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Resumen

La ubicuidad CENP-A es un requisito importante para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de la dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular. Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP.

Resumen

El estudio de la estructura y la dinámica de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. La forma en que se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y participan en la segregación cromosómica precisa es una cuestión fundamental. Se propone que CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere, y se requiere la ubicuación CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular.

Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que la ubicuidad en una lisina diferente se induce debido al etiquetado EYFP en la proteína mutante CENP-A K124R. Se identificó con éxito la ubiquilación de lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en el ANálisis de espectrometría de masas CENP-A. Una advertencia se discute en el uso de GFP/EYFP o el etiquetado de proteína de alto peso molecular como herramienta para analizar la función de una proteína. También se discute el límite técnico actual para la detección de bandas ubiquitidas, la identificación de la ubiculación específica del sitio y la visualización de la ubicuidad en células vivas o una sola célula específica durante todo el ciclo celular.

El método de análisis de espectrometría de masas presentado aquí se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes etiquetas y otras proteínas centromere-kinetochore. Estos métodos combinatorios que consisten en varios ensayos/análisis podrían recomendarse a los investigadores que estén interesados en identificar funciones funcionales de ubiculación.

Introducción

En la mayoría de los eucariotas, los microtúbulos del husillo deben adherirse a una sola región de cada cromosoma, llamado centromere. El kinetochore es un complejo de proteínas que se encuentran en el centromere. Estudiar el momento de los movimientos de la proteína centromere y kinetochore y la estructura de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. Las preguntas clave son cómo se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y cómo participan en la segregación cromosómica precisa. En la mayoría de las especies, la presencia de un nucleosoma especial que contiene una proteína específica similar a la histona llamada CENP-A define la identidad centromere. Por lo tanto, se propone que el CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere. Es importante dilucidar el mecanismo de cómo CENP-A define la identidad centromere en los seres humanos.

La proteína de reconocimiento de unión Holliday (HJURP) es el chaperon específico de CENP-A que deposita CENP-A en nucleosomas centroméricos1,,2,,3. Hemos informado previamente que la ligasa CUL4A-RBX1-COPS8 E3 es necesaria para la ubiculación CENP-A en la lisina 124 (K124) y la localización de centromere4. Además, nuestros resultados mostraron que el reclutamiento de centromere de CENP-A recién sintetizado requiere una ubicuidad preexistente CENP-A5. Por lo tanto, se proporcionó un modelo que sugiere que la ubicuidad CENP-A se hereda a través de la dimerización entre divisiones celulares.

En contraste con nuestros hallazgos y los de Yu et al., los resultados negativos sobre el CENP-A y su localización centromérica se publicaron recientemente6. El artículo afirmaba que las modificaciones CENP-A en la lisina 124 (K124) son prescindibles para el establecimiento, mantenimiento y función a largo plazo de los centromeres humanos, basándose en sus resultados negativos que demuestran que la mutación de K124R no afectó a la localización del centromere CENP-A ni la viabilidad celular6. Sin embargo, hay suficiente margen para el debate en sus resultados y conclusiones, y ya hemos descrito qué problema podría haber en su publicación anterior7. Se debe prestar atención a que fusionaron proteínas con CENP-A, que tienen pesos moleculares mucho mayores que el tamaño de CENP-A endógeno: por ejemplo, fusionaron la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) de 30 kDa a 16 kDa CENP-A y analizaron la proteína de fusión EYFP-CENP-A K124R en su sistema RPE-1 CENP-A-/F knockout. No se espera que la ubiquitina K124 se una directamente al HJURP sobre la base de las predicciones estructurales4,sin embargo, se prevé que la adición de monoubiquitina tenga un impacto en la conformación proteica de CENP-A. La proteína de la conformación CENP-A puede ser cambiada por la presencia de una gran proteína de fusión, y este cambio conformacional puede enmascarar los cambios estructurales causados por la pérdida de ubiculación. Sugerimos que la fusión de proteína de gran tamaño induce la ubiculación a una lisina distinta de la K124 en el mutante EYFP-CENP-A K124R y esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único original K124R. La evidencia de que la ubicuidad ocurre en diferentes lisina en la proteína mutante CENP-A K124R con una proteína de etiqueta grande (EYFP) fue reportada en nuestra publicación anterior8. Se encontró que el etiquetado EYFP induce la ubiquitinación de otro sitio de lisina de EYFP-CENP-A K124R y que el mutante EYFP-CENP-A K124R se une a HJURP. Como resultado, esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único K124R original, y tanto los mutantes EYFP-CENP-A WT como K124R mostraron localización de centromere (usamos y comparamos pBabe-EYFP-CENP-A WT y mutante K124R, junto con el control pBabe-EYFP.). Los resultados demostraron que los mutantes CENP-A K124R con etiqueta de bandera o sin etiquetar son letales, pero pueden ser rescatados por una fusión monoubiquitina, lo que sugiere que la ubicuidad CENP-A es indispensable para la viabilidad celular.

En los últimos años, muchos estudios han desarrollado diferentes ensayos para identificar las modificaciones posttranslacionales (PTM) de la proteína CENP-A y otras proteínas centromere-kinetochore tanto in vivo como in vitro9,,10,,11. Análogos a los PTM de las proteínas histonas que son un mecanismo importante que regula la función de la cromatina, los PTM de los componentes centroméricos de cromatina también participan en un mecanismo esencial para regular la estructura general y la función de los centromeros. La mayoría de los sitios CENP-A PTM son específicos de los nucleosomas que contienen CENP-A, aunque algunos de ellos se conservan en la histona H3, lo que sugiere que la modificación de estos residuos contribuye a la función específica del centromere. Las PTM de CENP-A, incluyendo la fosforilación, la acetilación, la metilación y la ubicuidad, se notificaron previamente9, lo que sugiere que CENP-A está sujeta a una variedad de TPM y sus matrices combinatorias en su dominio amino terminus y C-terminus histone-fold. La importancia de las modificaciones CENP-A en múltiples funciones fue revelada por muchos grupos, incluyendo el nuestro. Estas funciones implican la deposición CENP-A en los centromeres, la estabilidad proteica y el reclutamiento de la CCAN (red asociada al centromere constitutivo)9. Sin embargo, los estudios y hallazgos limitados de las PTM CENP-A se preforman cuando se realizan comparaciones con una de las histonas canónicas que regulan directa o indirectamente su función. Los informes técnicos centrados en la metodología para identificar estos PTM CENP-A también son limitados.

Debido a que se requiere la ubicuidad CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere12,heredada a través de la dimerización entre la división celular5,e indispensable para la viabilidad celular8, el método para identificar la ubiculación CENP-A sería esencial en el futuro para estudiar la actividad funcional, el posicionamiento y la estructura del centromere. Por lo tanto, aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. También se presentan protocolos de otros ensayos y análisis de control (análisis de inmunofluorescencia, ensayo de crecimiento de colonias y ensayo de ubicuidad in vivo) para discutir el resultado del análisis de espectrometría de masas importante correctamente.

Protocolo

1. Cultivo celular y transfección de retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: EYFP-CENP-A se expresa desde pBabe-EYFP-CENP-A a un nivel de proteína similar al CENP-A endógeno. La proteína CENP-A celular total se sustituye por esta EYFP-CENP-A después de la interrupción del alelo CENP-A-/F por Cre recombinase como en las células RPE-1 CENP-A-/-6.

  1. Preparación del sobrenadante que contiene retrovirus utilizando células de envasado 293T.
    1. Día 0: Extienda las celdas de embalaje 293T en la placa de cultivo de 6 pozos (1,0 x 106 celdas/pozo). Células de cultivo en DMEM de alta glucosa con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina. Incubar las células a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 24 h.
      NOTA: Para obtener resultados óptimos, determine empíricamente la densidad de celdas que se utilizará en la siembra.
    2. Día 1: Preparar la reacción de transfección alrededor de 23 h después de la propagación (punto 24 h es 0 h punto de la transfección). Plásmido de expresión transfecto de cada pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) y pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (véase el Cuadro 1).
    3. Elija una combinación de plásmidos auxiliares/envasados enumerados en la Tabla 2 y agréguelos a los tubos que contengan uno de los plásmidos mencionados anteriormente. En su mayoría existen estas 3 combinaciones para plásmidos auxiliares/envasados(Tabla 2). Cualquier combinación funcionó en estos experimentos y mostró una eficiencia de transfección similar.
    4. Preparar 50 l de medio sérico reducido y mezclar 2,0 g de cada pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) y pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (véase el Cuadro 1) añadiendo una combinación de plásmidos auxiliares/envasados enumerados en el Cuadro 2 (véase más adelante). Incubar esta mezcla a temperatura ambiente durante 5 min. Esta mezcla es la solución A.
    5. Preparar otros 50 l de medio sérico reducido y mezclar 1,5 ml de reactivos de transfección I y II, respectivamente (Tabla de materiales). Incubar esta mezcla a temperatura ambiente durante 5 min. Esta mezcla es la solución B.
      NOTA: Opcionalmente, añada sólo 6,0 ml de reactivo de transfección III (polietilenimina [PEI]; 1,0 mg/ml) en la solución B o añada 6,0 ml de reactivo de transfección III además de los reactivos de transfección I y II en la solución B(Tabla de materiales).
    6. Mezclar las soluciones A y B juntas, e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    7. Después de lavar las células cultivadas una vez con PBS, agregue la mezcla de las soluciones A y B (es decir, el complejo DNA-lipid) directamente a cada pocóculo de la placa de cultivo de 6 pocillos que tiene un medio sérico reducido de 500 l. La concentración final del plásmido es de 3,3 g/ml.
    8. Después de incubar las células a 37oC en una atmósfera de 5% co de CO2 durante 4,5 h, cambie el DMEM de media a alta glucosa con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Poner 2 ml/pozo de medio de cultivo después del cambio medio en la placa de cultivo de 6 pozos.
    9. Cultivar las células a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 48 h después de la transfección. Realizar la infección por retrovirus el día 3 utilizando el sobrenadante que contiene retrovirus.
  2. Infección por retrovirus de las células dianaCENP-A -/F RPE-1.
    1. Día 2: Un día antes de la infección, propagar las células diana CENP-A-/F RPE-1 para transfecar en el pozo de cultivo de 6 pozos (2.25 x 105 células/pozo). Células de cultivo en DMEM: F12 medio(Tabla de Materiales)con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
      NOTA: Extienda las células para ensayos de crecimiento de colonias, inmunofluorescencia y análisis de manchas occidentales como control. Para obtener resultados óptimos, determina empíricamente la densidad celular que se utilizará en la siembra.
    2. Día 3 (día de infección del virus): A las 48 h después de la transfección de las células de embalaje 293T, recoja el virus que contiene el sobrenadante y filtre a través del filtro de 0,45 m (no utilice un filtro de 0,2 m que cizallará el sobre del virus). Se recomienda utilizar filtros de poliédersulfona (PES).
    3. Infectar células CENP-A-/F RPE-1 con el virus. Para un pozo de la placa de cultivo de 6 pocillos, agregue 1 mL de medios frescos, 1 sobrenadante del virus mL y polibrena a una concentración final de 8 g/ml. Incubar las células CENP-A-/F RPE-1 a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 4 días hasta el día 7 después de la transfección.
      NOTA: El período de incubación para el crecimiento celularCENP-A -/F RPE-1 debe determinarse empíricamente siguiendo los análisis para obtener resultados óptimos.

2. Análisis de inmunofluorescencia de células que contienen pBabe-EYFP-CENP-A

  1. Día 7: 4 días después de la infección por retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A, eliminar el medio de cultivo por aspiración. Enjuagar las células una vez con TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl). Aplique TBS en el lado de los pozos de cultivo para evitar perturbar la superficie de las células.
    NOTA: El punto de tiempo óptimo para la fijación de celdas debe determinarse empíricamente. Las señales de inmunofluorescencia de las construcciones EYFP-CENP-A WT y K124R son detectables en el centromere al menos 4 días después de la infección por retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A incluso sin infección de Cre (datos no mostrados, Figura 1C-E para los datos con infección de Cre).
  2. Realizar la fijación de la célula de metanol y la tinción de inmunofluorescencia como se describió anteriormente13.
  3. Como anticuerpos primarios utilizan un anticuerpo anti-GFP (1:1.000 dilución) y un anticuerpo anti-CENP-B (relación de dilución de 1:200) para un marcador de ubicación de centromere en TBS que contiene 4% de suero de cabra (ver Tabla de materiales para los anticuerpos utilizados).
  4. Retire el exceso de medio de montaje con una toalla de papel y selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas en el último paso.
  5. Consulte el método13 descrito anteriormente para la observación de la imagen de inmunofluorescencia, adquisición, cuantificación y análisis de las señales restantes de EYFP-CENP-A en el centromere.
  6. Realice la adquisición de imágenes, el procesamiento, incluida la desconvolución, la cuantificación y el análisis mediante softwares A o softwares B1 y B2 (consulte Tabla de materiales). Opcionalmente, utilice los softwares C1-C3 (ver Tabla de materiales)para un microscopio de escaneo láser confocal.
    NOTA: Consulte 2.6.1 en Archivos de codificación suplementarios para todos los comandos utilizados en el software A. Consulte 2.6.2 en Archivos de codificación suplementarios para todos los comandos utilizados en los softwares B1 y B2.

3. Ensayos de crecimiento de colonias utilizando pBabe-EYFP-CENP-A después de la infección por el virus retro-Cre

NOTA: La razón para realizar este ensayo es comparar la viabilidad celular entre EYFP-CENP-A WT y K124R mutante después de la interrupción del alelo CENP-A-/F por Cre recombinase (después de la sustitución de la proteína celular total CENP-A).

  1. Transfección de retrovirus de construcciones pBabe-EYFP-CENP-A.
    1. Realice la transfección de retrovirus de las células CENP-A-/F RPE-1 como se describe en la sección 1. Células de cultivo en DMEM: F12 medio con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina durante 72 h después de la infección por el virus.
    2. Tres días después de la infección por retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A (el día 6), agregue blasticidin S (10 g/ml) en pozos que contengan células trans infectadas que se utilizarán para ensayos de crecimiento de colonias y experimentos de control. Las células se cultivan al menos 14 días después de la infección por virus en presencia de blasticidina S. Cambiar el medio que contiene blasticidina S cada 5 días.
      NOTA: Si las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia antes de la siembra para el ensayo de colonia (3.2.7. y 3.2.8), asegue las células a la proporción 1:2 y 1:5 por trippsinización y chapado en una placa de cultivo de 6 pozos.
    3. Recoger células para la mancha occidental en el día 7 para confirmar la expresión proteica de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A sin infección de Cre. Realice el análisis de manchas occidentales como se describe en la sección 4. Los resultados se muestran en la Figura 1B (carriles 1-4).
    4. Para el ensayo de crecimiento de colonias con infección por el virus Cre, mantenga las células creciendo durante 14 días después de la infección por el virus en presencia de blasticidina S (es decir, células de crecimiento en blasticidina S que contiene medio hasta el día 17 para los resultados presentados aquí).
  2. Infección por el virus Retro-Cre de pBabe-puro-Cre
    NOTA: El día 0 en el paso 3.2.1 corresponde al día 13 de la sección 3.1.
    1. Día 0 al Día 3: Realizar la transfección de retrovirus de las células CENP-A-/F RPE-1 utilizando pBabe-puro-Cre (B3027) como plásmido de expresión (ver sección 1 para más detalles). Asegúrese de que blasticidin S (10 g/ml) se añade en el medio de cultivo.
    2. Día 4: Pruebe las células para separarlas de la placa. Placa 500 o 5.000 células en triplicado en la placa de cultivo de 6 pozos. Células de cultivo en DMEM: F12 medio con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
    3. Día 5: Añadir blasticidina S (10 g/ml) al medio de cultivo. Durante 5.000 o 500 células' de chapado, seleccione celdas con blasticidina S (10 g/ml) 3-24 días (hasta el día 14 en [3.2.7]) o 3-28 días (hasta el día 18 en [3.2.8]) después de la infección por virus de construcciones (pBabe-EYFP-CENP-A construct).
      NOTA: En este ensayo de crecimiento de colonia, se añade la transfección de pBabe-puro-Cre junto con la transfección de pBabe-EYFP-CENP-A. La transfección de pBabe-EYFP-CENP-A se realiza en 3.1. La transfección de pBabe-puro-Cre se realiza en 3.2.1.
    4. Día 10 (7 días después de la infección por el virus retro-Cre): Recoger células para el análisis de hinchazón occidental para confirmar el agotamiento de proteínas de CENP-A endógeno después de la infección por el virus retro-Cre y/o la expresión proteica de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A en el mismo día 10.
    5. Realice la hinchazón occidental como se describe en la sección 4 en el mismo día 10. Los resultados se muestran en la Figura 1B (carriles 5-7).
    6. Realizar análisis de inmunofluorescencia (sección 2 anterior) para confirmar que EYFP-CENP-A WT y K124R localizados al centromere 7 días después de la inactivación del alelo CENP-A endógeno restante. Los resultados se muestran en la Figura 1C-1E.
    7. Día 14: Realizar el ensayo de crecimiento de la colonia con la placa sembrada con 5.000 células. Fijar células durante 10 minutos en metanol y manchar durante 10 minutos en una solución violeta cristalina (2,3% violeta cristalino, 0,1% oxalato de amonio, 20% etanol (ver Figura 2B). Cuente el número de colonias utilizando el software OpenCFU (consulte la figura 2C).
    8. Día 18: Utilice la placa sembrada con 500 células. Corrija y manche las celdas como se describe en el paso 3.2.7 (consulte la figura 2B). Cuente el número de colonias (véase la figura 2C).

4. Análisis de manchas occidentales utilizando pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: Consulte el método13 descrito anteriormente para el análisis de manchas occidentales utilizando anticuerpos indicados en la Figura 1B y la Figura 2A y tabla de materiales para proteínas EYFP-CENP-A.

  1. Aísle las proteínas mediante el análisis de las células cultivadas con diferentes infecciones por el virus. A continuación, utilice 20 g de proteína en un recipiente de GEL SDS PAGE. Transfiera las proteínas a una membrana PVDF como se describió anteriormente13.
  2. Lavar la membrana 3x después de las incubaciones con anticuerpos primario-secundarios. Detectar y analizar las bandas de proteínas en la membrana con el sistema de imágenes infrarrojas y/o el generador de imágenes quimiuminescencia para la detección de inmunoblots. Estos resultados se muestran en la Figura 1B y la Figura 2A.
    1. Para que el sistema de imágenes infrarrojas detecte y analice las bandas de proteínas, consulte el paso 4.2.1 en Archivos de codificación suplementarios.
    2. Utilice el imager de quimiuminescencia para detectar y analizar las bandas de proteínas, consulte el paso 4.2.2 en Archivos de codificación suplementarios. Para este sistema, utilice un sustrato quimioilumíncent (ECL) mejorado ultrasensible(Tabla de Materiales).
    3. Opcionalmente, utilice el tampón de desmontaje de manchas occidentales para eliminar los anticuerpos pre-incubados de la membrana PVDF y reblot con diferentes anticuerpos para el siguiente giro del análisis occidental. Determinar empíricamente el tiempo de incubación optimizado y la temperatura a utilizar.

5. Cultivo celular, transfección y ensayos de ubicuidad in vivo utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A

NOTA: El nivel proteico de EYFP-CENP-A expresado a partir del vector pQCXIP es 10 veces mayor que el nivel de proteína CENP-A endógeno. El uso de este vector facilita la inmunoprecipitación de una mayor cantidad de proteínas EYFP-CENP-A, la observación de las bandas de ubicuilación de la proteína EYFP-CENP-A, y la identificación de la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP a través del análisis de espectrometría de masas.

  1. Transfección para ensayos de ubicuidad in vivo utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Semilla 36,2 x 105 células CENP-A-/F RPE-1 en un plato de cultivo de tejido de 10 cm. Células de cultivo en DMEM de alta glucosa con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
      NOTA: Para obtener resultados óptimos, determine empíricamente la densidad celular que se utilizará en la siembra. Preparar al menos 2 platos para una muestra de inmunoprecipitación (IP) para obtener un mínimo de 1 mg de proteína total.
    2. Incubar las células a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 18 h.
    3. A las 17 h después de la siembra, prepare los reactivos de transfección.
    4. Haga la solución A mezclando 6,7 g de plásmido de cada pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Tabla 1) en 335 l de medio suero reducido, y incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 6,7 g de plásmido de pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) a todas las muestras.
      NOTA: Todos los vectores se enumeran en la Tabla 1.
    5. Haga la solución B mezclando 10,1 ml de los reactivos de transfección I y II, respectivamente, en un medio sérico reducido de 335 l, e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
      NOTA: Un paso opcional consiste en añadir sólo un reactivo de transfección de 40,2 l III (polietilenimina [PEI]; 1,0 mg/ml) en la solución B o añadir un reactivo de transfección III de 40,2 l además de los reactivos de transfección I y II en la solución B(Tabla de materiales).
    6. Mezclar las soluciones A y B juntas, e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    7. Después de lavar las células cultivadas una vez con PBS, agregue la mezcla de las soluciones A y B (es decir, el complejo DNA-lipid) directamente a cada uno de los 10 cm individuales de la placa de cultivo de tejido que tiene 3,35 ml de medio sérico reducido.
      NOTA: La concentración final es de 1,67 g/ml de plásmido.
    8. Incubar las células a 37oC con 5% deCO2 durante 4,5 h. Después de 4.5 h, cambiar el DMEM de media a alta glucosa con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
    9. Cultivo de las células a 37 oC con 5% deCO2 durante 48 h después de la transfección. Recoger las células para la preparación de los lysates celulares.
  2. Preparación de las cuentas de proteína A unidas con anticuerpos anti-GFP.
    1. Tomar 25 l (50% v/v) de las cuentas de proteína A para una reacción de inmunoprecipitación (IP). Lavar con tampón A1 (Tabla de Materiales) al menos 3x para eliminar EtOH, y hacer una solución del 50% con buffer A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% desoxicolato; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; reagente de inhibidor de proteasa completo libre de EDTA).
    2. Añadir 2,0 l de anticuerpo anti-GFP (Anti-76: Anticuerpo casero) a las cuentas preparadas anteriormente y añadir un volumen de 10x de buffer A1 en comparación con el volumen de perlas netas.
    3. Realice la rotación de extremo a extremo a 4 oC durante 4-18 h. La longitud de tiempo óptima para la rotación de extremo a extremo debe determinarse empíricamente en función de la eficiencia de la inmunoprecipitación.
    4. Centrifugar las perlas a 100 x g durante 1 min y retire el sobrenadante sin ataduras. Agregue el búfer A1 para volver a crear una solución del 50% (v/v) de los cordones. Utilice 25 l (50% v/v) de esta solución para una reacción de IP.
  3. Inmunoprecipitación (IP) utilizando perlas de sepharose de proteína A unidas con anticuerpos anti-GFP.
    1. Células de lyse obtenidas en el paso 5.1.9 en el buffer A1 por sonicación y proceso de congelación y descongelación.
    2. Mida las concentraciones de proteínas y normalice las cantidades de proteínas entre las diferentes muestras de IP. Retire el 5% de la muestra de cada tubo para que se ejecute como muestra de entrada del 5% en SDS-PAGE.
      NOTA: La muestra de entrada del 5% se puede congelar en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 oC, si no se carga en un día.
    3. Mezclar el resto del 95% de izado con 25 ml (50% v/v) de las cuentas de proteína A unidas a anticuerpos anti-GFP que se prepararon en el paso 5.2. Realice la rotación de extremo a extremo a 4 oC durante 4-18 h.
      NOTA: La longitud de tiempo óptima para la rotación de extremo a extremo debe determinarse empíricamente.
    4. Proteína centrífuga A cuentas con la proteína unida a ella (es decir, inmunoprecipitaciones) con 100 x g durante 1 min, y eliminar el sobrenadante. Lavar los inmunoprecipitados con tampón A1 centrifugando a 100 x g durante 1 min. Realice este paso 4x.
    5. Mezclar el 5% de entrada y el resto de 95% inmunoprecipitados con 2x y 4x SDS-PAGE buffer de carga14, respectivamente. Hervir estas dos muestras durante 5 minutos y luego cargarlas en un gel SDS-poliacrilamida desnaturalidad del 10,0% para electroforesis en diferentes carriles. Utilice gel SDS-PAGE más grande (por ejemplo, 17 cm x 15 cm) para la electroforesis. Si las muestras se ejecutan en gel más pequeño, es posible que no sea posible observar bandas de ubicuidad claras/nítidas.
    6. Realizar análisis de manchas occidentales como se describe en la sección 4 utilizando los anticuerpos indicados en el informe anterior8. El resultado se muestra en la Figura 2A.
    7. Utilice el tampón de desmontaje de manchas occidentales para eliminar los anticuerpos pre-incubados de la membrana PVDF y reblot con diferentes anticuerpos para la siguiente ronda de análisis de manchas occidentales.

6. Espectrometría de masas para identificar el sitio de ubicuidad del mutante EYFP-CENP-A K124R

  1. Transfección para el análisis de espectrometría de masas utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Semilla CENP-A-/F células RPE-1 en una placa de cultivo de tejido de 10 cm. Compruebe que la densidad celular es de 36,2 x 105 celdas por plato. Células de cultivo en DMEM de alta glucosa con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina. Preparar al menos 20 platos para una muestra de inmunoprecipitación (IP) para obtener al menos 10 mg de proteína total (ver 5.3).
      NOTA: Para obtener resultados óptimos, determine empíricamente la densidad de celdas que se utilizará en la siembra.
    2. Incubar las células a 37oC en una atmósfera del 5% de CO2 durante 18 h. Preparar los reactivos de transfección a 23 h después de la propagación (punto de 24 h es 0 h punto de la transfección).
    3. A las 17 h después de la siembra, prepare los reactivos de transfección y las células transfectas como (4.1.3). Las células trans infectadas tienen pCGN-HA-Ubiquitina (B2806) y pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Incubar las células a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 48 h después de la transfección. Recoger celdas para los lysates celulares.
    5. Lyse cells in buffer A1 and perform immunoprecipitation as (5.2) and (5.3). Ejecute estos dos de los lysatos de inmunoprecipitación como sigue (6.1.6) y (6.1.7).
      NOTA: En (6.1.6), ejecute la muestra en geles estándar de trisglicina. En (6.1.7), ejecute la muestra en los geles proteicos Bis-Tris disponibles comercialmente 4%-12%. Véase también Discusión.
    6. Conservar una muestra del 10% del total de inmunoprecipitantes para confirmar la ubicuidad EYFP-CENP-A y determinar con precisión la posición de EYFP-CENP-A ubiquitinado como se describe en la sección 5. Ejecute esta muestra en geles estándar de trislicecina. SDS-PAGE y western blot se realizaron como (5.3).
    7. Conservar otra muestra para el 90% del total de inmunoprecipitantes para el análisis de espectrometría de masas. Ejecute esta muestra dentro de dos pozos de los geles proteicos Bis-Tris disponibles comercialmente 4%-12%. Realice la tinción azul de Coomassie con la solución azul Coomassie. Consumo y corte la región de gel de 50-70 kDa (región putativa mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R). Utilice esta región de gel para el análisis de espectrometría de masas.
  2. Análisis de espectrometría de masas utilizando digestión en gel.
    1. En dados cada rebanada de gel de interés en trozos pequeños (1 mm2) y colóquelo en 0,5 ml de tubos de baja unión proteica.
    2. Lavar con acetonitrilo de 100 l 50% (v/v) en 25 mM NH4HCO3, vórtice 10-15 min, girar hacia abajo, desechar el sobrenadante, repetir 3x.
    3. Concentrar la muestra utilizando el concentrador de vacío de sobremesa durante 30 minutos para secar las piezas de gel.
    4. Añadir 10 l de 10 ng/l de grado de secuenciación de la trippsina y dejar que las piezas de gel se rehidraten durante 5 min.
    5. Añadir 25 mM NH4HCO3 lo suficiente para cubrir las piezas de gel, digerir a 37 oC durante la noche.
    6. Transfiera el sobrenadante digerido en un tubo limpio de 0,65 ml siliconizado. Añadir 50% (v/v) acetonitrilo/5% (v/v) ácido fórmico (30 oL suficiente para cubrir), vórtice 10 min, girar y transferir en el mismo tubo de extracción. Repita 3x.
    7. Añadir acetonitrilo de 10 l a las piezas de gel, vórtice 5 min, y girar hacia abajo. Transfiera el sobrenadante al mismo tubo.
    8. Concentrar las muestras utilizando el concentrador de vacío de sobremesa a 2 l, añadir 8 l 3% (v/v) acetonitrilo /2% (v/v) ácido fórmico a la muestra, vórtice durante 15 minutos y girar hacia abajo a 16.000 x g durante 30 min. Las muestras están listas para el análisis de espectrometría de masas.
    9. Realizar la adquisición de datos MS con LC-MS/MS utilizando un sistema de cromatografía líquida (Tabla de materiales) junto con un instrumento de espectrometría demasas( Tabla de materiales ).
    10. Inyectar 8 ml de muestra reconstituida en una columna de cromatografía líquida en fase inversa (RPLC).
    11. Separe los péptidos con un gradiente de 2-80% del disolvente B en 60 min. Asegúrese de que el gradiente consiste en un porcentaje creciente de disolvente B del 2% al 22% en 40 min, de 22% a 35% de disolvente B en 12 min, luego subiendo al 80% del disolvente B en 4 min, y finalmente manteniendo en 80% disolvente B durante los últimos 4 min. Ajuste la constante del caudal a 300 nL/min.
      NOTA: El disolvente A contiene 0,1% de ácido fórmico y 2% de acetonitrilo, el disolvente B contiene 0,1% de ácido fórmico y 98% de acetonitrilo. Todas las concentraciones se muestran como volumen/volumen.
    12. Recopile datos de espectrometría de masas utilizando el modo de adquisición dependiente de datos. En resumen, recoja los espectros de MS en 350–1500 m/z para 250 ms. Seleccione los 50 mejores precursores intensos con carga 2-5 para una mayor fragmentación. Recoger espectros MS/MS en 100–2000 m/z para 100 ms, Excluir iones precursores de la reelección durante 15 s.
    13. Para la búsqueda de bases dedatos, abra el software comercial (consulte Tabla de materiales ) para analizar los datos de espectrometría de masas en el escritorio.
    14. Para realizar una nueva búsqueda, haga clic en el botón "LC"en el menú superior. A continuación, haga clic en el botón "Agregar" para cargar los archivos de datos sin procesar de MS originales.
    15. Seleccione "Human Protein ID" en el " MétodoParagon" como método de búsqueda de base de datos. Busque los archivos de datos sin procesar de MS originales en la base de datos UniProt Homo Sapiens (que contiene 160.566 secuencias, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Establezca los parámetros de búsqueda como los siguientes: seleccione la trippsina como la enzima de digestión, permita hasta 3 escotes faltantes, 4 modificaciones y 2-5 cargas por péptido. Establezca un error de masa de hasta 20 ppm para la primera búsqueda y 0,02 Da para iones fragmentados. Especifique umbrales de tasa de detección falsa (FDR) para sitios de proteínas, péptidos y modificaciones inferiores al 1%. Establezca todos los demás parámetros del software en valores predeterminados (consulte la figura 3 para el análisis de espectrometría de masas).
    17. Haga clic en el botón "Guardar como" a la derecha del menú superior, seleccione una carpeta para almacenar los resultados de búsqueda, introduzca el nombre de la búsqueda y haga clic en el botón "Guardar".
    18. Haga clic en el botón"Procesar"a la derecha del menú superior para iniciar la búsqueda. Una vez finalizada la búsqueda, los datos con el nombre de búsqueda introducido se almacenarán automáticamente en la carpeta seleccionada. Los datos pueden ser abiertos fácilmente por el Software F.
    19. Para obtener espectros de MS/MS de cualquier péptido específico, haga doble clic en los resultados de búsqueda para abrirlo por Software F. En primer lugar, haga clic en la proteína en la lista de proteínas en la parte superior del menú y, a continuación, haga clic en el péptido en el centro del menú. El MS/MS de este péptido se muestra en la parte inferior del menú.
    20. Para exportar y guardar espectros de MS/MS, haga clic con el botón derecho en los espectros de MS/MS en la parte inferior del menú, seleccione copiar y, a continuación, pegue en un archivo adecuado, como PPT o doc.

Resultados

El mutante EYFP-CENP-A K124 muestra ubiculación, interacción con HJURP y ningún defecto en la localización de centromere ni la letalidad celular. Aquí se re-constituyó el sistema reportado por Fachinetti et al. (2017)6: en células humanas diploides (RPE-1) que transportaban un interrumpido y un ''floxed'' CENP-A alelo (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A se expresó desde el vector retrovirus pBabe-EYFP. En este sistema, la expresión de CENP-A endógeno de...

Discusión

Aquí describimos métodos de análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. En nuestros resultados, identificamos con éxito la ubiculación en lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en CENP-A a través del análisis de espectrometría de masas. El análisis de espectrometría de masas de...

Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a Chao-Jun Li en el Model Animal Research Center de la Universidad de Nanjing por el análisis de espectrometría de masas. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa y a los investigadores actuales del Model Animal Research Center, Nanjing University y Greehey Children's Cancer Research Institute por su útil discusión, orientación experimental y reactivos. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago y Dawn S. Chandler por sus generosos dones de reactivos. Y.N. con el apoyo fue apoyado por el Fondo de Construcción de la Provincia de Jiangsu ''Doble- Primera Clase'', Fondo de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (SBK2019021248), Fondo deSeis Picos de Talento Grande de la Provincia de Jiangsu (TD-SWYY-001), Fondo "Programa de Expertos Cien Talentos" de la Provincia de Jiangsu (SBK2019010048) y National Natural Science Foundation in China (31970665). Este estudio fue apoyado en parte por la subvención NCI R21 CA205659.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubesEppendorf022431064For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dishBIOFIL/JET, China70022410 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture ClusterFisher/Corning Incorporated07-200-836-well culture plate
CentriVapLABCONCO-Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μmEksigent Technologies805-00120Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lensLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lensLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer MembraneEMD MilliporeIPVH00010For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscopeLeica-motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light sourceLeicaExternal light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)Surgipath105Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatusApogee Electrophoresis/CORE Life Sciences31071010Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2DEksigent Technologies-liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein GelsThermo FisherNP0335BOXThe commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscopeOlympus-Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD cameraHamamatsuC10600-10BCCD camera
PAP PenBinding SiteAD100.1For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CMVWR25382-16610 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size)Junyi, ChinaJY-SCZ6+Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, FrostedVWR International48312-013Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibodyStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibodyNovus BiologicalsH00001059-B01PMouse monoclonal antibody
anti-GAPDHABCAMab37168Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDHInvitrogenPA1987Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibodyANTI #76 (Homemade antibody)Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10)Roche11815016001Rat monoclonal antibody
anti-HJURPProteintech Group15283–1-APRabbit polyclonal antibody
anti-UbiquitinBethyl LaboratoriesA300-317A-1Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mmVWR Scientific Products Inc.33995-325Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mmVWR Scientific Products Inc.33996-185Microtip for sonication
Buffer A1--20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11-873-580-001Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250BBI Life SciencesCAS 6104-59-2Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)SigmaI-AldrichHT90132-1LFor colony staining
DAPISIGMA-SLDRICHD9542For nuclear staining
DMEM: F12 MediumATCC30-2006DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US originLife Technologies/Gibco10082FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000Life Technologies/InvitrogenL3000Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solutionLife Technologies/InvitrogenL3000Transfection reagent II for chemical transfection
MethanolFisherA412-4Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)Fisher ScientificNC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)Non-fat skim milk
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Reduced serum media
p-phenylenediamineSIGMA-SLDRICHP6001For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; LiquidFisher/Gibco15-140Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTIONSIGMA-SLDRICHP 8920Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/mlPolysciences23966–2Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beadsGE Healthcare/Amersham17-0963-03Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping BufferThermo ScientificPI21059Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsinPromegaV5111For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity SubstrateThermo34095Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled WaterLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)--Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11008fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW softwareOlympus-Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT softwareOlympus-Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18Olympus-Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0LI-COR Biosciences-Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 SystemBio-Rad-Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging SystemLI-COR Biosciences-Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware--For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging SoftwareImprovision/PerkinElmer-Software A
ProteinPilot Software version 4.5AB SCIEX-Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis softwareBio-Rad-Software E
TripleTOF 5600+ SystemAB SCIEX-Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)PerkinElmer-Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)PerkinElmer-Software B2

Referencias

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  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
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  16. . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)

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