיטות שונות הכוללות מספר בדיקות/ניתוח שנועדו לחוקרים המעוניינים לזהות תפקידים פונקציונליים של אובילציה.

Introduction

ברוב eukaryotes, מיקרוטובוקלס ציר חייב לצרף לאזור אחד של כל כרומוזום, כינה ריכוז. קינטוכור הוא קומפלקס של חלבונים הנמצאים במרכז הריכוז. לימוד העיתוי של התנועה של מרכז ומעטפת החלבון והמבנה של קינטומאז חשוב להבנת אי-יציבות כרומוזום (CIN) והתקדמות הסרטן. השאלות העיקריות הן כיצד המיקום הכרומוזומים ותפקודו של מרכז הריכוז (כלומר, הזהות הצנטורלית) נקבעים וכיצד הם משתתפים בהפרדה מדויקת של כרומוזום. ברוב המינים, הנוכחות של נוקלאוטיס מיוחד המכיל חלבון דומה histone הנקרא מגדיר את הזהות צנטרומר. לכן, מוצע כי CENP-A הוא מחוון שאינו DNA (סימן אפיגנטי) של הזהות צנטרומר. חשוב להבהיר את המנגנון של האופן שבו CENP-A מגדיר את הזהות הצנטרומר בבני אדם.

זיהוי של צומת הולידיי-היומי חלבון (hjurp) הוא המלווה cenp-a-מיוחד שעליו הפיקדונות cenp-a ב מרכז הריכוז של היום^1,2,3. אנו דיווחו בעבר כי CUL4A-RBX1-COPS8 E3 לליגאז נדרש עבור cenp-A אובילציה על ליזין 124 (K124) ו צנטוררה לוקליזציה⁴. כמו כן, התוצאות שלנו הראו כי הגיוס צנטרומר של החדש מסונתז CENP-A דורש מראש הקיים אוביp-A⁵. לפיכך, מודל נמסר רומז כי CENP-A אובילציה עוברת בירושה דרך דימריזציה בין חטיבות התאים.

בניגוד לממצאים שלנו ולאלה של יו ואח ', התוצאות השליליות בנוגע ל-CENP-A והלוקליזציה הצנטגוניות שלה פורסמו לאחרונה⁶. המאמר טען כי CENP-A שינויים על ליזין 124 (K124) הם לוותר על הקמתה, תחזוקה, ותפקוד לטווח ארוך של מרכז האדם, מבוסס על התוצאות השליליות שלהם מראה כי מוטציה של K124R לא להשפיע על CENP-A צנטורייר לוקליזציה לא תאים⁶. עם זאת, יש מספיק מקום לדיון בתוצאות ובמסקנות שלהם, וכבר תיארנו איזו בעיה יכולה להיות בפרסום הקודם שלהם⁷. יש לשלם שימו לב כי הם התמזגו חלבונים עם CENP-A, שיש להם הרבה משקולות מולקולריות יותר מאשר בגודל של האנדוגניים CENP-A: למשל, הם התמזגו ~ 30 kDa חלבון פלורסנט משופרת (EYFP) כדי ~ 16 kDa CENP-A וניתח EYFP-CENP-K124R היתוך חלבון במערכת RPE-1 CENP-A^-/F מערכת. K124 אוביקוויב לא צפוי לאגד ישירות HJURP מבוסס על תחזיות מבנית⁴, עם זאת, תוספת של מונו-אוביקוויב הוא ניבא יש השפעה על היווצרות חלבון של Cenp-A. החלבון של CENP-A קונפורמציה יכול להיות שונה על ידי נוכחות של חלבון פיוז'ן גדול, ושינוי זה התאמות עשוי להסוות את השינויים מבניים שנגרמו על ידי אובדן אוביפורמציה. אנו מציעים כי המיזוג של חלבון בגודל גדול גורם אוביקווילציה על ליזין אחר מאשר K124 ב-EYFP-CENP-A K124R מוטציה ואת זה אוביקווילציה באתר אחר מעכב/מסכות המקורי K124R המוטציה פנוטיפים. ראיות כי אובילציה מתרחשת על ליזין שונים ב-CENP-A K124R חלבון מוטציה עם חלבון תג גדול (EYFP) דווחה בפרסום הקודם שלנו⁸. נמצא כי התיוג EYFP גורמת אוביקווינציה של אתר ליזין אחר של EYFP-CENP-A K124R וכי EYFP-CENP-K124R מוטציה נקשר HJURP. כתוצאה מכך, אובילציה זה באתר אחר מעכב/מסכות המקורי K124R יחיד מוטציה פנוטיפ, ושניהם EYFP-CENP-מוטציות K124R הראו צנטרומר לוקליזציה (השתמשנו והשוו pBabe-EYFP-CENP-A WT ו K124R מוטציה, יחד עם בקרת pBabe-EYFP.). התוצאות הראו כי דגל-מתויג או לא מתויגים CENP-A K124R מוטציות קטלניות אבל ניתן להציל על ידי פיוז ' ן monoubi, מציע כי CENP-A אובילציה היא הכרחית לכדאיות התא.

בשנים האחרונות, מחקרים רבים פיתחו בחני שונים לזהות שינויים פוסטטרנסלוניים (לפטין) של cenp-חלבון ואחרים מרכז-החלבונים קיטומודים, הן בvivo והן במבחנה^9,10,11. מקביל לפטין של חלבונים היסטון, כי הם מנגנון מרכזי המסדיר את הפונקציה של כרומטין, לפטין של רכיבים מרוכזת של כרוממיה מעורבים גם במנגנון חיוני כדי לווסת את המבנה הכולל ואת התפקוד של צנטרומרים. רוב האתרים של cenp-a ptm הם ספציפיים ל-cenp-a המכיל נוקלאוטיזומים, למרות כמה מהם נשמרים ב היסטון H3, מציע כי שינוי של שאריות אלה תורמים לפונקציה הספציפית צנטרומר. בשנת הבית, מתילציה, מתיונין, ואוביזלציה דווחו בעבר⁹, מציע כי cenp-A נתון למגוון מגוון של מערכי הקומבינטורית ומערכים שלהם על הטרמינוס האמינית והתחום הקיפול C-טרמינוס. חשיבותו של CENP-A שינויים בפונקציות מרובות נחשף על ידי קבוצות רבות כולל שלנו. פונקציות אלה כרוכות בתצהיר של CENP-A בריכוז, יציבות חלבונים, וגיוס של CCAN (הרשת המשויכת למרכז)⁹. עם זאת, מחקרים מוגבלים וממצאים של CENP-A השני מראש היכן ההשוואות נעשים עם אחד האבנים קאנוני כי ישירות או עקיף להסדיר את תפקידם. דוחות טכניים התמקדות במתודולוגיה כדי לזהות אלה CENP-A לפטין מוגבלים גם.

בגלל CENP-A אוביקווילציה נדרש עבור CENP-A התצהיר על צנטרומר¹², ירש דרך dimerization בין חלוקת התא⁵, והכרחית לכדאיות התאים⁸, השיטה לזהות cenp-A אובילציה יהיה חיוני בעתיד כדי ללמוד את הפעילות הפונקציונלית, מיצוב, ומבנה של צנטרומר. לכן, כאן אנו מתארים בניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי התיוג EYFP שגורם אוביקווילציה על ליזין שונים ב-CENP-A K124R מוטציה חלבון⁸. פרוטוקולים של בקרת שליטה אחרים וניתוחים (ניתוח אימונוoforסנס, המושבה התרחבות הגידול, ו בvivo אוביקווילציה) מוצגים גם כדי לדון את התוצאה של ניתוח המסה הגדולה ספקטרומטריה כראוי.

Protocol

1. תרבית תאים ורטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנים

הערה: EYFP-CENP-A מתבטא pBabe-EYFP-CENP-A ברמת חלבון דומה כדי אנדוסוגני CENP-A. סך הכל הסלולר cenp-חלבון מוחלף זה eyfp-cenp-a לאחר שיבוש של cenp-a^-/f אלל על ידי recombinase כמו ב rpe-1 cenp-a-/-תאים⁶.

1. הכנת הסופרנטנט המכיל רטרווירוס באמצעות תאי אריזה 293T.
   1. יום 0: התפשטות 293T בתאי אריזה על צלחת התרבות 6-היטב (1.0 x 10⁶ תאים/טוב). תאי תרבות ברמת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. מודיית את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO₂ עבור 24 h.
      הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית את צפיפות התא לשימוש בזריעה.
   2. יום 1: הכנת תגובת החצייה סביב 23 שעות לאחר התפשטות (24 שעות הנקודה היא 0 h נקודת ההעברה). ביטוי transfect בפלסאמצע של כל pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), ו pBabe-EYFP-CENP-K124R (B3164) (ראה טבלה 1).
   3. בחרו שילוב אחד של מארזים המסייעים/אריזות המפורטים בטבלה 2 והוסיפו אותם לצינורות המכילים את אחד הפלמידים המפורטים לעיל. יש בעיקר אלה 3 שילובים עבור המסייע/אריזות פלמידים (שולחן 2). כל שילוב עבד בניסויים אלה והראה יעילות מעבר דומה.
   4. להכין 50 μL של בינוני סרום מופחת ו לערבב 2.0 μg של כל pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), ו pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (ראה טבלה 1) הוספת שילוב אחד של המסייע/אריזות מארזים המפורטים בטבלה 2 מודקון תערובת זו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. התערובת הזאת היא פתרון A.
   5. הכינו עוד 50 μL של בינוני סרום מופחת ו לערבב 1.5 μL של החצייה ריאגנטים אני ו II, בהתאמה (טבלה של חומרים). מודקון תערובת זו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. התערובת הזאת היא פתרון ב.
      הערה: באופן אופציונלי, להוסיף רק 6.0 μL של החצייה מגיב השלישי (פוליאתילן [הפיי]; 1.0 mg/mL) בפתרון B או להוסיף 6.0 μL של החצייה הכימית השלישי בנוסף לחומרים ריאגנטים I ו-II בפתרון B (שולחן חומרי).
   6. פתרונות מערבבים A ו-B ביחד, ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
   7. לאחר שטיפת תאים תרבותיים פעם אחת עם PBS, להוסיף את התערובת של פתרונות A ו-B (כלומר, מורכבות DNA-ליפיד) ישירות לכל טוב של צלחת התרבות 6-היטב כי יש 500 μL מופחת סרום בינוני. הריכוז הסופי של הפלסמיד הוא 3.3 μg/mL.
   8. לאחר הדגירה של התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO₂ עבור 4.5 h, לשנות את המדיום כדי הגלוקוז גבוהה dmem עם 10% fbs ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. שים 2 מ ל/טוב של תרבות בינונית לאחר שינוי בינוני בצלחת התרבות 6-היטב.
   9. תרבות התאים בשעה 37 ° c באווירה של 5% CO₂ עבור 48 h לאחר הזיהום. לבצע זיהום רטרווירוס ביום 3 באמצעות supernatant המכיל רטרווירוס.
2. הידבקות רטרווירוס של התאים היעד של CENP-A^-/F rpe-1.
   1. יום 2: יום לפני זיהום, להפיץ את CENP-A^-/F rpe-1 תאים היעד כדי transfect ב 6-טוב התרבות היטב (2.25^{x 10 תאים} /טוב). התאים התרבותיים ב-Dמאמ: F12 בינונית (שולחן חומרים) עם 10% fbs ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      הערה: כפולת תאים למושבת המושבה, מאימונוצילונציה וניתוח כתמי אבן מערביים כשליטה. לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית את צפיפות התא לשימוש בזריעה.
   2. יום 3 (זיהום היום של הווירוס): ב 48 h לאחר העברת בתאי אריזה 293t, לאסוף את supernatant המכיל וירוס ומסנן באמצעות 0.45 יקרומטר מסנן (לא להשתמש במסנן 0.2 יקרומטר אשר להטות את המעטפה וירוס). מומלץ להשתמש במסננים polyethersulfone (PES).
   3. להדביק CENP-A^-/f -1 תאים עם הווירוס. עבור אחד טוב של לוחית 6-היטב התרבות, להוסיף 1 mL מדיה טרייה, 1 mL וירוס supernatant ו polybrene לריכוז הסופי של 8 μg/mL. מודטה CENP-A^-/F rpe-1 תאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO₂ עבור 4 ימים עד יום 7 לאחר הזיהום.
      הערה: תקופת הדגירה של הגדילה של CENP-A^-/F rpe-1 צריכה להיקבע באמצעות ניתוחים לקבלת תוצאות אופטימליות.

2. ניתוח של התאים המכילים pBabe-EYFP-CENP-A

1. יום 7:4 ימים לאחר זיהום רטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנה, להסיר את מדיום התרבות על ידי שאיפה. לשטוף את התאים פעם אחת עם TBS (25 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5; 125 מ"מ הנאל). החל TBS על הצד של בארות התרבות כדי למנוע הפרעה פני השטח של תאים.
   הערה: נקודת הזמן המיטבית לקיבוע התא חייבת להיקבע באמצעות המידע האמפירי. האותות של immunofluorescence הן EYFP-CENP-A WT ו K124R מוצגים במרכז לפחות 4 ימים לאחר זיהום רטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-בנייה גם ללא זיהום היצורים (נתונים לא מוצגים, איור 1C-E עבור הנתונים עם הידבקות ביצורים).
2. בצע קיבוע תא מתנול ו immunofluorescence כמתואר בעבר¹³.
3. כמו נוגדנים העיקרי להשתמש בנוגדן אנטי GFP (1:1000 דילול) ו נוגדן אנטי-CENP-B (יחס דילול של 1:200) עבור סמן מיקום צנטרומר ב-TBS המכיל 4% סרום עז (ראה טבלת חומרים עבור נוגדנים בשימוש).
4. הסרת מדיום הרכבה עודפת עם מגבת נייר לאטום את קצות שמיכות עם לק ציפורניים בשלב האחרון.
5. עיין בשיטה שתוארה בעבר¹³ עבור התבוננות בתמונה immunofluorescence רכישה, כימות וניתוח של האותות הנותרים של EYFP-Cenp-A ב צנטרומר.
6. בצע רכישת תמונה, עיבוד כולל פירוק, כימות וניתוח באמצעות תוכנות A או תוכנות B1 ו-B2 (ראה טבלת חומרים). באופן אופציונלי להשתמש תוכנות C1-C3 (ראה טבלת חומרים) עבור מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד סריקה.
   הערה: ראה 2.6.1 בקבצי קידוד משלימים עבור כל הפקודות המשמשות בתוכנה A. ראה 2.6.2 בקבצי קידוד משלים עבור כל הפקודות המשמשות תוכנות B1 ו-B2.

3. המושבה מוצלח בחני אומר באמצעות pbabe-eyfp-cenp-לאחר דלקת וירוס בסגנון רטרו

הערה: הסיבה לביצוע מעשה זה היא להשוות את הכדאיות התאית בין eyfp-cenp-a WT ו K124R מוטציה לאחר השיבוש של cenp-a^-/f אלל על ידי המין recombinase (לאחר החלפת הכולל של הסלולר cenp-חלבון).

1. רטרו וירוס-העברה של pBabe-EYFP-מבנים.
   1. בצע העברה רטרווירוס של CENP-A^-/F rpe-1 תאים כפי שמתואר בסעיף 1. בתאי תרבות ב-DMEM: בינונית F12 עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין עבור 72 h לאחר זיהום וירוס.
   2. שלושה ימים לאחר זיהום רטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנים (ביום 6), להוסיף בלפסיפידין (10 μg/mL) בבארות המכילות תאים מזוהמים לשמש עבור המושבה מעבר הצמיחה וניסויים בקרה. התאים מגודלים לפחות 14 יום לאחר זיהום וירוס בנוכחות של בלטות S. לשנות את המדיום המכיל בלטות כל 5 ימים.
      הערה: אם התאים מגיעים למפגש של 80% לפני הזריעה של שיטת המושבה (3.2.7. ו-3.2.8), העבר את התאים ב 1:2 ו-1:5 באמצעות טריסיזציה וציפוי בצלחת של 6 מיטב התרבות.
   3. לאסוף תאים עבור הכתם המערבי ביום 7 כדי לאשר את ביטוי החלבון של pBabe-EYFP-CENP-בנייה ללא זיהום היצורים. בצע ניתוח כתמי אבן מערבי כמתואר בסעיף 4. התוצאות מוצגות באיור 1B (נתיבים 1-4).
   4. עבור שיטת מושבה מחוץ לגידול עם זיהום וירוס היצור, לשמור על התאים גדלים 14 ימים לאחר זיהום וירוס בנוכחות של בלטות S (כלומר, לגדל תאים בתוך בלטות S המכיל בינוני עד יום 17 עבור התוצאות המוצגות כאן).
2. הדלקת וירוס בסגנון רטרו של pBabe-puro.
   הערה: יום 0 בשלב 3.2.1 מקביל ליום 13 בסעיף 3.1.
   1. היום 0 עד יום 3: לבצע העברה רטרווירוס של CENP-A^-/F rpe-1 תאים באמצעות pbabe-Puro (B3027) כמו ביטוי פלפמיד (ראה סעיף 1 לפרטים). הקפידו להוסיף בינונית תרבותית (10 μg/mL).
   2. יום 4: טריזיסיזציה לתאים כדי להתנתק מלוחית הרישוי. צלחת 500 או 5,000 תאים בטריליטה בלוח התרבות 6-היטב. בתאי תרבות ב-Dמאמ: F12 בינונית עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
   3. יום 5: הוספת בלטות S (10 μg/mL) למדיום התרבותי. עבור 5,000 או 500 תאים, לבחור תאים עם בלטות S (10 μg/ml) 3-24 ימים (עד יום 14 ב [3.2.7]) או 3-28 ימים (עד יום 18 ב [3.2.8]) לאחר זיהום וירוס של בנייה (pBabe-EYFP-CENP-מבנים).
      הערה: בתוך שיטת ההתפשטות הזאת, השילוב של היצור החדש של pBabe-puro מתווסף יחד עם ההתפתחות של pBabe-EYFP-CENP-A. ההעברה של pBabe-EYFP-CENP-A מבוצעת ב 3.1. הזיהום של היצור של pBabe-פורו מבוצע ב3.2.1.
   4. יום 10 (7 ימים לאחר זיהום וירוס בסגנון רטרו): לאסוף תאים עבור ניתוח בלוק המערבי כדי לאשר את המחסור בחלבון של שאנדוגני CENP-לאחר הידבקות וירוס של הרטרו ו/או ביטוי החלבון של pBabe-EYFP-CENP-מבנים באותו יום 10.
   5. בצע בלוק מערבי כמתואר בסעיף 4 באותו יום 10. התוצאות מוצגות באיור 1B (נתיבים 5-7).
   6. בצע ניתוח immunofluorescence (סעיף 2 לעיל) כדי לאשר כי הן EYFP-CENP-A WT ו K124R מקומי לריכוז 7 ימים לאחר הפעלת האנדוגניים הנותרים CENP-A allele. התוצאות מוצגות באיור 1ג-1e.
   7. יום 14: לבצע את המושבה מוצלח שיטת עם הצלחת הנזרע עם 5,000 תאים. תקן תאים עבור 10 דקות מתנול והכתם עבור 10 דקות בתמיסת קריסטל סגול (2.3% קריסטל סגול, 0.1% אמוניום oxalate, 20% אתנול (ראה איור 2B). לספור את מספר המושבות באמצעות תוכנת OpenCFU (ראה איור 2C).
   8. יום 18: השימוש לוחית הזרע עם 500 תאים. תאים לתקן ולהכתים כמתואר בשלב 3.2.7 (ראה איור 2B). לספור את מספר המושבות (ראה איור 2 ג).

4. ניתוח כתמי מערביות באמצעות pBabe-EYFP-CENP-A

הערה: עיין בשיטה שתוארה בעבר¹³ עבור ניתוח כתמי אבן מערבית באמצעות נוגדנים המצוינים באיור 1B ואיור 2a וטבלת חומרים עבור eyfp-cenp-חלבונים.

1. לבודד חלבונים על ידי lysing את התאים גדל עם זיהום וירוס שונים. לאחר מכן, השתמש 20 μg של חלבון בבאר אחת של SDS דף ג'ל. להעביר את החלבונים לקרום PVDF כמתואר בעבר¹³.
2. לשטוף את הממברנה 3x לאחר incubations עם נוגדנים משני הראשי. לזהות ולנתח את להקות החלבון על הקרום עם מערכת הדמיה אינפרא אדום ו/או המיגראואניוליבורגר לזיהוי חיסוני. תוצאות אלה מוצגות באיור 1B ובאיור 2a.
   1. למערכת הדמיה אינפרא-אדום כדי לאתר ולנתח את להקות החלבון, ראה שלב 4.2.1 בקבצי קידוד משלימים.
   2. השתמש במקלינסנציה כדי לזהות ולנתח את להקות החלבון, ראה שלב 4.2.2 בקבצי קידוד משלימים. עבור מערכת זו, השתמש במצע כימי (טבלת חומרים) הרגישה במיוחד (ecl).
   3. באופן אופציונלי, השתמש בכתם המערבי להתפשט מאגר להסיר נוגדנים מראש מחדש מקרום PVDF למחוק אותו עם נוגדנים שונים לקראת הבא של ניתוח מערבי. מדעית לקבוע את זמן הדגירה אופטימיזציה הטמפרטורה להשתמש.

5. התרבות התא, העברה, ו ב vivo אוביקטלציה באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A

הערה: רמת החלבון של EYFP-CENP-A ביטא pQCXIP-וקטור הוא ~ 10x גבוה יותר מאשר האנדוגניים ברמת החלבון. השימוש וקטור זה מקל immunoprecipitation של כמות גבוהה יותר של EYFP-CENP-חלבונים, התבוננות של להקות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A, וזיהוי של אוביקווילציה של EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה.

1. הvivo באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A.
   1. הזרע 36.2 x 10⁵ Cenp-A^-/f rpe-1 תאים בצלחת 10 ס מ רקמת הרקמה. תאי תרבות ברמת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית קובעת את צפיפות התא המשמשת בזריעה. הכינו לפחות 2 מנות לדוגמה אחת immunoprecipitation (IP) כדי לקבל מינימום של חלבון מוחלט של 1 מ"ג.
   2. דגירה את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO₂ עבור 18 h.
   3. , ב -17 לאחר זריעה. הכן את ריאגנטים החצייה
   4. להפוך את הפתרון על ידי ערבוב 6.7 μg פלאבין של כל pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-מK124R (B3256) (שולחן 1) ב 335 μl של בינוני סרום מופחת, ו-מודטה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. הוסף 6.7 μg פלאמיד של pcgn-האוביקוויב (B2806) לכל הדגימות.
      הערה: כל הווקטורים מפורטים בטבלה 1.
   5. להפוך את הפתרון B על ידי ערבוב 10.1 μL של החוצה ריאגנטים האני ו II, בהתאמה 335 μL סרום מופחת בינוני, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
      הערה: צעד אופציונלי הוא להוסיף רק 40.2 μL החצייה מגיב השלישי (פוליאתילן [הפיי]; 1.0 mg/mL) בפתרון B או להוסיף 40.2 μL החצייה מגיב השלישי בנוסף ריאגנטים החצייה אני ו II בפתרון B (טבלת חומרים).
   6. פתרונות מערבבים A ו-B ביחד, ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
   7. לאחר שטיפת תאים תרבותיים פעם אחת עם PBS, להוסיף את התערובת של פתרונות A ו-B (כלומר, מורכבות DNA-ליפיד) ישירות לכל אחד בודד 10 ס מ רקמת העור התבשיל כי יש 3.35 mL μL מופחת סרום בינוני.
      הערה: הריכוז הסופי הוא 1.67 μg/mL של פלסמיד.
   8. מודטה את התאים ב37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ עבור 4.5 h. לאחר 4.5 h, לשנות את המדיום כדי הגלוקוז גבוהה DMEM עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
   9. תרבות התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO₂ עבור 48 h לאחר הזיהום. לאסוף תאים עבור הכנה lysates תא.
2. הכנת חלבון חרוזים הקשורים בנוגדן אנטי-GFP.
   1. קח 25 μL (50% v/v) של חלבון חרוזים לתגובה אחת של immunoprecipitation (IP). לשטוף עם מאגר A1 (הטבלה של חומרים) לפחות 3x כדי להסיר את אטוח, ולעשות 50% פתרון עם מאגר A1 (20 מ"מ Tris-HCl, pH 7.4; 50 MM הנאל; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% הסרת מעכב פרוטאז בחינם).
   2. הוסף 2.0 μL של נוגדן אנטי-GFP (Anti 76: נוגדן תוצרת בית) לחרוזים שהוכנו לעיל ולהוסיף נפח 10x של מאגר A1 השוואת עם נפח חרוזים נטו.
   3. בצע סיבוב מקצה לקצה ב-4 ° צלזיוס עבור 4-18 h. אורך הזמן האופטימלי לסיבוב מקצה לקצה חייב להיקבע בהתאם ליעילות הimmunoprecipitation.
   4. צנטריפוגה את החרוזים ב 100 x g עבור 1 דקות ולהסיר את supernatant לא מאוגד. הוסף מאגר A1 כדי לבצע מחדש 50% (v/v) פתרון של החרוזים. השתמש 25 μL (50% v/v) של פתרון זה עבור תגובה אחת של IP.
3. Immunoprecipitation (IP) באמצעות חלבון חרוזים מספרד הקשורים בנוגדן אנטי-GFP.
   1. התאים lyse שהתקבלו בשלב 5.1.9 במאגר A1 על-ידי sonication ותהליך הקפאת הפשרה.
   2. מדידת ריכוזי חלבון ולנרמל כמויות חלבון בין דגימות IP שונות. הסר 5% מהדוגמה מכל צינור כדי לפעול כ-5% כדוגמת קלט ב-SDS-PAGE.
      הערה: מדגם הקלט 5% יכול להיות קפוא בחנקן נוזלי ומצויד ב-80 ° c, אם הוא לא טעון תוך יום.
   3. מערבבים את שאר 95% ליפוסט עם 25 μL (50% v/v) של חלבון חרוזים הקשורים לנוגדן אנטי-GFP שהוכן בשלב 5.2. בצע סיבוב מקצה לקצה ב-4 ° צלזיוס עבור 4-18 h.
      הערה: אורך הזמן האופטימלי לסיבוב מקצה לקצה חייב להיקבע כאמפירי.
   4. חלבון צנטריפוגה חרוזים עם חלבון מאוגד (כלומר, immunoprecipitates) עם 100 x g עבור 1 דקות, ולהסיר את supernatant. לשטוף את immunoprecipitates עם מאגר A1 על-ידי תפרידו ב 100 x g עבור 1 דקות. לבצע שלב זה 4x.
   5. מערבבים את הקלט 5% ואת שאר 95% הimmunoprecipitates עם מאגר טעינה של 2x ו-4x SDS-עמוד¹⁴, בהתאמה. מרתיחים שתי דגימות אלה עבור 5 דקות ולאחר מכן לטעון אותם על 10.0% הרפתקאות SDS-פוליאקרילאמיד ג'ל עבור אלקטרופורזה בנתיבים שונים. השתמש ביותר גדול SDS-דף ג'ל (למשל, 17 ס"מ x 15 ס מ) עבור אלקטרופורזה. אם מדובר בדגימות של ג'ל קטן יותר, ייתכן שלא ניתן יהיה להבחין בלהקות אוביקטלציה ברורות/חדות.
   6. בצע ניתוח כתמי מערבי כמתואר בסעיף 4 באמצעות הנוגדנים המצוינים בדוח הקודם⁸. התוצאה מופיעה באיור 2A.
   7. השתמש בכתם המערבי להתפשט מאגר להסיר את הנוגדנים טרום הדגירה של קרום PVDF למחוק אותו עם נוגדנים שונים לסיבוב הבא של ניתוח כתמי מערביות.

6. ספקטרומטר מסה כדי לזהות את האתר אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה

1. העברה לניתוח ספקטרומטר המסה באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A.
   1. זרעים CENP-A^-/F rpe-1 תאים בצלחת 10 ס מ רקמת הרקמה. בדוק כי צפיפות התא היא 36.2 x 10⁵ תאים לכל מנה. תאי תרבות ברמת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. הכינו לפחות 20 מנות עבור אחד immunoprecipitation (IP) לדוגמה, כדי לקבל לפחות 10 מ"ג חלבון כולל (לראות 5.3).
      הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית את צפיפות התא לשימוש בזריעה.
   2. מודחת את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO₂ עבור 18 h. הכינו את המזרעות העירוי ~ 23 שעות לאחר התפשטות (24 שעות הנקודה היא 0 h נקודת ההעברה).
   3. ב -17 לאחר זריעה, הכינו את התאים הללו לטיפול בתאי העור (4.1.3). תאים מזוהמים יש pCGN-הא-אוביקוויב (B2806) ו-pQCXIP-EYFP-מK124R (B3256).
   4. מודיית את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO₂ עבור 48 h לאחר החצייה. לאסוף תאים עבור ליסביטים תא.
   5. Lyse תאים במאגר A1 ולבצע immunoprecipitation as (5.2) ו (5.3). הפעל את שני immunoprecipitation lysates כדלקמן (6.1.6) ו (6.1.7).
      הערה: ב (6.1.6), הפעל את המדגם בתקן טריס-גליצין רגיל. In (6.1.7), להפעיל את המדגם של הזמין מסחרית 4%-12% החלבון Bis-Tris. ראה גם דיון.
   6. שמור דוגמה אחת עבור 10% של סך immunoprecipitants כדי לאשר EYFP-CENP-אובילציה ו לקבוע בדיוק את המיקום של EYFP מחולק אוביקוויל-CENP כמתואר בסעיף 5. הפעל דוגמה זו ב-ג'לים סטנדרטיים של טריס-גליצין. SDS-העמודים והכתם המערבי בוצעו כמו (5.3).
   7. שמור דוגמה נוספת עבור 90% של סך immunoprecipitants עבור ניתוח ספקטרומטר המסה. הפעל מדגם זה בתוך שתי בארות של זמין מסחרית 4%-12% Bis-Tris חלבונים. בצע כתמים כחולים coomassie באמצעות הפתרון הכחול coomassie. בלו וחותכים את אזור הג של 50-70 kDa (מונו-רוב-EYFP-CENP-A K124R אזור). השתמש באזור ג'ל זה לניתוח ספקטרומטר המסה.
2. ניתוח ספקטרומטר מסה באמצעות העיכול בתוך ג'ל.
   1. חותכים כל פיסת ג'ל של עניין לחתיכות קטנות (1 מ"מ²) ומניחים אותו לתוך 0.5 mL של חלבון מחייב נמוך צינורות.
   2. לשטוף עם 100 μL 50% (v/v) acetonitrile ב 25 מ"מ NH₄hco₃, מערבולת 10-15 min, ספין למטה, להיפטר supernatant, לחזור על 3x.
   3. לרכז את המדגם באמצעות מרכז ואקום שחקן הספסל עבור 30 דקות לייבש את חתיכות ג'ל.
   4. הוסף 10 μL של 10 ng/μL רצף של כיתה ולתת את חתיכות ג'ל כדי לעבור מחדש עבור 5 דקות.
   5. הוסף 25 מ"מ NH₄hco₃ פשוט מספיק כדי לכסות את חתיכות ג'ל, לעכל ב 37 ° c לילה.
   6. העבר את הסופרנטנט המיתעכל לתוך שפופרת נקי 0.65 mL. הוסף 50% (v/v) acetonitrile/5% (v/v) החומצה הפורמית (30 μL או מספיק כדי לכסות), מערבולת 10 דקות, ספין להעביר לתוך צינור החילוץ אותו. חזור על 3x.
   7. הוסף 10 μL acetonitrile לחתיכות ג'ל, מערבולת 5 דקות, ו ספין למטה. העבר את הסופרנטאנט לאותה צינורית.
   8. לרכז את הדגימות באמצעות מרכז ואקום הספסל כדי 2 μl, להוסיף 8 μl 3% (v/v) acetonitrile/2% (v/v) החומצה פורמית למדגם, מערבולת עבור 15 דקות, ו ספין למטה ב 16,000 x g עבור 30 דקות. דגימות מוכנות לניתוח ספקטרומטר המסה.
   9. בצע ייבוא נתונים MS עם LC-MS/MS באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מערכת (טבלת חומרים) ביחד עם כלי ספקטרומטר מסה (טבלת חומרים).
   10. הכנס 8 μL של מדגם מחדש לעמודה כרומטוגרפית נוזלית בשלב הפוך (RPLC).
   11. הפרד את הפפטידים עם 2-80% הדרגתי של הממס B ב 60 דקות. ודא כי מעבר הצבע מורכב אחוז הולך וגובר של B ממס מ 2% עד 22% ב 40 דקות, 22% כדי 35% מומס B ב 12 דקות, ולאחר מכן לטפס על 80% מומס B ב 4 דקות, ולבסוף החזקת 80% הומס b עבור 4 הדקות האחרונות. הגדר את קבוע קצב הזרימה ב-300
       הערה: ממיס A מכיל 0.1% החומצה פורמית ו 2% acetonitrile, ממס B מכיל 0.1% החומצה פורמית ו 98% acetonitrile. כל הריכוזים מוצגים כאמצעי אחסון/אמצעי אחסון.
   12. איסוף נתונים מבוססי-ספקטרומטר מסה באמצעות מצב רכישה תלוי-נתונים. בקצרה, לאסוף MS ספקטרום ב 350 – 1500 m/z עבור 250 MS. בחר את למעלה 50 מקדם מקדים אינטנסיבי עם טעינה 2 – 5 עבור פיצול נוסף. לאסוף MS/MS ספקטרום ב 100 – 2000 m/z עבור 100 MS, להוציא יונים מקודמן מחדש בחירה עבור 15 s.
   13. לחיפוש במסד הנתונים, פתח את התוכנה המסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לנתח נתונים ספקטרומוטוריקה מאסיבית בשולחן העבודה.
   14. כדי לבצע חיפוש חדש, לחץ על כפתור "LC" בתפריט העליון. לאחר מכן לחץ על "Add" כפתור כדי להעלות את המקורי MS נתונים raw קבצים.
   15. בחר "מזהה חלבון אנושי"בשיטה "פרגון" כשיטת חיפוש במסד הנתונים. חפש את קבצי MS המקורי של נתונים גולמיים נגד מסד הנתונים של יוניפרוט הומו-ספיינס (המכיל 160,566 רצפים, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
   16. הגדר את הפרמטרים לחיפוש כדלקמן: בחירת טריפסין כאנזים העיכול, מאפשרים עד 3 ביקנים חסרים, 4 שינויים ו-2-5 חיובים לכל פפטיד. הגדר שגיאת מסה עד 20 עמודים לדקה עבור החיפוש הראשון ו-0.02 Da עבור יונים מפוצלים. ציין ספי שיעור גילוי כוזב (רוזוולט) עבור אתרי חלבונים, פפטיד ושינויים שפחות מ-1%. הגדר את כל הפרמטרים האחרים בתוכנה לערכי ברירת מחדל (ראה איור 3 לניתוח ספקטרומטר המסה).
   17. לחץ עלכפתור "שמירה בשם" בזכות התפריט העליון, בחר תיקיה לאחסון תוצאות החיפוש, הזן את שם החיפוש ולחץ על כפתור "שמור".
   18. לחץ על "תהליך" כפתור בצד ימין של התפריט העליון כדי להתחיל את החיפוש. לאחר סיום החיפוש, הנתונים עם שם החיפוש שהוזן יאוחסנו באופן אוטומטי בתיקיה שנבחרה. ניתן לפתוח את הנתונים בקלות על-ידי תוכנה F.
   19. כדי לקבל את ספקטרום MS/MS של כל פפטיד ספציפי, לחץ פעמיים על תוצאות החיפוש כדי לפתוח אותו על ידי תוכנה F. ראשית, לחץ על החלבון ברשימת החלבונים בחלק העליון של התפריט, ולאחר מכן לחץ על פפטיד באמצע התפריט. MS/MS של פפטיד זה מוצג בתחתית התפריט.
   20. כדי לייצא ולשמור של MS/MS ספקטרום, לחיצה ימנית על MS/MS ספקטרום בחלק התחתון של התפריט, בחר להעתיק ולאחר מכן להדביק קובץ מתאים כגון PPT או doc. בפורמט.

תוצאות

Eyfp-CENP-מוטציה K124 מראה אוביקווילציה, אינטראקציה עם HJURP, ואין פגמים בלוקליזציה של מרכז התקשורת לא תאים. כאן המערכת דיווחה על ידי fachinetti ואח '. (2017)⁶ היה re-היווה: ב דיפלואידי אנושי (rpe-1) תאים נושא אחד שיבשו ואחד ' ' מכוסל ' ' cenp-a אלל (cenp-a^-/f), eyfp-cenp-a היה ביטא את וקטור pba...

Discussion

כאן תיארנו שיטות של ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי התיוג EYFP שגורם אוביקווילציה על ליזין שונים ב-CENP-A K124R מוטציה חלבון⁸. בתוצאות שלנו, זיהינו בהצלחה אוביקווילציה על ליזין 306 (K306) ב-EYFP-CENP-K124R, המתאים ליזין 56 (K56) ב-CENP-A באמצעות ניתוח ספקטרומטר ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes	Eppendorf	022431064	For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish	BIOFIL/JET, China	700224	10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6-well culture plate
CentriVap	LABCONCO	-	Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm	Eksigent Technologies	805-00120	Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE	100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS	63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope	Leica	-	motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source	Leica		External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)	Surgipath	105	Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus	Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences	31071010	Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D	Eksigent Technologies	-	liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher	NP0335BOX	The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	-	Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera	Hamamatsu	C10600-10B	CCD camera
PAP Pen	Binding Site	AD100.1	For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM	VWR	25382-166	10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size)	Junyi, China	JY-SCZ6+	Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted	VWR International	48312-013	Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody	Novus Biologicals	H00001059-B01P	Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH	ABCAM	ab37168	Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH	Invitrogen	PA1987	Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody	ANTI #76 (Homemade antibody)		Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10)	Roche	11815016001	Rat monoclonal antibody
anti-HJURP	Proteintech Group	15283–1-AP	Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin	Bethyl Laboratories	A300-317A-1	Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33996-185	Microtip for sonication
Buffer A1	-	-	20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11-873-580-001	Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250	BBI Life Sciences	CAS 6104-59-2	Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)	SigmaI-Aldrich	HT90132-1L	For colony staining
DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	For nuclear staining
DMEM: F12 Medium	ATCC	30-2006	DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Life Technologies/Gibco	10082	FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol	Fisher	A412-4	Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)	Fisher Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)	Non-fat skim milk
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	Reduced serum media
p-phenylenediamine	SIGMA-SLDRICH	P6001	For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid	Fisher/Gibco	15-140	Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION	SIGMA-SLDRICH	P 8920	Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml	Polysciences	23966–2	Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads	GE Healthcare/Amersham	17-0963-03	Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	PI21059	Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo	34095	Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)	-	-	Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software	Olympus	-	Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software	Olympus	-	Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18	Olympus	-	Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0	LI-COR Biosciences	-	Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System	Bio-Rad	-	Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System	LI-COR Biosciences	-	Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware	-	-	For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software	Improvision/PerkinElmer	-	Software A
ProteinPilot Software version 4.5	AB SCIEX	-	Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software	Bio-Rad	-	Software E
TripleTOF 5600+ System	AB SCIEX	-	Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)	PerkinElmer	-	Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)	PerkinElmer	-	Software B2