Analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-A marqué par EYFP (EYFP-CENP-A)

Résumé

Le CENP-Une ubiquitylation est une exigence importante pour le dépôt de CENP-A au centromère, hérité par dimerisation entre la division cellulaire, et indispensable à la viabilité cellulaire. Ici nous décrivons l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de la protéine CENP-A (EYFP-CENP-A) marquée par EYFP.

Résumé

L’étude de la structure et de la dynamique des kinétochores et des centromères est importante pour comprendre l’instabilité chromosomique (CIN) et la progression du cancer. La façon dont l’emplacement chromosomique et la fonction d’un centromère (c.-à-d. l’identité centromère) sont déterminés et participent à une ségrégation chromosomique précise est une question fondamentale. Le CENP-A est proposé pour être l’indicateur non-ADN (marque épigénétique) de l’identité centromère, et l’ubiquité de CENP-A est exigée pour le dépôt de CENP-A au centromère, hérité par la dimérisation entre la division cellulaire, et indispensable à la viabilité cellulaire.

Ici nous décrivons l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité du mutant EYFP-CENP-A K124R suggérant que l’ubiquité à une lysine différente est induite en raison du marquage EYFP dans la protéine mutante CENP-A K124R. L’ubiquité de lysine 306 (K306) dans EYFP-CENP-A K124R a été identifiée avec succès, ce qui correspond à la lysine 56 (K56) dans le CENP-A par l’analyse de spectrométrie de masse. Une mise en garde est discutée dans l’utilisation de GFP/EYFP ou le marquage de la protéine de poids moléculaire élevé comme outil pour analyser la fonction d’une protéine. La limite technique actuelle est également discutée pour la détection des bandes ubiquitylées, l’identification de l’ubiquité(s) spécifiques au site(s), et la visualisation de l’ubiquité dans les cellules vivantes ou une cellule unique spécifique pendant tout le cycle cellulaire.

La méthode d’analyse de spectrométrie de masse présentée ici peut être appliquée à la protéine humaine CENP-A avec différentes étiquettes et autres protéines centromère-kinetocholore. Ces méthodes combinatoires consistant en plusieurs essais/analyses pourraient être recommandées pour les chercheurs qui sont intéressés à identifier les rôles fonctionnels de l’ubiquité.

Introduction

Dans la plupart des eucaryotes, les microtubules de fuseau doivent s’attacher à une seule région de chaque chromosome, appelée centromère. Le kinétochore est un complexe de protéines qui sont situées au centromère. L’étude du moment des mouvements des protéines centromères et kinétochores et de la structure des kinétochores et des centromères est importante pour comprendre l’instabilité chromosomique (CIN) et la progression du cancer. Les questions clés sont de savoir comment l’emplacement chromosomique et la fonction d’un centromère (c.-à-d. l’identité centromère) sont déterminés et comment ils participent à la ségrégation chromosomique exacte. Chez la plupart des espèces, la présence d’un nucléosome spécial contenant une protéine spécifique ressemblant à des histones appelée CENP-A définit l’identité centromère. Par conséquent, il est proposé que le CENP-A soit l’indicateur non ADN (marque épigénétique) de l’identité centromère. Il est important d’élucider le mécanisme de la façon dont le CENP-A définit l’identité centromère chez l’homme.

La protéine de reconnaissance de jonction Holliday (HJURP) est le chaperon spécifique au CENP-A qui dépose le CENP-A dans les nucléosomes centromériques^1,2,3. Nous avons déjà signalé que le CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase est nécessaire pour l’ubiquité CENP-A sur lysine 124 (K124) et la localisation centromère⁴. En outre, nos résultats ont montré que le recrutement centromère de CENP-A nouvellement synthétisé nécessite pré-existant ubiquitylated CENP-A⁵. Ainsi, un modèle a été fourni suggérant que l’ubiquité cenp-a est héritée par la dimérisation entre les divisions cellulaires.

Contrairement à nos conclusions et à celles de Yu et coll., les résultats négatifs concernant le CENP-A et sa localisation centromérique ont été publiés récemment⁶. L’article affirmait que les modifications du CENP-A sur la lysine 124 (K124) sont dispensables pour l’établissement, l’entretien et la fonction à long terme des centromères humains, sur la base de leurs résultats négatifs montrant que la mutation de K124R n’a pas affecté la localisation centromere censo⁶. Cependant, il y a suffisamment de place pour le débat dans leurs résultats et conclusions, et nous avons déjà décrit quel problème il pourrait y avoir dans leur publication précédente⁷. Il convient de noter qu’ils ont fusionné des protéines avec le CENP-A, qui ont des poids moléculaires beaucoup plus importants que la taille du CENP-A endogène : par exemple, elles ont fusionné la protéine fluorescente jaune améliorée de ~30 kDa (EYFP) à ~16 kDa CENP-A et ont analysé la protéine de fusion EYFP-CENP-A K124R dans leur système RPE-1^{CENP-A-A-KNOCK.} On ne s’attend pas à ce que l’ubiquitine de K124 se lie directement au HJURP basé sur des prédictions structurelles⁴, cependant, l’addition de mono-ubiquitine devrait avoir un impact sur la conformation de protéine de CENP-A. La protéine de la conformation CENP-A peut être modifiée par la présence d’une grande protéine de fusion, et ce changement conformationnel peut masquer les changements structurels causés par la perte de l’ubiquité. Nous suggérons que la fusion de la protéine de grande taille induit l’ubiquité à une lysine autre que K124 dans EYFP-CENP-A K124R mutant et cette ubiquitylation à un autre site inhibe / masque le phénotype mutant original K124R seul. Des preuves que l’ubiquité se produit à différentes lysine dans la protéine mutante CENP-A K124R avec une grande protéine d’étiquette (EYFP) ont été rapportées dans notre publication précédente⁸. Il a été constaté que le marquage EYFP induit l’ubiquitination d’un autre site de lysine d’EYFP-CENP-A K124R et que le mutant EYFP-CENP-A K124R se lie à HJURP. En conséquence, cette ubiquitylation à un autre site inhibe /masque le phénotype mutant unique K124R original, et les mutants EYFP-CENP-A WT et K124R ont montré la localisation centromere (nous avons utilisé et comparé pBabe-EYFP-CENP-A WT et K124R mutant, avec pBabe-EYFP contrôle.). Les résultats ont démontré que les mutants CENP-A K124R marqués par le drapeau ou non étiquetés sont mortels, mais peuvent être sauvés par une fusion de monoubiquitine, suggérant que l’ubiquité CENP-A est indispensable à la viabilité cellulaire.

Ces dernières années, de nombreuses études ont développé différents essais pour identifier les modifications posttranslationnelles (PTM) de la protéine CENP-A et d’autres protéines centromere-kinetochore à la fois in vivo et in vitro^9,10,11. Analogue aux PTM des protéines histones qui sont un mécanisme majeur régulant la fonction de la chromatine, les PTM des composants centromériques de la chromatine sont également impliqués dans un mécanisme essentiel pour réguler la structure globale et la fonction des centromères. La majorité des sites PTM du CENP-A sont spécifiques aux nucléosomes contenant du CENP-A, bien que quelques-uns d’entre eux soient conservés dans l’histone H3, ce qui suggère que la modification de ces résidus contribue à la fonction spécifique au centromémère. PTMs de CENP-A comprenant la phosphorylation, l’acétylation, la méthylation, et l’ubiquité ont été précédemment^{rapportés 9}, suggérant que CENP-A est soumis à une variété de PTM et leurs tableaux combinatoires sur son terminus aminé et le domaine de c-terminus histone-fold. L’importance des modifications du CENP-A dans de multiples fonctions a été révélée par de nombreux groupes, y compris le nôtre. Ces fonctions impliquent le dépôt de CENP-A aux centromères, la stabilité des protéines et le recrutement du CCAN (réseau constitutif associé au centromère)⁹. Cependant, des études limitées et des résultats des PTM du CENP-A sont préformés lorsque des comparaisons sont faites avec l’une des histones canoniques qui régulent directement ou indirectement leur fonction. Les rapports techniques axés sur la méthodologie permettant d’identifier ces PTM du CENP-A sont également limités.

Étant donné que la CENP-A ubiquitylation est nécessaire pour le dépôt cenp-A au centromere¹², hérité par dimérisation entre la division cellulaire⁵, et indispensable à la viabilité cellulaire⁸, la méthode d’identification de l’ubiquité CENP-A serait essentielle à l’avenir pour étudier l’activité fonctionnelle, le positionnement et la structure du centromere. Par conséquent, nous décrivons ici l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité du mutant EYFP-CENP-A K124R suggérant que le marquage EYFP induit l’ubiquité à une lysine différente dans la protéine mutante CENP-A K124R⁸. Des protocoles d’autres essais et analyses de contrôle (analyse de l’immunofluorescence, analyse de l’excroissance des colonies et test d’ubiquité in vivo) sont également présentés pour discuter correctement des résultats d’une analyse de spectrométrie de masse majeure.

Protocole

1. Culture cellulaire et transfection de rétrovirus des constructions pBabe-EYFP-CENP-A

NOTE : EYFP-CENP-A est exprimé à partir de pBabe-EYFP-CENP-A à un niveau de protéine similaire à ce CENP-A endogène. La protéine cellulaire totale CENP-A est remplacée par cette EYFP-CENP-A après la perturbation de l’allèle CENP-A-A-/F par cre recombinase comme dans RPE-1 CENP-A-/- cellules⁶.^-/F

1. Préparation du supernatant contenant du rétrovirus à l’aide de cellules d’emballage 293T.
   1. Jour 0 : Étendre les cellules d’emballage 293T sur la plaque de culture de 6 puits (1,0 x 10⁶ cellules/puits). Cellules de culture dans le DMEM à haut glucose avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO₂ pendant 24 h.
      REMARQUE : Pour obtenir des résultats optimaux, déterminer empiriquement la densité cellulaire à utiliser dans l’ensemencement.
   2. Jour 1: Préparer la réaction de transfection autour de 23 h après la propagation (24 h point est 0 point h de la transfection). Plasmide d’expression transfecte de chaque pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) et pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (voir tableau 1).
   3. Choisissez une combinaison de plasmides d’aide/emballage énumérés au tableau 2 et ajoutez-les à des tubes contenant l’un des plasmides énumérés ci-dessus. Il existe principalement ces 3 combinaisons pour les plasmides d’aide/emballage (Tableau 2). Toute combinaison a fonctionné dans ces expériences et a montré l’efficacité de transfection semblable.
   4. Préparer 50 μL de milieu sérique réduit et mélanger 2,0 μg de chaque pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) et pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (voir tableau 1) ajoutant une combinaison de plasmides d’aide/emballage énumérées au tableau 2 (voir ci-dessous). Incuber ce mélange à température ambiante pendant 5 min. Ce mélange est la solution A.
   5. Préparer un autre 50 μL de milieu sérique réduit et mélanger 1,5 μL de réactifs de transfection I et II, respectivement (Tableau des matériaux). Incuber ce mélange à température ambiante pendant 5 min. Ce mélange est la solution B.
      REMARQUE : Éventuellement, ajoutez seulement 6,0 μL de réactif III de transfection (polyéthylèneimine [PEI]; 1,0 mg/mL) dans la solution B ou ajoutez 6,0 μL de réactif de transfection III en plus des réactifs de transfection I et II dans la solution B (Tableau des matériaux).
   6. Mélanger les solutions A et B ensemble et incuber à température ambiante pendant 15 min.
   7. Après avoir lavé les cellules cultivées une fois avec PBS, ajouter le mélange des solutions A et B (c.-à-d. complexe ADN-lipide) directement à chaque puits de la plaque de culture de 6 puits qui a 500 μL milieu de sérum réduit. La concentration finale du plasmide est de 3,3 μg/mL.
   8. Après avoir incubé les cellules à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO₂ pendant 4,5 h, changez le DMEM moyen à haut glucose avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Mettre 2 mL/bien de culture moyen après le changement moyen dans la plaque de culture 6-puits.
   9. Culture des cellules à 37 °C dans une atmosphère de 5% CO₂ pour 48 h après transfection. Effectuer l’infection rétrovirus le jour 3 en utilisant le supernatant contenant le rétrovirus.
2. Infection par le rétrovirus^-/F des cellules cibles CENP-A-/F RPE-1.
   1. Jour 2 : Un jour avant l’infection, propager les cellules cibles CENP-A-/F RPE-1 pour transfecter dans le puits de culture de 6 puits (2,25 x 10⁵ cellules/puits).^-/F Cellules de culture dans DMEM: F12 moyen (Table des Matériaux) avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine.
      REMARQUE : Étendre les cellules pour les essais d’excroissance des colonies, l’immunofluorescence et l’analyse des taches occidentales comme contrôle. Pour obtenir des résultats optimaux, déterminer empiriquement la densité cellulaire à utiliser dans l’ensemencement.
   2. Jour 3 (jour d’infection du virus) : À 48 h après la transfection des cellules d’emballage 293T, recueillir le virus contenant du supernatant et filtrer à travers un filtre de 0,45 μm (n’utilisez pas un filtre de 0,2 μm qui cisaillera l’enveloppe du virus). Il est recommandé d’utiliser des filtres polyéthersulfone (PSE).
   3. Infecter les cellules^CENP-A-/F RPE-1 avec le virus. Pour un puits de la plaque de culture de 6 puits, ajoutez 1 mL de support frais, 1 mL de supernatant de virus et de polybrene à une concentration finale de 8 μg/mL. Incuber les cellules CENP-A-A/F RPE-1 à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO₂ pendant 4 jours jusqu’au jour 7 après la transfection.^-/F
      REMARQUE : La période d’incubation de^-/F la croissance cellulaire CENP-A-/F RPE-1 doit être déterminée empiriquement en suivant des analyses pour obtenir des résultats optimaux.

2. Analyse de l’immunofluorescence des cellules contenant du pBabe-EYFP-CENP-A

1. Jour 7 : 4 jours après l’infection de rétrovirus des constructions de pBabe-EYFP-CENP-A, retirez le milieu de culture par aspiration. Rincer les cellules une fois avec le SCT (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 125 mM NaCl). Appliquer le SCT sur le côté des puits de culture pour éviter de perturber la surface des cellules.
   REMARQUE : Le point de temps optimal pour la fixation cellulaire doit être déterminé empiriquement. Les signaux d’immunofluorescence des constructions EYFP-CENP-A WT et K124R sont détectables au centromère au moins 4 jours après l’infection au rétrovirus des constructions pBabe-EYFP-CENP-A, même sans infection à Cre (données non présentées, figure 1C-E pour les données avec l’infection à Cre).
2. Effectuer la fixation des cellules méthanol et la coloration de l’immunofluorescence comme décrit précédemment¹³.
3. Comme les anticorps primaires utilisent un anticorps anti-GFP (1:1 000 dilution) et un anticorps anti–CENP-B (rapport de dilution de 1:200) pour un marqueur de localisation centromère dans le SCT contenant 4% de sérum de chèvre (voir tableau des matériaux pour les anticorps utilisés).
4. Retirer l’excès de support de montage à l’aide d’un essuie-tout et sceller les bords du couvercle avec du vernis à ongles à la dernière étape.
5. Reportez-vous à la méthode¹³ précédemment décrite pour l’observation, l’acquisition, la quantification et l’analyse des signaux restants d’EYFP-CENP-A au centromère.
6. Effectuer l’acquisition d’images, le traitement, y compris la déconvolution, la quantification et l’analyse à l’aide des logiciels A ou des logiciels B1 et B2 (voir tableau des matériaux). Utilisez éventuellement les logiciels C1-C3 (voir tableau des matériaux)pour un microscope à balayage laser confocal.
   REMARQUE : Voir 2.6.1 dans Les fichiers de codage supplémentaires pour toutes les commandes utilisées dans le logiciel A. Voir 2.6.2 dans Fichiers de codage supplémentaires pour toutes les commandes utilisées dans les logiciels B1 et B2.

3. Essais de croissance de colonie utilisant pBabe-EYFP-CENP-A après l’infection rétro-Cre virus

NOTE : La raison de l’exécution de cet essai est de comparer la viabilité cellulaire entre EYFP-CENP-A^-/F WT et K124R mutant après la perturbation de l’allèle CENP-A-/F par la recombinase de Cre (après le remplacement de la protéine cellulaire totale CENP-A).

1. Transfection rétrovirus des constructions pBabe-EYFP-CENP-A.
   1. Effectuer la transfection rétrovirus des^-/F cellules CENP-A-/F RPE-1 telles que décrites à la section 1. Cellules de culture dans DMEM : Milieu de F12 avec 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine pendant 72 h après l’infection de virus.
   2. Trois jours après l’infection par le rétrovirus des constructions pBabe-EYFP-CENP-A (le jour 6), ajouter la blasticidine S (10 μg/mL) dans les puits contenant des cellules transfectées à utiliser pour l’essai d’excroissance des colonies et les expériences de contrôle. Les cellules sont cultivées au moins 14 jours après l’infection virale en présence de blasticidine S. Changer le milieu contenant blasticidin S tous les 5 jours.
      REMARQUE : Si les cellules atteignent environ 80 % de confluence avant l’ensemencement pour l’essai de colonie (3.2.7. et 3.2.8), passez les cellules à 1:2 et 1:5 par trypsinisation et placage dans une plaque de culture de 6 puits.
   3. Recueillir les cellules pour la tache occidentale le jour 7 pour confirmer l’expression protéique de pBabe-EYFP-CENP-A construit sans infection cre. Effectuer l’analyse western de tache comme décrit à la section 4. Les résultats sont indiqués à la figure 1B (voies 1-4).
   4. Pour l’analyse de l’excroissance des colonies avec l’infection par le virus Cre, gardez les cellules en croissance pendant 14 jours après l’infection virale en présence de blasticidine S (c.-à-d. développer des cellules en blasticidine S contenant moyen jusqu’au jour 17 pour les résultats présentés ici).
2. Infection par le virus Rétro-Cre de pBabe-puro-Cre
   REMARQUE : Le jour 0 de l’étape 3.2.1 correspond au jour 13 de la section 3.1.
   1. Jour 0 au jour 3 : Effectuer la transfection rétrovirus des cellules^CENP-A-A-/F RPE-1 en utilisant pBabe-puro-Cre (B3027) comme plasmide d’expression (voir la section 1 pour plus de détails). Assurez-vous que la blasticidine S (10 μg/mL) est ajoutée dans le milieu de culture.
   2. Jour 4 : Trypsiniser les cellules pour les détacher de la plaque. Plaquez 500 ou 5 000 cellules en triple dans la plaque de culture de 6 puits. Cellules de culture dans DMEM : support F12 avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine.
   3. Jour 5 : Ajouter la blasticidine S (10 μg/mL) au milieu de culture. Pour 5 000 ou 500 cellules de placage, sélectionner les cellules avec blasticidine S (10 μg/ml) 3-24 jours (jusqu’au jour 14 dans [3.2.7]) ou 3-28 jours (jusqu’au jour 18 dans [3.2.8]) après l’infection virale des constructions (pBabe-EYFP-CENP-A construit).
      NOTE : Dans ce test de excroissance de colonie, la transfection de pBabe-puro-Cre est ajoutée avec la transfection de pBabe-EYFP-CENP-A. La transfection de pBabe-EYFP-CENP-A est effectuée en 3.1. La transfection de pBabe-puro-Cre est effectuée en 3.2.1.
   4. Jour 10 (7 jours après l’infection du virus rétro-Cre): Recueillir les cellules pour l’analyse occidentale blotting pour confirmer l’épuisement des protéines de l’endogène CENP-A après l’infection du virus rétro-Cre et / ou l’expression des protéines de pBabe-EYFP-CENP-A construit le même jour 10.
   5. Effectuer le blotting occidental comme décrit dans la section 4 le même jour 10. Les résultats sont indiqués à la figure 1B (voies 5 à 7).
   6. Effectuer une analyse d’immunofluorescence (section 2 ci-dessus) pour confirmer que l’allèle CENP-A WT et K124R d’EYFP-CENP-A ont tous deux été localisés au centromere 7 jours après l’inactivation de l’allèle endogène CENP-A restant. Les résultats sont indiqués à la figure 1C-1E.
   7. Jour 14 : Effectuer l’essai d’excroissance de colonie avec la plaque ensemencée avec 5 000 cellules. Fixer les cellules pendant 10 min dans le méthanol et la tache pendant 10 min dans une solution de violette cristalline (2,3 % de violette cristalline, 0,1 % d’oxylate d’ammonium, 20 % d’éthanol (voir la figure 2B). Compter le nombre de colonies à l’aide du logiciel OpenCFU (voir figure 2C).
   8. Jour 18: Utilisez la plaque ensemencée avec 500 cellules. Fixer et tacher les cellules décrites à l’étape 3.2.7 (voir la figure 2B). Compter le nombre de colonies (voir la figure 2C).

4. Analyse occidentale de tache utilisant pBabe-EYFP-CENP-A

REMARQUE : Reportez-vous à la méthode¹³ décrite précédemment pour l’analyse des taches occidentales à l’aide d’anticorps indiqués à la figure 1B et à la figure 2A et à la table des matériaux pour les protéines EYFP-CENP-A.

1. Isoler les protéines en lysant les cellules cultivées avec différentes infections virales. Ensuite, utilisez 20 μg de protéines dans un puits de gel SDS PAGE. Transférer les protéines dans une membrane PVDF comme décrit précédemment¹³.
2. Laver la membrane 3x après les incubations avec des anticorps primaires secondaires. Détecter et analyser les bandes protéiques de la membrane à l’application du système d’imagerie infrarouge et/ou l’imageur de chemiluminescence pour la détection de l’immunoblot. Ces résultats sont indiqués à la figure 1B et à la figure 2A.
   1. Pour que le système d’imagerie infrarouge détecte et analyse les bandes protéiques, voir l’étape 4.2.1 dans les fichiers de codage supplémentaires.
   2. Utilisez l’imageur de chemiluminescence pour détecter et analyser les bandes de protéines, voir l’étape 4.2.2 dans les fichiers de codage supplémentaires. Pour ce système, utilisez un substrat chemiluminescent amélioré ultra-sensible (ECL)(Table des Matériaux).
   3. En option, utilisez le tampon de décapage de taches occidentales pour enlever les anticorps pré-incubés de la membrane PVDF et le reblot avec différents anticorps pour le prochain tour de l’analyse occidentale. Déterminer empiriquement le temps et la température d’incubation optimisés à utiliser.

5. Essais de culture cellulaire, de transfection et d’ubiquation in vivo à l’aide de pQCXIP-EYFP-CENP-A

REMARQUE : Le niveau protéique d’EYFP-CENP-A exprimé à partir du vecteur pQCXIP est de ~ 10 fois plus élevé que le niveau endogène de protéine CENP-A. L’utilisation de ce vecteur facilite l’immunoprécipitation d’une plus grande quantité de protéines EYFP-CENP-A, l’observation des bandes d’ubiquité d’EYFP-CENP-A, et l’identification de l’ubiquité de la protéine CENP-A (EYP-CENP-A) marquée par l’EYFP par l’analyse de spectrométrie de masse.

1. Transfection pour les tests d’ubiquité in vivo à l’aide de pQCXIP-EYFP-CENP-A.
   1. Graines 36,2 x 10⁵ cellules CENP-A-/F RPE-1 dans un plat de culture tissulaire de 10 cm.^-/F Cellules de culture dans le DMEM à haut glucose avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine.
      REMARQUE : Pour obtenir des résultats optimaux, déterminer empiriquement la densité cellulaire à utiliser dans l’ensemencement. Préparer au moins 2 plats pour un échantillon d’immunoprécipation (IP) afin d’obtenir un minimum de 1 mg de protéines totales.
   2. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO₂ pendant 18 h.
   3. À 17 h après l’ensemencement, préparer les réactifs de transfection.
   4. Faire la solution A en mélangeant 6,7 μg plasmide de chaque pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Tableau 1) en 335 μL de sérum réduit, et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 6,7 μg de plasmide de pcgN-HA-Ubiquitine (B2806) à tous les échantillons.
      REMARQUE : Tous les vecteurs sont répertoriés dans le tableau 1.
   5. Faire la solution B en mélangeant 10,1 μL de réactifs de transfection I et II, respectivement dans un milieu sérique réduit de 335 μL, et incuber à température ambiante pendant 5 min.
      REMARQUE : Une étape facultative consiste à ajouter seulement 40,2 μL réactif de transfection III (polyéthylèneimine [PEI]; 1,0 mg/mL) dans la solution B ou ajouter 40,2 μL de réagent de transfection III en plus des réactifs de transfection I et II dans la solution B (Tableau des matériaux).
   6. Mélanger les solutions A et B ensemble et incuber à température ambiante pendant 15 min.
   7. Après avoir lavé les cellules cultivées une fois avec PBS, ajouter le mélange des solutions A et B (c.-à-d. complexe ADN-lipide) directement à chacun des différents 10 cm de culture tissulaire plat qui a 3,35 mL μL milieu de sérum réduit.
      REMARQUE : La concentration finale est de 1,67 μg/mL de plasmide.
   8. Incuber les cellules à 37 °C incubateur avec 5% de CO₂ pour 4,5 h. Après 4,5 h, changez le DMEM moyen à haut glucose avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine.
   9. Culture des cellules à 37 °C avec 5% de CO₂ pour 48 h après transfection. Recueillir les cellules pour la préparation des lysates cellulaires.
2. Préparation de la protéine A perles liées à l’anticorps anti-GFP.
   1. Prenez 25 μL (50 % v/v) de perles de protéine A pour une réaction d’immunoprécipation (IP). Laver avec la mémoire tampon A1 (Table des matériaux) au moins 3x pour enlever EtOH, et faire une solution de 50 % avec tampon A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5 % Nonidet P-40; 0,5 % de désoxycholate; 0,5 % SDS; 1 mM EDTA; réactif d’inhibiteur de la protéase sans EDTA).
   2. Ajouter 2,0 μL d’anticorps anti-GFP (Anti#76 : anticorps fait maison) aux perles préparées ci-dessus et ajouter 10x de volume de tampon A1 en comparant avec le volume net de perles.
   3. Effectuer une rotation de bout en bout à 4 °C pendant 4-18 h. La durée optimale de la rotation de bout en bout doit être déterminée empiriquement en fonction de l’efficacité de l’immunoprécipitation.
   4. Centrifugez les perles à 100 x g pendant 1 min et retirez le supernatant non lié. Ajoutez la mémoire tampon A1 pour faire une solution de 50 % (v/v) des perles. Utilisez 25 μL (50% v/v) de cette solution pour une réaction de la propriété intellectuelle.
3. Immunoprécipitation (IP) à l’aide de perles de sépharose A liées à l’anticorps anti-GFP.
   1. Cellules de lyse obtenues à l’étape 5.1.9 dans la mémoire tampon A1 par sonication et processus de gel-dégel.
   2. Mesurer les concentrations de protéines et normaliser les quantités de protéines entre différents échantillons de propriété intellectuelle. Retirez 5 % de l’échantillon de chaque tube pour qu’il fonctionne sous forme d’échantillon d’entrée de 5 % dans SDS-PAGE.
      REMARQUE : L’échantillon d’entrée de 5 % peut être congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80 °C, s’il n’est pas chargé dans la journée.
   3. Mélanger le reste du lysate à 95 % avec 25 μL (50 % v/v) de perles de protéine A liées à des anticorps anti-GFP préparés à l’étape 5.2. Effectuer une rotation de bout en bout à 4 °C pendant 4-18 h.
      REMARQUE : La durée optimale de la rotation de bout en bout doit être déterminée empiriquement.
   4. Protéine de centrifugeuse Perles A avec la protéine liée à elle (c.-à-d. immunoprécipitates) avec 100 x g pendant 1 min, et enlever le supernatant. Laver les immunoprécipitates avec la mémoire tampon A1 en centrifuge à 100 x g pendant 1 min. Effectuez cette étape 4x.
   5. Mélangez l’entrée de 5 % et le reste des immunoprécipitates à 95 % avec le tampon de chargement 2x et 4x SDS-PAGE^14,respectivement. Faire bouillir ces deux échantillons pendant 5 min, puis les charger sur un gel SDS-polyacrylamide de 10,0 % pour l’électrophorèse dans différentes voies. Utilisez un gel SDS-PAGE plus grand (p. ex., 17 cm x 15 cm) pour l’électrophorèse. Si les échantillons sont exécutés dans des gels plus petits, il peut ne pas être possible d’observer des bandes d’ubiquité claire/forte.
   6. Effectuer l’analyse western de tache comme décrit à la section 4 à l’aide des anticorps indiqués dans le rapport précédent⁸. Le résultat est indiqué à la figure 2A.
   7. Utilisez le tampon de décapage de taches occidentales pour enlever les anticorps pré-incubés de la membrane PVDF et reblot avec différents anticorps pour la prochaine série d’analyses occidentales.

6. Spectrométrie de masse pour identifier le site d’ubiquité du mutant EYFP-CENP-A K124R

1. Transfection pour l’analyse de spectrométrie de masse à l’aide de pQCXIP-EYFP-CENP-A.
   1. Graines CENP-A^-/F RPE-1 dans un plat de culture tissulaire de 10 cm. Vérifiez que la densité cellulaire est de 36,2 x 10⁵ cellules par plat. Cellules de culture dans le DMEM à haut glucose avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine. Préparer au moins 20 plats pour un échantillon d’immunoprécipitation (IP), afin d’obtenir au moins 10 mg de protéines totales (voir 5,3).
      REMARQUE : Pour obtenir des résultats optimaux, déterminer empiriquement la densité cellulaire à utiliser dans l’ensemencement.
   2. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO₂ pendant 18 h. Préparer les réactifs de transfection ~ 23 h après la propagation (24 h point est 0 h point de la transfection).
   3. À 17 h après l’ensemencement, préparer les réactifs de transfection et les cellules transfectes comme (4.1.3). Les cellules transfectées ont la PCGN-HA-Ubiquitine (B2806) et pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
   4. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO₂ pour 48 h après transfection. Recueillir des cellules pour les lysates cellulaires.
   5. Cellules de lyse dans la mémoire tampon A1 et effectuent l’immunoprécipitation comme (5.2) et (5.3). Exécutez ces deux lysates d’immunoprécipitation comme suit (6.1.6) et (6.1.7).
      REMARQUE : Dans (6.1.6), exécutez l’échantillon dans des gels tris-glycine standard. Dans (6.1.7), exécutez l’échantillon dans les gels de protéines Bis-Tris disponibles dans le commerce. Voir aussi Discussion.
   6. Conserver un échantillon pour 10 % du total des immunoprécipitants afin de confirmer l’ubiquité EYFP-CENP-A et de déterminer précisément la position de l’EYFP-CENP-A ubiquitiné tel que décrit à la section 5. Exécutez cet échantillon dans des gels tris-glycine standard. SDS-PAGE et western blot ont été effectués comme (5.3).
   7. Conserver un autre échantillon pour 90 % du total des immunoprécipitants pour l’analyse de spectrométrie de masse. Exécutez cet échantillon dans deux puits des gels protéinés Bis-Tris disponibles dans le commerce. Effectuer coomassie coloration bleue à l’aide de la solution bleu Coomassie. Exciser et découper la région de gel de 50-70 kDa (putative mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R région). Utilisez cette région de gel pour l’analyse de spectrométrie de masse.
2. Analyse de spectrométrie de masse utilisant la digestion in-gel.
   1. Couper chaque tranche de gel d’intérêt en petits morceaux (1 mm²⁾et la placer dans 0,5 mL de tubes à faible liaison protéique.
   2. Laver avec 100 μL 50% (v/v) d’acétonitrule en 25 mM NH₄HCO₃, vortex 10-15 min, tourner vers le bas, jeter le supernatant, répéter 3x.
   3. Concentrer l’échantillon à l’aide d’un concentrateur à vide pendant 30 min pour sécher les morceaux de gel.
   4. Ajouter 10 μL de 10 ng/μL de qualité de séquençage trypsin et laisser les morceaux de gel se réhydrater pendant 5 min.
   5. Ajouter 25 mM NH₄HCO₃ juste assez pour couvrir les morceaux de gel, digérer à 37 °C pendant la nuit.
   6. Transférer le supernatant digéré dans un tube de silicium propre de 0,65 mL. Ajouter 50 % (v/v) d’acide formique (v/v) (30 μL ou assez pour couvrir), vortex 10 min, tourner et transférer dans le même tube d’extraction. Répéter 3x.
   7. Ajouter 10 μL d’acétonitrille aux morceaux de gel, vortex 5 min, et tourner vers le bas. Transférer le supernatant dans le même tube.
   8. Concentrer les échantillons à l’aide d’un concentrateur à vide à 2 μL, ajouter 8 μL 3 % (v/v) d’acétonitrule /2 % (v/v) d’acide formique à l’échantillon, vortex pendant 15 min et tourner à 16 000 x g pendant 30 min. Les échantillons sont prêts pour l’analyse de spectrométrie de masse.
   9. Effectuer l’acquisition de données MS avec LC-MS/MS à l’aided’unsystème de chromatographie liquide (Tableau des matériaux)couplé à un instrument de spectrométrie de masse ( Table des matériaux ).
   10. Injecter 8 μL d’échantillon reconstitué sur une colonne de chromatographie liquide en phase inverse (RPLC).
   11. Séparez les peptides d’un gradient de 2 à 80 % du solvant B en 60 min. Assurez-vous que le gradient se compose d’un pourcentage croissant de solvant B de 2% à 22% en 40 min, 22% à 35% solvant B en 12 min, puis grimpant à 80% solvant B en 4 min, et enfin en tenant à 80% solvant B pour les 4 dernières minutes. Réglez la constante de débit à 300 nL/min.
       REMARQUE : Le solvant A contient 0,1 % d’acide formique et 2 % d’acétonitryle, le solvant B contient 0,1 % d’acide formique et 98 % d’acétonitrule. Toutes les concentrations sont indiquées sous forme de volume/volume.
   12. Collectez des données de spectrométrie de masse à l’aide du mode d’acquisition dépendant des données. En bref, recueillir les spectres de SP en 350–1500 m/z pour 250 ms. Sélectionnez les 50 principaux précurseurs intenses avec charge 2–5 pour une fragmentation ultérieure. Recueillir les spectres MS/MS en 100–2000 m/z pour 100 ms, Exclure les ions précurseurs de la resélection pendant 15 s.
   13. Pour la recherche de base de données, ouvrez le logiciel commercial (voir Tableau des matériaux)pour analyser les données de spectrométrie de masse sur le bureau.
   14. Pour effectuer une nouvelle recherche, cliquez sur le bouton« LC» dans le menu supérieur. Cliquez ensuite sur le bouton «Ajouter» pour télécharger les fichiers de données brutes MS d’origine.
   15. Sélectionnez «Human Protein ID» dans la «méthode Paragon» comme méthode de recherche de base de données. Recherchez les fichiers de données brutes MS d’origine dans la base de données UniProt Homo Sapiens (contenant 160 566 séquences, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
   16. Définissez les paramètres de recherche comme suit : sélectionnez la trypsine comme enzyme de digestion, prévoyez jusqu’à 3 clivages manquants, 4 modifications et 2-5 charges par peptide. Définissez une erreur de masse jusqu’à 20 ppm pour la première recherche et 0,02 Da pour les ions fragmentés. Spécifiez les seuils de taux de fausse découverte (FDR) pour les protéines, le peptide et les sites de modification inférieurs à 1 %. Définissez tous les autres paramètres du logiciel sur les valeurs par défaut (voir la figure 3 pour l’analyse de spectrométrie de masse).
   17. Cliquez sur le bouton «Enregistrer comme» à droite du menu supérieur, sélectionnez un dossier pour stocker les résultats de recherche, entrez le nom de recherche et cliquez sur le bouton «Enregistrer».
   18. Cliquez sur le bouton «Processus» à droite du menu supérieur pour démarrer la recherche. Une fois la recherche terminée, les données avec le nom de recherche entré seront automatiquement stockées dans le dossier sélectionné. Les données peuvent être facilement ouvertes par le logiciel F.
   19. Pour obtenir des spectres MS/MS de tout peptide spécifique, double cliquez sur les résultats de recherche pour l’ouvrir par le logiciel F. Tout d’abord, cliquez sur la protéine dans la liste des protéines en haut du menu, puis cliquez sur le peptide au milieu du menu. La SP/MS de ce peptide est indiquée en bas du menu.
   20. Pour exporter et enregistrer les spectres MS/MS, cliquez avec le bouton droit sur les spectres MS/MS en bas du menu, sélectionnez copier puis coller dans un fichier approprié tel que le format PPT ou doc.

Résultats

Le mutant EYFP-CENP-A K124 montre l’ubiquité, l’interaction avec le HJURP, et aucun défaut dans la localisation de centromère ni la létalité cellulaire. Ici, le système signalé par Fachinetti et coll. (2017)⁶ a été reconstitué : dans les cellules humaines diploïdes (RPE-1) portant une cellule perturbée et une allèle CENP-A (CENP-A^-/F),EYFP-CENP-A a été exprimée à partir du vecteur de rétrovirus pBabe-EYFP. Dans ce système, l’ex...

Discussion

Ici, nous avons décrit des méthodes d’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité du mutant EYFP-CENP-A K124R suggérant que le marquage EYFP induit l’ubiquité à une lysine différente dans la protéine mutante CENP-A K124R⁸. Dans nos résultats, nous avons identifié avec succès l’ubiquité sur la lysine 306 (K306) dans EYFP-CENP-A K124R, qui correspond à la lysine 56 (K56) dans l’analyse de spectrométrie de masse cenp-A. L’analyse de spectrométrie de masse ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes	Eppendorf	022431064	For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish	BIOFIL/JET, China	700224	10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6-well culture plate
CentriVap	LABCONCO	-	Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm	Eksigent Technologies	805-00120	Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE	100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS	63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope	Leica	-	motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source	Leica		External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)	Surgipath	105	Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus	Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences	31071010	Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D	Eksigent Technologies	-	liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher	NP0335BOX	The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	-	Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera	Hamamatsu	C10600-10B	CCD camera
PAP Pen	Binding Site	AD100.1	For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM	VWR	25382-166	10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size)	Junyi, China	JY-SCZ6+	Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted	VWR International	48312-013	Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody	Novus Biologicals	H00001059-B01P	Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH	ABCAM	ab37168	Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH	Invitrogen	PA1987	Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody	ANTI #76 (Homemade antibody)		Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10)	Roche	11815016001	Rat monoclonal antibody
anti-HJURP	Proteintech Group	15283–1-AP	Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin	Bethyl Laboratories	A300-317A-1	Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33996-185	Microtip for sonication
Buffer A1	-	-	20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11-873-580-001	Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250	BBI Life Sciences	CAS 6104-59-2	Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)	SigmaI-Aldrich	HT90132-1L	For colony staining
DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	For nuclear staining
DMEM: F12 Medium	ATCC	30-2006	DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Life Technologies/Gibco	10082	FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol	Fisher	A412-4	Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)	Fisher Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)	Non-fat skim milk
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	Reduced serum media
p-phenylenediamine	SIGMA-SLDRICH	P6001	For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid	Fisher/Gibco	15-140	Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION	SIGMA-SLDRICH	P 8920	Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml	Polysciences	23966–2	Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads	GE Healthcare/Amersham	17-0963-03	Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	PI21059	Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo	34095	Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)	-	-	Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software	Olympus	-	Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software	Olympus	-	Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18	Olympus	-	Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0	LI-COR Biosciences	-	Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System	Bio-Rad	-	Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System	LI-COR Biosciences	-	Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware	-	-	For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software	Improvision/PerkinElmer	-	Software A
ProteinPilot Software version 4.5	AB SCIEX	-	Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software	Bio-Rad	-	Software E
TripleTOF 5600+ System	AB SCIEX	-	Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)	PerkinElmer	-	Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)	PerkinElmer	-	Software B2