Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

Resumo

A ubiquização CENP-A é um importante requisito para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular. Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização da proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) marcada pela EYFP.

Resumo

Estudar a estrutura e a dinâmica das cinetochores e centrosmers é importante na compreensão da instabilidade cromossômica (CIN) e da progressão do câncer. Como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e participar da segregação precisa do cromossomo é uma questão fundamental. O CENP-A é proposto para ser o indicador não-DNA (marca epigenética) da identidade do centromere, e a ubiquização CENP-A é necessária para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular.

Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a ubiquização em uma lise diferente é induzida por causa da marcação do EYFP na proteína mutante CENP-A K124R. A ubiquização de Lysine 306 (K306) no EYFP-CENP-A K124R foi identificada com sucesso, o que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. Uma ressalva é discutida no uso de GFP/EYFP ou na marcação de proteína de alto peso molecular como ferramenta para analisar a função de uma proteína. Também é discutido o limite técnico atual para a detecção de bandas ubiquadas, identificação de ubiquização específica do local e visualização de ubiquização em células vivas ou uma única célula específica durante todo o ciclo celular.

O método de análise de espectrometria de massa aqui apresentado pode ser aplicado à proteína CENP-A humana com diferentes tags e outras proteínas centromere-kinetochore. Esses métodos combinatórios que consistem em vários ensaios/análises poderiam ser recomendados para pesquisadores interessados em identificar funções funcionais de ubiquização.

Introdução

Na maioria dos eucariotes, os microtúbulos de fuso devem ser anexados a uma única região de cada cromossomo, denominado centômero. O kinetochore é um complexo de proteínas que estão localizadas no centromere. Estudar o tempo dos movimentos da proteína centrómera e da kinetochore e a estrutura de cinetochores e centromers é importante para a compreensão da instabilidade cromossomo (CIN) e da progressão do câncer. As principais questões são como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e como participam da segregação precisa do cromossomo. Na maioria das espécies, a presença de um nucleossomo especial contendo uma proteína específica semelhante a histona chamada CENP-A define a identidade do centromere. Portanto, propõe-se que o CENP-A seja o indicador não-DNA (marca epigenética) da identidade centromere. É importante elucidar o mecanismo de como o CENP-A define a identidade centrômera em humanos.

A proteína de reconhecimento de junção Holliday (HJURP) é o acompanhante específico do CENP-A que deposita CENP-A em nucleosósmos centréricos^1,,2,,3. Já noticiamos anteriormente que o CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase é necessário para ubiquização CENP-A na lysina 124 (K124) e na localização do centromere⁴. Além disso, nossos resultados mostraram que o recrutamento centralizado do CENP-A recém-sintetizado requer ubiquização pré-existente CENP-A⁵. Assim, foi fornecido um modelo sugerindo que a ubiquização CENP-A é herdada por meio da dimerização entre as divisões celulares.

Em contraste com nossos achados e os de Yu et al., os resultados negativos relativos ao CENP-A e sua localização centromérica foram publicados recentemente⁶. O artigo alegou que as modificações do CENP-A na lysina 124 (K124) são dispensáveis para o estabelecimento, manutenção e função de longo prazo dos centrosmers humanos, com base em seus resultados negativos mostrando que a mutação do K124R não afetou a localização do centromere CENP-A nem a viabilidade^{celular 6}. No entanto, há espaço suficiente para debate em seus resultados e conclusões, e já descrevemos que problema poderia haver em sua publicação anterior⁷. Atenção deve ser dada que eles fundiram proteínas com CENP-A, que têm pesos moleculares muito maiores do que o tamanho do CENP-A endógeno: por exemplo, fundiram ~30 kDa proteína fluorescente amarela aumentada (EYFP) para ~16 kDa CENP-A e analisaram a proteína de fusão EYFP-CENP-A K124R em seu sistema de eliminação RPE-1 CENP-A^-/F. A ubiquitina K124 não deverá se ligar diretamente ao HJURP com base nas previsões estruturais⁴, no entanto, prevê-se que a adição de mono-ubiquitina tenha um impacto na conformação proteica do CENP-A. A proteína da conformação CENP-A pode ser alterada pela presença de uma grande proteína de fusão, e essa mudança conformacional pode mascarar as alterações estruturais causadas pela perda da ubiquidade. Sugerimos que a fusão de proteínas de grande porte induz a ubiquização em uma lise diferente do K124 no mutante EYFP-CENP-A K124R e esta ubiquização em outro local inibe/mascara o fenótipo mutante original K124R. Evidências de que a ubiquização ocorre em diferentes lisesinas na proteína mutante CENP-A K124R com uma grande proteína de etiqueta (EYFP) foi relatada em nossa publicação anterior⁸. Verificou-se que a marcação EYFP induz a ubiquização de outro local de lise de EYFP-CENP-A K124R e que o mutante EYFP-CENP-A K124R se liga ao HJURP. Como resultado, essa ubiquização em outro local inibe/mascara o fenótipo mutante original K124R, e tanto os mutantes EYFP-CENP-A WT e K124R mostraram localização de centromere (usamos e comparamos pBabe-EYFP-CENP-A WT e K124R mutantes, juntamente com pBabe-EFPYFP control.). Os resultados demonstraram que os mutantes CENP-A K124R marcados por bandeiras são letais, mas podem ser resgatados por uma fusão de monoubiquidade, sugerindo que a ubiquização CENP-A é indispensável à viabilidade celular.

Nos últimos anos, muitos estudos desenvolveram diferentes ensaios para identificar modificações pós-transacionais (PTMs) da proteína CENP-A e outras proteínas centromere-kinetochore tanto in vivo quanto in vitro^9,,10,,11. Análogos aos PTMs de proteínas histonas que são um dos principais mecanismos que regulam a função da cromatina, PTMs de componentes centromericos de cromatina também estão envolvidos em um mecanismo essencial para regular a estrutura geral e a função dos centromers. A maioria dos sítios CENP-A PTM são específicos para nucleosómos contendo CENP-A, embora alguns deles sejam conservados em histona H3, sugerindo que a modificação desses resíduos contribuem para a função específica do centromere. Os PTMs de CENP-A, incluindo fosforilação, acetilação, metilação e ubiquização foram relatados anteriormente⁹, sugerindo que o CENP-A é submetido a uma variedade de PTMs e suas matrizes combinatórias em seu domínio amino terminus e C-terminus histone-fold. A importância das modificações do CENP-A em múltiplas funções foi revelada por muitos grupos, incluindo o nosso. Essas funções envolvem deposição do CENP-A em centrosmers, estabilidade proteica e recrutamento da CCAN (rede constitutiva associada ao centromere)⁹. No entanto, estudos limitados e achados de PTMs CENP-A são pré-formados onde comparações são feitas com uma das histonas canônicas que regulam direta ou indiretamente sua função. Relatórios técnicos com foco na metodologia de identificação desses PTMs CENP-A também são limitados.

Como a ubiquização CENP-A é necessária para a deposição do CENP-A no centromere¹², herdada por dimerização entre a divisão^{celular 5}, e indispensável à viabilidade celular^8,o método para identificar a ubiquização CENP-A seria essencial no futuro para estudar a atividade funcional, o posicionamento e a estrutura do centromere. Portanto, aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a marcação EYFP induz a ubiquização em uma ubiquização diferente na proteína mutante CENP-A K124R⁸. Protocolos de outros ensaios e análises de controle (análise de imunofluorescência, ensaio de crescimento de colônias e ensaio de onipresençação in vivo) também são apresentados para discutir o resultado da análise de espectrometria de massa corretamente.

Protocolo

1. Cultura celular e transfecção retrovírus de construções pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: O EYFP-CENP-A é expresso a partir de pBabe-EYFP-CENP-A em nível de proteína semelhante ao CENP-A endógeno. A proteína CENP-A celular total é substituída por este EYFP-CENP-A após a interrupção do CENP-A^-/F aleelo por Cre recombinase como em células RPE-1 CENP-A-/-⁶.

1. Preparação do supernatante contendo retrovírus usando células de embalagem 293T.
   1. Dia 0: Espalhe células de embalagem 293T na placa de cultura de 6 poços (1,0 x 10⁶ células/bem). Células de cultura em DMEM de alta glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 24 h.
      NOTA: Para obter resultados ideais, determine empiricamente a densidade celular para usar na semeadura.
   2. Dia 1: Prepare a reação de transfecção por volta das 23h após a propagação (24h ponto é 0h ponto da transfecção). A expressão transfecte plasmid de cada pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) e pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (ver Tabela 1).
   3. Escolha uma combinação de plasmídeos auxiliares/embalagens listados na Tabela 2 e adicione-os aos tubos contendo um dos plasmídeos listados acima. Existem principalmente essas 3 combinações para plasmídeos auxiliares/embalagens(Tabela 2). Qualquer combinação funcionou nesses experimentos e mostrou eficiência de transfecção semelhante.
   4. Prepare 50 μL de meio de soro reduzido e misture 2,0 μg de cada pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), e pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (ver Tabela 1) adicionando uma combinação de plasmídeos auxiliares/embalagens listados na Tabela 2 (veja abaixo). Incubar esta mistura em temperatura ambiente por 5 minutos. Esta mistura é a solução A.
   5. Prepare outros 50 μL de meio soro reduzido e misture 1,5 μL de reagentes de transfecção I e II, respectivamente(Tabela de Materiais). Incubar esta mistura em temperatura ambiente por 5 minutos. Esta mistura é a solução B.
      NOTA: Opcionalmente, adicione apenas 6,0 μL de reagente de transfecção III (polietileneimina [PEI]; 1,0 mg/mL) na solução B ou adicione 6,0 μL de reagente de transfecção III, além dos reagentes de transfecção I e II na solução B(Tabela de Materiais).
   6. Misture as soluções A e B juntas, e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
   7. Depois de lavar as células cultivadas uma vez com PBS, adicione a mistura de soluções A e B (ou seja, complexo DNA-lipídicos) diretamente a cada poço da placa de cultura de 6 poços que tem 500 μL de meio de soro reduzido. A concentração final do plasmídeo é de 3,3 μg/mL.
   8. Depois de incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 4,5 h, mude o DMEM médio para a alta glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Coloque 2 mL/bem de cultura após a mudança média na placa de cultura de 6 poços.
   9. Cultura as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 48 h após a transfecção. Realize a infecção por retrovírus no dia 3 usando o supernatante contendo retrovírus.
2. Infecção por retrovírus das células-alvo CENP-A^-/F RPE-1.
   1. Dia 2: Um dia antes da infecção, espalhe células-alvo CENP-A^-/F RPE-1 para transfetar no poço de cultura de 6 poços (2,25 x 10⁵ células/bem). Células de cultura em DMEM: F12 médio (Tabela de Materiais) com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina.
      NOTA: Espalhe células para ensaios de crescimento de colônias, imunofluorescência e análise de manchas ocidentais como controle. Para obter resultados ideais, determine empiricamente a densidade celular para usar na semeadura.
   2. Dia 3 (dia da infecção do vírus): Às 48 horas após a transfecção de células de embalagem 293T, recolher o supernasal contendo vírus e filtrar através de filtro de 0,45 μm (não use um filtro de 0,2 μm que irá tesourar o envelope do vírus). Recomenda-se o uso de filtros polietroésulfone (PES).
   3. Infectar células CENP-A^-/F RPE-1 com o vírus. Para um poço da placa de cultura de 6 poços, adicione 1 mL de mídia fresca, supernanato de vírus de 1 mL e polibrene a uma concentração final de 8 μg/mL. Incubar células CENP-A^-/F RPE-1 a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 4 dias até o dia 7 após a transfecção.
      NOTA: O período de incubação do crescimento celular CENP-A^-/F RPE-1 deve ser determinado empiricamente, seguindo as análises para obter resultados ideais.

2. Análise de imunofluorescência de células contendo pBabe-EYFP-CENP-A

1. Dia 7: 4 dias após a infecção por retrovírus das construções pBabe-EYFP-CENP-A, remova o meio de cultura por aspiração. Enxágüe células uma vez com TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl). Aplique TBS ao lado dos poços de cultura para evitar perturbar a superfície das células.
   NOTA: O ponto de tempo ideal para fixação celular deve ser determinado empiricamente. Sinais de imunofluorescência tanto do EYFP-CENP-A WT quanto do K124R são detectáveis no centromer pelo menos 4 dias após a infecção por retrovírus das construções pBabe-EYFP-CENP-A mesmo sem infecção por Cre (dados não mostrados, Figura 1C-E para os dados com infecção por Cre).
2. Realize a fixação celular de metanol e a coloração da imunofluorescência, conforme descrito anteriormente¹³.
3. Como anticorpos primários usam um anticorpo anti-GFP (diluição de 1:1.000) e um anticorpo anti-CENP-B (razão de diluição de 1:200) para um marcador de localização centromere em TBS contendo 4% de soro de cabra (ver Tabela de Materiais para anticorpos utilizados).
4. Remova o excesso de montagem do meio com uma toalha de papel e sele as bordas da tampa com esmalte na última etapa.
5. Consulte o método anteriormente descrito¹³ para observação de imagem de imunofluorescência, aquisição, quantificação e análise de sinais remanescentes de EYFP-CENP-A no centromere.
6. Realizar aquisição de imagens, processamento incluindo desconvolução, quantificação e análise utilizando os softwares A ou Softwares B1 e B2 (ver Tabela de Materiais). Opcionalmente, use softwares C1-C3 (ver Tabela de Materiais) para um microscópio de varredura a laser confocal.
   NOTA: Consulte 2.6.1 em arquivos de codificação suplementar para todos os comandos usados no Software A. Consulte 2.6.2 em arquivos de codificação suplementar para todos os comandos usados nos softwares B1 e B2.

3. Ensaios de crescimento da colônia usando pBabe-EYFP-CENP-A após infecção pelo vírus retro-Cre

NOTA: A razão para a realização deste ensaio é comparar a viabilidade celular entre o mutante EYFP-CENP-A WT e K124R após a interrupção do CENP-A^-/F alelo por Cre recombinase (após a substituição da proteína CENP-A celular total).

1. Transfecção retrovírus de construções pBabe-EYFP-CENP-A.
   1. Realize a transfecção retrovírus das células CENP-A^-/F RPE-1, conforme descrito na seção 1. Células de cultura em DMEM: F12 médio com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina por 72 h após a infecção pelo vírus.
   2. Três dias após a infecção por retrovírus das construções pBabe-EYFP-CENP-A (no dia 6), adicione blasticidin S (10 μg/mL) em poços contendo células transfeinadas para serem usados para ensaios de crescimento e controle de colônias. As células são cultivadas pelo menos 14 dias após a infecção pelo vírus na presença de blasticidin S. Mude o meio contendo blasticidin S a cada 5 dias.
      NOTA: Se as células atingirem cerca de 80% de confluência antes de semear para o ensaio da colônia (3.2.7. e 3.2.8), passar as células em proporção 1:2 e 1:5 por trippsinização e revestimento em uma placa de cultura de 6 poços.
   3. Coletar células para a mancha ocidental no dia 7 para confirmar a expressão proteica das construções pBabe-EYFP-CENP-A sem infecção por Cre. Realize a análise da mancha ocidental, conforme descrito na seção 4. Os resultados são mostrados na Figura 1B (faixas 1-4).
   4. Para o ensaio de crescimento da colônia com a infecção pelo vírus Cre, mantenha as células crescendo por 14 dias após a infecção pelo vírus na presença de blasticidin S (ou seja, cultivar células em blasticidin S contendo meio até o dia 17 para os resultados aqui apresentados).
2. Infecção do vírus Retro-Cre de pBabe-puro-Cre
   NOTA: O dia 0 na etapa 3.2.1 corresponde ao dia 13 da seção 3.1.
   1. Dia 0 ao Dia 3: Realize a transfecção retrovírus das células CENP-A^-/F RPE-1 usando pBabe-puro-Cre (B3027) como plasmídeo de expressão (ver seção 1 para obter detalhes). Certifique-se de que blasticidin S (10 μg/mL) seja adicionado no meio de cultura.
   2. Dia 4: Células de trypsinize para desprender-lo da placa. Placa 500 ou 5.000 células em triplicado na placa de cultura de 6 poços. Células de cultura em DMEM: meio F12 com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina.
   3. Dia 5: Adicione blasticidin S (10 μg/mL) ao meio de cultura. Para 5.000 ou 500 células de revestimento, selecionar células com blasticidin S (10 μg/ml) 3-24 dias (até o dia 14 em [3.2.7]) ou 3-28 dias (até o dia 18 em [3.2.8]) após infecção por vírus de construções (construções pBabe-EYFP-CENP-A).
      NOTA: Neste ensaio de crescimento da colônia, a transfecção do pBabe-puro-Cre é adicionada juntamente com a transfecção de pBabe-EYFP-CENP-A. A transfecção do pBabe-EYFP-CENP-A é realizada em 3.1. A transfecção do pBabe-puro-Cre é realizada em 3.2.1.
   4. Dia 10 (7 dias após a infecção pelo vírus retro-Cre): Coletar células para análise de manchas ocidentais para confirmar o esgotamento proteico do CENP-A endógeno após infecção pelo vírus retro-Cre e/ou expressão proteica de construções pBabe-EYFP-CENP-A no mesmo dia 10.
   5. Faça manchas ocidentais como descrito na seção 4 no mesmo dia 10. Os resultados são mostrados na Figura 1B (faixas 5-7).
   6. Realize a análise de imunofluorescência (seção 2 acima) para confirmar que tanto o EYFP-CENP-A WT quanto o K124R localizados no centromere 7 dias após a inativação do alelo CENP-A endógeno restante. Os resultados são mostrados na Figura 1C-1E.
   7. Dia 14: Realize o ensaio de crescimento da colônia com a placa semeada com 5.000 células. Fixar células por 10 min em metanol e manchar por 10 minutos em uma solução violeta cristalina (2,3% violeta cristalina, 0,1% de oxalato de amônio, 20% etanol (ver Figura 2B). Conte o número de colônias usando o software OpenCFU (ver Figura 2C).
   8. Dia 18: Use a placa semeada com 500 células. Células de correção e coloração descritas na etapa 3.2.7 (ver Figura 2B). Conte o número de colônias (ver Figura 2C).

4. Análise de manchas ocidentais usando pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: Consulte o método^{anteriormente descrito 13} para análise de manchas ocidentais utilizando anticorpos indicados na Figura 1B e Figura 2A e Tabela de Materiais para proteínas EYFP-CENP-A.

1. Isolar proteínas ao lise as células cultivadas com diferentes infecções por vírus. Em seguida, use 20 μg de proteína em um poço de gel de PÁGINA SDS. Transfira as proteínas para uma membrana PVDF como descrito anteriormente¹³.
2. Lave a membrana 3x após incubações com anticorpos primários secundários. Detecte e analise as bandas proteicas na membrana com o sistema de imagem infravermelha e/ou o imager de chemiluminescence para detecção de imunoblot. Estes resultados são mostrados na Figura 1B e Figura 2A.
   1. Para que o sistema de imagem infravermelha detecte e analise as bandas de proteína, consulte o passo 4.2.1 em arquivos de codificação suplementar.
   2. Use o imager de chemiluminescence para detectar e analisar as bandas de proteína, ver o passo 4.2.2 em arquivos de codificação suplementar. Para este sistema, use um substrato de chemiluminescente aprimorado ultrasensível (ECL)(Tabela de Materiais).
   3. Opcionalmente, use tampão de descascamento de manchas ocidentais para retirar anticorpos pré-incubados da membrana PVDF e reblotá-lo com diferentes anticorpos para a próxima volta da análise ocidental. Determine empiricamente o tempo e a temperatura otimizados de incubação a serem usados.

5. Ensaios de cultura celular, transfecção e on vivo ubiquização utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A

NOTA: O nível proteico de EYFP-CENP-A expresso do pQCXIP-vetor é ~ 10x maior do que o nível de proteína CENP-A endógeno. O uso deste vetor facilita a imunoprecipitação de uma maior quantidade de proteínas EYFP-CENP-A, observação das bandas de ubiquização do EYFP-CENP-A e identificação da ubiquização da proteína CENP-A marcada pela EYFP (EYFP-CENP-A) através da análise de espectrometria de massa.

1. Transfecção para ensaios de ubiquização in vivo usando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
   1. Sementes 36,2 x 10⁵ células CENP-A^-/F RPE-1 em um prato de cultura tecidual de 10 cm. Células de cultura em DMEM de alta glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina.
      NOTA: Para obter resultados ideais, determine empiricamente a densidade celular a ser usada na semeadura. Prepare pelo menos 2 pratos para uma amostra de imunoprecipitação (IP) para obter um mínimo de 1 mg de proteína total.
   2. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 18 h.
   3. Às 17 horas após a semeadura, prepare os reagentes de transfecção.
   4. Faça a solução A misturando 6,7 μg plasmid de cada pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256)(Tabela 1)em 335 μL de soro reduzido, médio e incubar à temperatura ambiente por 5 min. Adicione 6,7 μg plasmid de pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) a todas as amostras.
      NOTA: Todos os vetores estão listados na Tabela 1.
   5. Faça a solução B misturando 10,1 μL de reagentes de transfecção I e II, respectivamente em 335 μL de meio soro reduzido, e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
      NOTA: Um passo opcional é adicionar apenas 40,2 μL reagente de transfecção III (polietileneimina [PEI]; 1,0 mg/mL) na solução B ou adicionar 40,2 μL reagente de transfecção III, além dos reagentes de transfecção I e II na solução B(Tabela de Materiais).
   6. Misture as soluções A e B juntas, e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
   7. Depois de lavar as células cultivadas uma vez com PBS, adicione a mistura de soluções A e B (ou seja, complexo DNA-lipídicos) diretamente a cada um dos 10 cm individuais de cultura tecidual que tem 3,35 mL μL meio de soro reduzido.
      NOTA: A concentração final é de 1,67 μg/mL de plasmídeo.
   8. Incubar as células a 37 °C incubadora com 5% de CO₂ para 4,5 h. Após 4,5 h, mude o DMEM médio para alto glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina.
   9. Cultura as células a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 h após a transfecção. Coletar células para a preparação de lises celulares.
2. Preparação de proteínaS A contas ligadas com anticorpo anti-GFP.
   1. Tome 25 μL (50% v/v) de contas de proteína A para uma reação de imunoprecipitação (IP). Lave com tampão A1(Tabela de Materiais) pelo menos 3x para remover o EtOH, e fazer solução de 50% com tampão A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% desoxicolato; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; inibidor completo de protease livre de EDTA).
   2. Adicione 2,0 μL de anticorpo anti-GFP (Anticorpo nº 76: anticorpo caseiro) às contas preparadas acima e adicione 10x de volume de tampão A1 comparando com o volume líquido de contas.
   3. Realize a rotação de ponta a ponta a 4 °C para 4-18 h. O período de tempo ideal para rotação de ponta a ponta deve ser determinado empiricamente com base na eficiência da imunoprecipitação.
   4. Centrifugar as contas a 100 x g por 1 min e remover o supernatante desvinculado. Adicione o buffer A1 para refazer uma solução de 50% (v/v) das contas. Use 25 μL (50% v/v) desta solução para uma reação de IP.
3. Imunoprecipitação (IP) utilizando proteínaS A contas de sepharose ligadas com anticorpo anti-GFP.
   1. Células de lise obtidas na etapa 5.1.9 no buffer A1 por sônica e processo de congelamento.
   2. Medir concentrações proteicas e normalizar quantidades de proteínas entre diferentes amostras de IP. Remova 5% da amostra de cada tubo para funcionar como amostra de entrada de 5% em SDS-PAGE.
      NOTA: A amostra de entrada de 5% pode ser congelada em nitrogênio líquido e estocada a -80 °C, se não for carregada dentro de um dia.
   3. Misture o resto de 95% de lise com 25 μL (50% v/v) de proteína A contas ligadas ao anticorpo anti-GFP que foi preparado na etapa 5.2. Realize a rotação de ponta a ponta a 4 °C para 4-18 h.
      NOTA: O período de tempo ideal para rotação de ponta a ponta deve ser determinado empiricamente.
   4. Proteína centrífuga Uma contas com a proteína ligada a ela (ou seja, imunoprecipitatos) com 100 x g por 1 min, e remover o sobrenante. Lave os imunoprecipitatos com tampão A1 por centrifugação a 100 x g por 1 min. Realize esta etapa 4x.
   5. Misture o buffer de carga 5% e o restante de 95% de imunoprecipitatos com 2x e 4x SDS-PAGE buffer de carregamento¹⁴, respectivamente. Ferva essas duas amostras por 5 minutos e depois carregue-as em um gel de poliacrilamida SDS desnaturação de 10,0% para eletroforese em diferentes pistas. Use gel SDS-PAGE maior (por exemplo, 17 cm x 15 cm) para eletroforese. Se as amostras forem executadas em gel menor, pode não ser possível observar faixas de ubiquização claras/afiadas.
   6. Realize a análise da mancha ocidental conforme descrito na seção 4 utilizando os anticorpos indicados no relatório anterior⁸. O resultado é mostrado na Figura 2A.
   7. Use tampão de despojo de manchas ocidentais para retirar os anticorpos pré-incubados da membrana PVDF e reblotá-lo com diferentes anticorpos para a próxima rodada de análise de manchas ocidentais.

6. Espectrometria de massa para identificar o local de ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R

1. Transfecção para análise de espectrometria de massa usando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
   1. Sementes CENP-A^-/F RPE-1 células em um prato de cultura tecidual de 10 cm. Verifique se a densidade celular é de 36,2 x 10⁵ células por prato. Células de cultura em DMEM de alta glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Prepare pelo menos 20 pratos para uma amostra de imunoprecipitação (IP), para obter pelo menos 10 mg de proteína total (ver 5,3).
      NOTA: Para obter resultados ideais, determine empiricamente a densidade celular para usar na semeadura.
   2. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ para 18 h. Prepare os reagentes de transfecção ~ 23 h após a propagação (24h ponto é 0 h ponto da transfecção).
   3. Às 17 horas após a semeadura, prepare os reagentes de transfecção e as células transfeiturais como (4.1.3). As células transfeinadas têm pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) e pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
   4. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 48 h após a transfecção. Coletar células para lises celulares.
   5. As células de lise no buffer A1 e realizam imunoprecipitação como (5.2) e (5.3). Executar esses dois de imunoprecipitação lysates como seguinte (6.1.6) e (6.1.7).
      NOTA: Em (6.1.6), execute a amostra em géis tris-glicina padrão. Em (6.1.7), execute a amostra nos géis proteicos Bis-Tris disponíveis comercialmente 4%-12%. Veja também Discussão.
   6. Mantenha uma amostra para 10% do total de imunoprecipitantes para confirmar a ubiquização EYFP-CENP-A e determinar precisamente a posição do EYFP-CENP-Aubiquitinado, conforme descrito na seção 5. Execute esta amostra em géis tris-glicina padrão. SDS-PAGE e mancha ocidental foram realizadas como (5.3).
   7. Mantenha outra amostra para 90% do total de imunoprecipitantes para análise de espectrometria de massa. Execute esta amostra dentro de dois poços dos géis proteicos Bis-Tris disponíveis comercialmente. Execute a coloração azul Coomassie usando a solução azul Coomassie. Extirpa e corte a região do gel de 50-70 kDa (região putativa mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R). Use esta região de gel para análise de espectrometria de massa.
2. Análise de espectrometria de massa usando digestão em gel.
   1. Pique cada fatia de gel de interesse em pequenos pedaços (1 mm²) e coloque-a em 0,5 mL de tubos de baixa ligação proteica.
   2. Lave com acetonitrila de 100 μL 50% (v/v) em 25 mM NH₄HCO₃, vórtice 10-15 min, gire para baixo, descarte o supernasce, repita 3x.
   3. Concentre a amostra usando concentrador de vácuo de bancada por 30 minutos para secar as peças de gel.
   4. Adicione 10 μL de 10 ng/μL de trippsina de grau de sequenciamento e deixe as peças de gel se reidratar por 5 minutos.
   5. Adicione 25 mM NH₄HCO_{3 apenas} o suficiente para cobrir as peças de gel, digerir a 37 °C durante a noite.
   6. Transfira o supernatante digerido em um tubo limpo de 0,65 mL siliconizado. Adicionar 50% (v/v) acetonitrila/5% (v/v) ácido fórmico (30 μL ou suficiente para cobrir), vórtice 10 min, girar e transferir para o mesmo tubo de extração. Repita 3x.
   7. Adicione 10 μL de acetonitrila às peças de gel, vórtice 5 min e gire para baixo. Transfira o supernatante para o mesmo tubo.
   8. Concentre as amostras usando concentrador de vácuo benchtop a 2 μL, adicione 8 μL 3% (v/v) acetonitrilo /2% (v/v) ácido fórmico à amostra, vórtice por 15 minutos e gire a 16.000 x g por 30 minutos. As amostras estão prontas para análise de espectrometria de massa.
   9. Realizar a aquisição de dados de MS com a LC-MS/MS utilizando um sistema de cromatografia líquida(Tabela de Materiais)juntamente com um instrumento de espectrometria de massa(Tabela de Materiais).
   10. Injete 8 μL de amostra reconstituída em uma coluna de cromatografia líquida de fase inversa (RPLC).
   11. Separe os peptídeos com um gradiente de 2-80% de solvente B em 60 minutos. Certifique-se de que o gradiente consiste em um percentual crescente de solvente B de 2% para 22% em 40 min, 22% a 35% solvente B em 12 min, depois subindo para 80% solvente B em 4 min, e finalmente mantendo em 80% solvente B para os últimos 4 min. Defina a taxa de fluxo constante em 300 nL/min.
       NOTA: Solvente A contém ácido fórmico de 0,1% e 2% acetonitrilo, solvente B contém 0,1% de ácido fórmico e 98% acetonitrilo. Todas as concentrações são mostradas como volume/volume.
   12. Colete dados de espectrometria em massa usando o modo de aquisição dependente de dados. Brevemente, colete espectros MS em 350-1500 m/z por 250 ms. Selecione os 50 precursores intensos do Top 50 com carga 2-5 para maior fragmentação. Colete espectros MS/MS em 100-2000 m/z por 100 ms, Exclua íons precursores da reseleção para 15 s.
   13. Para pesquisa de banco de dados, abra o software comercial (ver Tabela de Materiais) para analisar dados de espectrometria de massa na área de trabalho.
   14. Para fazer uma nova pesquisa, clique no botão "LC" no menu superior. Em seguida, clique no botão "Adicionar" para carregar os arquivos de dados brutos originais do MS.
   15. Selecione "Human Protein ID" no "Método Paragon" como o método de pesquisa de banco de dados. Pesquise os arquivos originais de dados brutos do MS no banco de dados UniProt Homo Sapiens (contendo 160.566 sequências, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
   16. Definir parâmetros de pesquisa como os seguintes: selecionar trippsina como enzima de digestão, permitir até 3 decotes faltantes, 4 modificações e 2-5 cargas por peptídeo. Defina erro de massa de até 20 ppm para a primeira pesquisa e 0,02 Da para íons fragmentados. Especifique limiares de taxa de descoberta falsa (FDR) para locais de proteína, peptídeo e modificação inferiores a 1%. Defina todos os outros parâmetros do software para valores padrão (consulte Figura 3 para análise de espectrometria de massa).
   17. Clique no botão "Salvar como" à direita do menu superior, selecione uma pasta para armazenar os resultados de pesquisa, digite o nome da pesquisa e clique no botão "Salvar".
   18. Clique no botão "Process" à direita do menu superior para iniciar a pesquisa. Após o término da pesquisa, os dados com o nome de pesquisa inserido serão armazenados automaticamente na pasta selecionada. Os dados podem ser facilmente abertos pelo Software F.
   19. Para obter espectros MS/MS de qualquer peptídeo específico, clique duas vezes nos resultados de pesquisa para abri-lo pelo Software F. Primeiro, clique na proteína na lista de proteínas na parte superior do menu e clique no peptídeo no meio do menu. O MS/MS deste peptídeo é mostrado na parte inferior do menu.
   20. Para exportar e salvar os espectros MS/MS, clique com o botão direito do mouse no espectro MS/MS na parte inferior do menu, selecione copiar e, em seguida, cole-se a um arquivo adequado, como PPT ou doc.

Resultados

O mutante EYFP-CENP-A K124 mostra ubiquização, interação com HJURP, e sem defeitos na localização do centromere nem letalidade celular. Aqui o sistema relatado por Fachinetti et al. (2017)⁶ foi restituído: em células humanas diploides (RPE-1) transportando uma interrompida e uma alelo CENP-A (CENP-A^-/F),EYFP-CENP-A foi expressa do vetor retrovírus pBabe-EYFP. Neste sistema, a expressão do CENP-A endógeno do CENP-A^-/F alel...

Discussão

Aqui descrevemos métodos de análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a marcação EYFP induz a ubiquização em uma ubiquização diferente na proteína mutante CENP-A K124R⁸. Em nossos resultados, identificamos com sucesso a ubiquização na lysina 306 (K306) em EYFP-CENP-A K124R, que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. A análise de espectrometria de massa descrita aqui é ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes	Eppendorf	022431064	For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish	BIOFIL/JET, China	700224	10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6-well culture plate
CentriVap	LABCONCO	-	Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm	Eksigent Technologies	805-00120	Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE	100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS	63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope	Leica	-	motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source	Leica		External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)	Surgipath	105	Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus	Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences	31071010	Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D	Eksigent Technologies	-	liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher	NP0335BOX	The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	-	Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera	Hamamatsu	C10600-10B	CCD camera
PAP Pen	Binding Site	AD100.1	For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM	VWR	25382-166	10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size)	Junyi, China	JY-SCZ6+	Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted	VWR International	48312-013	Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody	Novus Biologicals	H00001059-B01P	Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH	ABCAM	ab37168	Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH	Invitrogen	PA1987	Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody	ANTI #76 (Homemade antibody)		Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10)	Roche	11815016001	Rat monoclonal antibody
anti-HJURP	Proteintech Group	15283–1-AP	Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin	Bethyl Laboratories	A300-317A-1	Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33996-185	Microtip for sonication
Buffer A1	-	-	20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11-873-580-001	Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250	BBI Life Sciences	CAS 6104-59-2	Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)	SigmaI-Aldrich	HT90132-1L	For colony staining
DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	For nuclear staining
DMEM: F12 Medium	ATCC	30-2006	DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Life Technologies/Gibco	10082	FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol	Fisher	A412-4	Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)	Fisher Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)	Non-fat skim milk
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	Reduced serum media
p-phenylenediamine	SIGMA-SLDRICH	P6001	For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid	Fisher/Gibco	15-140	Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION	SIGMA-SLDRICH	P 8920	Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml	Polysciences	23966–2	Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads	GE Healthcare/Amersham	17-0963-03	Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	PI21059	Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo	34095	Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)	-	-	Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software	Olympus	-	Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software	Olympus	-	Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18	Olympus	-	Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0	LI-COR Biosciences	-	Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System	Bio-Rad	-	Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System	LI-COR Biosciences	-	Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware	-	-	For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software	Improvision/PerkinElmer	-	Software A
ProteinPilot Software version 4.5	AB SCIEX	-	Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software	Bio-Rad	-	Software E
TripleTOF 5600+ System	AB SCIEX	-	Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)	PerkinElmer	-	Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)	PerkinElmer	-	Software B2