Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الموصوفة هنا هو أسلوب الطباعة الحجرية nanosphere لتصنيع موازية من أدلة الموجات وضع الصفر، والتي هي صفائف من nanoapertures في غطاء الزجاج المجهري يرتدون المعدن لتصوير جزيء واحد في نانو إلى تركيزات الكائنات الدقيقة من الفلوروفوريس. الأسلوب يستفيد من التجمع الذاتي الكريستال الغروية لإنشاء قالب موجه الموجة.

Abstract

في جزيء واحد الأنزيمات الفلورية جزيء، مضان الخلفية من الركائز المسمى في الحل غالبا ما يحد من تركيز الفلوروفوري لنطاقات بيكو إلى نانومولار، عدة أوامر من حجم أقل من العديد من تركيزات ليجاند الفسيولوجية. تسمح الهياكل النانوية البصرية التي تسمى أدلة الموجات ذات الوضع الصفري (ZMWs)، والتي يبلغ قطرها 100−200 نانومتر والمصطنعة في معدن رقيق موصل مثل الألومنيوم أو الذهب، بتصوير الجزيئات الفردية بتركيزات الكائنات الدقيقة من الفلوروفوريس من خلال حصر الإثارة الضوئية المرئية في الأحجام الفعالة للزيبتلتر. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى معدات تصنيع النانو باهظة الثمن والمتخصصة قد حالت دون الاستخدام الواسع النطاق ل ZMWs. عادة ، يتم الحصول على الهياكل النانوية مثل ZMWs عن طريق الكتابة المباشرة باستخدام الطباعة الحجرية شعاع الإلكترون ، وهو تسلسلي وبطيئ. هنا، يستخدم الغروانية، أو nanosphere، الطباعة الحجرية كاستراتيجية بديلة لخلق أقنعة على نطاق نانومتر لتصنيع دليل الموجة. ويصف هذا التقرير النهج بالتفصيل، مع مراعاة اعتبارات عملية لكل مرحلة. وتسمح هذه الطريقة بآلاف من الألومنيوم أو الذهب ZMWs أن تكون في موازاة, مع أقطار waveguide النهائي وأعماق 100−200 نانومتر. لا يلزم سوى معدات المختبر الشائعة والمبخر الحراري لترسب المعادن. من خلال جعل ZMWs أكثر سهولة للمجتمع الكيميائي الحيوي ، يمكن لهذه الطريقة تسهيل دراسة العمليات الجزيئية بتركيزات ومعدلات خلوية.

Introduction

تقنيات جزيء واحد مثل جزيء واحد نقل الطاقة الرنين مضان (smFRET) أو جزيء واحد مضان الطيف الارتباط (FCS) هي أدوات قوية للفيزياء الحيوية الجزيئية، مما يسمح لدراسة الحركات الديناميكية، والتطابقات، والتفاعلات من الجزيئات الحيوية الفردية في عمليات مثل النسخ1،2،3،ترجمة 4،5،6،وغيرها الكثير7. بالنسبة ل smFRET، يعد المجهر الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) طريقة شائعة لأنه يمكن اتباع العديد من الجزيئات المربوطة بمرور الوقت، وتقتصر الموجة المبشرة الناتجة عن النقل البري الدولي على منطقة 100−200 نانومتر مجاورة للزلاب8. ومع ذلك ، حتى مع هذا التقييد على حجم الإثارة ، لا تزال الفلوروفوريس ذات الاهتمام بحاجة إلى تخفيفها إلى نطاقات pM أو nM من أجل الكشف عن إشارات جزيء واحد فوق فلوريكنسالخلفية 9. منذ ثوابت Michaelis-Menten من الإنزيمات الخلوية وعادة ما تكون في نطاق μM إلى mM10، والتفاعلات الكيميائية الحيوية في دراسات جزيء واحد وعادة ما تكون أبطأ بكثير من تلك الموجودة في الخلية. على سبيل المثال، يحدث تخليق البروتين بمعدل 15−20 حمض أميني في الثانية في الإشريكية القولونية11،12، في حين أن معظم الريبوسومات prokaryotic في تجارب smFRET تترجم في 0.1−1 حمض أميني في الثانية13. في تخليق البروتين، أظهرت الهياكل البلورية وsmFRET على الريبوسومات المتوقفة أن نقل الحمض النووي الريبي (tRNAs) تتقلب بين الدول "الهجينة" و "الكلاسيكية" قبل نقل TRNA-mRNA الخطوة14،15. ومع ذلك ، عندما كانت التركيزات الفسيولوجية لعامل GTPase النقل ، EF-G ، موجودة ، لوحظ تشكيل مختلف ، وسيط بين الحالات الهجينة والكلاسيكية ، في smFRET6. دراسة العمليات الجزيئية الديناميكية بمعدلات وتركيزات مماثلة لتلك الموجودة في الخلية أمر مهم، ولكن لا يزال تحديا تقنيا.

استراتيجية لزيادة تركيز الركيزة الفلورية هو استخدام فتحات الطول الموجي القائمة على المعدن ، دون مرئية ، ودعا أدلة الموجات وضع الصفر (ZMWs) ، لتوليد حقول الإثارة المحصورة التي تثير بشكل انتقائي الجزيئات الحيوية المترجمة داخل الفتحات16 (الشكل 1). الفتحات عادة ما تكون 100−200 نانومتر في القطر و 100−150 نانومتر في العمق17. فوق الطول الموجي قطع المتعلقة حجم وشكل الآبار (λج ≈ 2.3 أضعاف القطر لموجس الموجات الدائرية مع الماء كما المتوسطةعازلة 18)،لا يسمح وسائط نشر في دليل الموجة، وبالتالي مصطلح دليل الموجة وضع الصفر. ومع ذلك ، فإن المجال الكهرومغناطيسي المتذبذب ، الذي يطلق عليه موجة مبشرة ، يتحلل أضعافا مضاعفة في شدته لا يزال أنفاقا على مسافة قصيرة في الدليل الموجي18،19. على الرغم من تشابهها مع موجات TIR المبشرة ، إلا أن موجات ZMW المبشرة لها ثابت اضمحلال أقصر ، مما يؤدي إلى منطقة إثارة فعالة 10−30 نانومتر داخل موجه الموجة. في تركيزات الكائنات الدقيقة من الليجانات المسماة بالفلورسنت ، يوجد واحد أو عدد قليل من الجزيئات في وقت واحد داخل منطقة الإثارة. هذا التقييد لحجم الإثارة وما يترتب على ذلك من انخفاض في تفلور الخلفية يمكن التصوير الفلوري للجزيئات المفردة بتركيزات ذات صلة بيولوجيا. وقد تم تطبيق هذا على العديد من النظم20, بما في ذلك قياسات FCS لنشر بروتين واحد21, جزيءواحد FRET القياسات من انخفاض تقارب ليغاند البروتين22 والتفاعلات البروتين البروتين23, والقياسات الطيفية الكهروكيميائية للأحداث دوران الجزيئية واحد24.

وقد تم إنتاج ZMWs عن طريق نقش طبقة معدنية مباشرة باستخدام طحن شعاع أيون25،26 أو الطباعة الحجرية شعاع الإلكترون (EBL) تليها البلازما النقش16،27. هذه الأساليب الطباعة الحجرية قناع خلق أدلة موجية في سلسلة وعادة ما تتطلب الوصول إلى مرافق تصنيع النانو المتخصصة، ومنع اعتماد واسع النطاق لتكنولوجيا ZMW. طريقة أخرى، الأشعة فوق البنفسجية nanoimprint الطباعة الحجرية رفعقبالة 28،ويستخدم قالب الشريحة الكوارتز للضغط على قالب ZMW معكوس على فيلم مقاومة مثل ختم. في حين أن هذه الطريقة أكثر تبسيطا ، إلا أنها لا تزال تتطلب EBL لتصنيع قالب الكوارتز. تقدم هذه المقالة البروتوكول لطريقة تصنيع قالب بسيطة وغير مكلفة لا تتطلب طحن EBL أو شعاع أيون وتستند إلى التعبئة الوثيقة للنانكوسفير لتشكيل قناع حجري.

يستخدم النانوسفير أو الطباعة الحجرية "الطبيعية"، التي اقترحها ديكمان ودونسموير29و30لأول مرة في عام 1982، التجميع الذاتي للجسيمات الغروية أحادية التشتت، والتي تتراوح بين عشرات النانومترات وعشرات الميكرومتر31،لإنشاء قوالب للنقش السطحي عبر النقش و/أو ترسب المواد. تتميز الصفائف الدورية الثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) أو ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من الجسيمات الغروية ، والتي يشار إليها باسم البلورات الغروية ، ب iridescence مشرق من التشتت والحيود32. على الرغم من أن استخدامها أقل على نطاق واسع من شعاع الإلكترون أو التصوير الضوئي ، فإن منهجية الإخفاء هذه بسيطة ومنخفضة التكلفة ، ويمكن تقليصها بسهولة لإنشاء أحجام ميزات أقل من 100 نانومتر.

توجيه التجميع الذاتي للجسيمات الغروية يحدد نجاح استخدام بلورات الغروية كأقنعة لأنماط السطح. إذا كان حجم وشكل الجسيمات متجانسة ، يمكن بسهولة تجميع الجسيمات الغروية ذاتيا مع التعبئة السداسية ، مدفوعة باستنفاد إنتروبيا33. تبخر الماء بعد انخفاض الطلاء هو طريق فعال لرواسب الجسيمات الغروية، على الرغم من أن أساليب أخرى تشمل تراجع طلاء34،تدور طلاء35،ترسب كهربائي36،وتوطيد في واجهة الهواء والمياه37. ويستند البروتوكول الوارد أدناه إلى طريقة ترسيب التبخر، التي كانت أبسط طريقة للتنفيذ. الفواصل الثلاثية بين حبات البوليسترين معبأة وثيقة شكل فتحات فيها لوحة معدن الأضاحي، وتشكيل وظائف (الشكل 2 والشكل التكميلي 1). ثني مختصر من الخرز قبل هذه الخطوة يضبط شكل وقطر هذه الوظائف. تتم إزالة الخرز ، وتودع طبقة معدنية نهائية حول المشاركات ، ثم تتم إزالة المشاركات. بعد خطوتي الترسب المعدني على قناع النانو الغرواني ، وإزالة الوظائف الوسيطة ، وتعديل كيمياء السطح للتخميل والربط ، تكون صفائف ZMW جاهزة للاستخدام لتصوير جزيء واحد. ويمكن العثور على توصيف أكثر شمولا للخصائص البصرية ZMW بعد تلفيق في المادة38المصاحبة. إلى جانب المبخر الحراري لترسب بخار المعادن ، لا توجد حاجة إلى أدوات متخصصة.

Protocol

ملاحظة: يمكن إكمال كافة الخطوات في مساحة معمل عام.

1. تنظيف غطاء الزجاج

  1. لتوفير سطح نظيف للترسب التبخري للجسيمات الغروية، ضع أغطية زجاجية بصرية من البوروسيليكات مقاس 24 × 30 ملم (سمك 0.16−0.19 مم) داخل الإدراجات المخدودة لجرة تلطيخ زجاجية من كوبلين لتنظيفها.
    ملاحظة: تأكد من أن الأغطية تقف بشكل مستقيم ومنفصلة بشكل جيد بحيث يتم عرض جميع الأسطح بوضوح أثناء عملية التنظيف.
  2. صب ما يكفي من الأسيتون في جرة تلطيخ لتغطية الأغطية، ووضع الغطاء على، و sonicate لمدة 10 دقيقة في 40 درجة مئوية.
  3. صب الأسيتون وشطف coverlips عن طريق ملء جرة تلطيخ مع المقطر H2O وصب الماء. كرر 2 مرات أخرى.
  4. كرر صوتنة الأسيتون (الخطوتين 1.2 و 1.3) مرة أخرى.
  5. صب ما يكفي من 200 MM KOH في جرة لتغطية الأغطية و sonicate، مغطاة، لمدة 20 دقيقة في 40 درجة مئوية.
    ملاحظة: كوه يحفر قليلا الزجاج.
  6. شطف الأغطية مع المقطر H2O 6 مرات.
  7. إضافة الإيثانول لتغطية coverlips، إضافة الغطاء، و sonicate لمدة 10 دقيقة في 40 درجة مئوية.
  8. شطف الأغطية مع المقطر H2O 3 مرات.
  9. التقاط كل coverslip على الحافة باستخدام ملقط لطيف وتجفيف coverlips مع الغاز N2. المس حواف غطاء الغطاء فقط. ضع كل من الأغطية المجففة والمنظفة في طبق بيتري نظيف فردي.

2. ترسب التبخر من حبات البوليسترين

  1. لإنشاء قناع بلوري الغروانية لمجموعة ZMW، والطرد المركزي 50 ميكرولتر من قطر 1 ميكرومتر، والخرز البوليسترين غير وظيفية (2.5٪ ث / الخامس في الماء) في 15،000 × ز،25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: قبل pipetting الخرز، يجب أن يكون حل المخزون دوامة لفترة وجيزة في حالة قد استقر الخرز إلى الجزء السفلي من الزجاجة.
  2. تجاهل supernatant، وترك أقل قدر ممكن من الماء المتبقية.
    ملاحظة: يمكن أن تغير المياه المتبقية خصائص التبخر من الايثانول resuspension39، لذلك إزالة كمية صغيرة من الخرز من أجل إزالة كل من الماء هو مقبول.
  3. Resuspend الخرز من الخطوة 2.2 في 50 ميكرولتر من 1:400 TritonX-100:الإيثانول المذيبات. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط الخرز بدقة مع المذيبات.
    ملاحظة: يجب أن تكون مختومة TritonX-100:ethanol المذيبات مع فيلم البارافين بعد الاستخدام وإعداد الطازجة مرة واحدة في الشهر. تميل الخرز إلى الالتزام بجوانب وعاء بلاستيكي ، مثل أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، لذلك ماصة على طول الجانبين لضمان إعادة إنفاق جميع الخرز.
  4. لإعداد غرفة الرطوبة للترسب، ضع 6 أطباق بيتري، كل منها مع غطاء واحد، على مقعد في خط مع أغطية تركت ajar قليلا. في كل طبق، قم بتحريك الغطاء إلى المنطقة المفتوحة بحيث تتعرض الأغطية للبيئة عندما تزداد الرطوبة في الخطوة التالية.
  5. ضع مقياس الرطوبة ومروحة كهربائية صغيرة تركزت خلف أطباق بيتري.
  6. سجل الرطوبة النسبية للبدء (RH) في المختبر. املأ كوب سعة 200 مل مع 150−200 مل من الماء ~ 75 درجة مئوية وضعه خلف المروحة.
  7. قم بتشغيل المروحة وغط أطباق بيتري ومروحتها وأكوابها ومقياس الرطوبة بحاوية تخزين بلاستيكية منقلبة وشفافة (66 سم × 46 سم × 38 سم).
  8. دع RH في الغرفة ترتفع إلى 70-75٪، والتي عادة ما تستغرق 5-10 دقائق.
    ملاحظة: إذا كان المختبر المحيط RH منخفضا (أقل من ~ 50٪)، فدع الغرفة تصل إلى درجة حرارة أعلى، ولكن لا تزيد عن 80٪، للتعويض عن فقدان الرطوبة أثناء الترسب (انظر أدناه).
  9. عندما تصل درجة حرارة الري إلى 70-75٪، سجل RH ورفع حاوية التخزين البلاستيكية قليلا لوضع الأغطية بسرعة على أطباق بيتري، مما يمنع الإفراط في التبول من الأغطية.
    ملاحظة: درجة الحرارة في الغرفة ستكون أكثر دفئا قليلا من درجة حرارة الغرفة، وعادة ما تكون 25-26 درجة مئوية، نتيجة للترطيب. إذا كانت الرطوبة مرئية على الأغطية ، فإن الأسطح الزجاجية رطبة للغاية. صندوق قفازات تجاري قد يبسط هذا الجزء من البروتوكول.
  10. دع RH في الغرفة تستمر في الارتفاع إلى 85٪. عند هذه النقطة، سجل RH في غرفة الرطوبة وماصة 5 ميكرولتر من تعليق حبة على وسط كل coverslip.
  11. أغلقي الغرفة وأطباق بيتري بعد كل ترسب لتقليل فقدان الرطوبة. تهدف إلى الانتهاء من جميع الترسبات 6 في غضون 2 دقيقة.
  12. سجل RH في الغرفة بعد الشهادة.
    ملاحظة: سوف RH بعد ترسب تساعد على قياس مدى سرعة الرطوبة فقدت أثناء ترسب، والذي يعتمد على ظروف المختبر المحيط. بالنسبة للركض الناجح النموذجي، ستبدأ الغرفة بنسبة 85٪ من RH قبل الإدلاء بالشهادة وتنتهي عند 70-75٪ RH بعد الشهادة.
  13. دع قطرات الخرز تنتشر وتجف لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: إذا كانت بلورات الغروية لديها العديد من الثقوب أو مناطق متعددة الطبقات، ثم الغرفة كان من المرجح رطبة جدا أو جافة، على التوالي. ضبط الرطوبة النسبية التي لإغلاق أطباق بيتري والبدء في الترسبات (انظر قسم النتائج لمزيد من المناقشة للتحسين).

3. حبة التلوي للحد من حجم المسام في قالب الكريستال الغرواني

  1. لتوفير سطح درجة حرارة موحدة لتلص الخرز البوليسترين، الذي يضيق interstices بين حبة وجولات زوايا interstices، وضع شقة، لوحة الألومنيوم المطحون على رأس لوحة السيراميك الساخنة القياسية.
  2. تعيين درجة حرارة لوحة ساخنة إلى 107 درجة مئوية، ودرجة حرارة الانتقال الزجاج من البوليسترين40.
    ملاحظة: للحصول على درجة حرارة مستقرة ودقيقة، تم إجراء مسبار حراري في حفرة عمقها 2-3 مم وعمق 4-5 ملم في صفيحة الألومنيوم.
  3. ضع غطاء يحتوي على قالب الخرز على لوحة الألومنيوم الساخنة وعلوى لمدة 20 s (انظر قسم المناقشة لشرح وقت الذوبان).
  4. بعد التدفئة، وإزالة غطاء من لوحة الألومنيوم ووضعه على الفور على سطح الألومنيوم درجة حرارة غرفة أخرى لتبريده.
    ملاحظة: من المفيد إما أن يكون الأغطية معلقة قليلا على حافة اللوحة أو طاحونة القنوات الضحلة (انظر الفيديو المصاحب) في لوحة لتسهيل التقاط الأغطية.

4. Nanofabrication من الألومنيوم صفر وضع waveguides باستخدام قالب الكريستال الغروية

  1. باستخدام ترسب التبخر الحراري أو الإلكترون شعاع، إيداع 300 نانومتر من النحاس في 2 Å/s على قالب الكريستال الغرواني لتوليد وظائف في interstices بين الخرز.
  2. إزالة المعادن الزائدة على رأس الخرز عن طريق الضغط بلطف على السطح مع الشريط. قشر الشريط ببطء لسحب قبالة المعدن.
    ملاحظة: قد تبقى بعض بقع صغيرة من المعدن الزائد العاكس بعد سحب الشريط، ويمكن إزالتها في كثير من الأحيان عن طريق تيار من الغاز N2. إذا بقيت بقع كبيرة من المعدن العاكس الزائد بعد سحب الشريط ، فحاول نقع القوالب في التولوين لمدة 2 ساعة لإذابة حبات البوليسترين جزئيا. غسل الأغطية بالماء المقطر، الجافة مع N2،وتكرار سحب الشريط. يجب أن لا تذوب نقع إضافية تماما الخرز، كما الخرز تساعد على حماية الوظائف من التلف أثناء سحب الشريط.
  3. لإذابة حبات البوليسترين، ضع قوالب الخرز في التولوين وانقعها بين عشية وضحاها.
    تحذير: قد تكون أبخرة الولوين سامة. العمل مع toluene تحت غطاء محرك السيارة جيدة التهوية وارتداء معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات، ونظارات السلامة، ومعطف المختبر. يجب تخزين التولوين في خزانات التهوية المخصصة للسوائل القابلة للاشتعال.
  4. بعد حضانة التولوين، شطف القوالب مرة واحدة مع الكلوروفورم ومرتين مع الإيثانول. مقبض يغطي بعناية في هذه المرحلة لأن الحساسة 200-300 نانومتر وظائف معدنية طويل القامة تتعرض الآن. جفف القوالب باستخدام N2 وأزل البوليمر المتبقي والملوثات في منظف بلازما الأكسجين لمدة 30 دقيقة.
    تنبيه: قد تكون أبخرة الكلوروفورم سامة. العمل مع الكلوروفورم تحت غطاء محرك السيارة جيدة التهوية وارتداء معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات، ونظارات السلامة، ومعطف المختبر. يجب تخزين الكلوروفورم في خزانات التهوية بعيدا عن المذيبات القابلة للاشتعال الأخرى.
  5. باستخدام ترسب التبخر الحراري أو الإلكترون شعاع، إيداع 3 نانومتر من طبقة التصاق التيتانيوم في 1 Å/s تليها 100-150 نانومتر من الألومنيوم في 4 Å/s حول وعلى رأس وظائف النحاس.
    ملاحظة: يمكن للمرء استخدام الكسوة سمكا للحصول على أدلة أعمق وتحسين التوهين من مضان الخلفية، ولكن هذا يقلل أيضا من العائد بعد فضح وحل الوظائف في الخطوة التالية (انظر قسم المناقشة).
  6. لإذابة الوظائف المعدنية، نقع الأغطية في النحاس الخلاف (حمض الستريك القائم على؛ جدول المواد) لمدة 2 ساعة.
    تنبيه: يمكن أن يسبب اللافانت المعدني حروقا جلدية. العمل مع المحترفين تحت غطاء محرك السيارة جيدة التهوية وارتداء معدات الحماية. غسل اليدين جيدا بعد التعامل معها. وينبغي تخزين المعادن النقوش في خزانات التهوية المخصصة للسوائل المسببة للتآكل.
  7. شطف coverlips مع الماء المقطر، الجافة مع N2،وبرتقالي بلطف سطح الكسوة المعدنية مع ورقة العدسة لفضح أي الوظائف التي لا تزال مغطاة في الكسوة. وضع coverlips مرة أخرى في النحاس النقوش لمدة 2 ساعة أخرى، ثم شطف مرة أخرى مع الماء المقطر والجافة مع N2.
    ملاحظة: يجب تخزين شرائح ZMW في أطباق بيتري مغطاة ونظيفة لإبقائها خالية من الملوثات.

5. Nanofabrication الذهب صفر وضع waveguides باستخدام قالب الكريستال الغروانية

ملاحظة: يتم توفير طريقة لتصنيع الذهب ZMWs (الشكل التكميلي 1)، الذي يعكس بروتوكول لتصنيع الألومنيوم ZMWs، في هذا القسم.

  1. باستخدام ترسب التبخر الحراري أو الإلكترون شعاع، إيداع 3 نانومتر من طبقة التصاق التيتانيوم في 1 Å/s تليها 300 نانومتر من الألومنيوم في 4 Å/s.
  2. إزالة المعادن الزائدة على رأس الخرز عن طريق الضغط بلطف على السطح مع الشريط. قشر الشريط ببطء لسحب قبالة المعدن.
  3. لإذابة حبات البوليسترين، ضع قوالب الخرز في التولوين وانقعها بين عشية وضحاها.
  4. بعد حضانة التولوين، شطف القوالب مرة واحدة مع الكلوروفورم ومرتين مع الإيثانول. جفف القوالب باستخدام N 2 وأزلملوثات البوليمر المتبقية في منظف بلازما الأكسجين لمدة 30 دقيقة.
  5. باستخدام ترسب التبخر الحراري أو الإلكترون شعاع، إيداع 100−150 نانومتر من الذهب في 5 Å/s حول وعلى رأس وظائف الألومنيوم.
  6. لإذابة الوظائف المعدنية، نقع الأغطية في النقوش الألومنيوم (حمض الفوسفوريك القائم على؛ جدول المواد) لمدة ساعة واحدة
  7. شطف coverlips مع الماء المقطر، الجافة مع N2،وبرتقالي بلطف سطح الكسوة المعدنية مع ورقة العدسة لفضح أي الوظائف التي لا تزال مغطاة في الكسوة. وضع coverlips مرة أخرى في الألومنيوم النقوش لمدة 1 ساعة، ثم شطف مرة أخرى مع الماء المقطر والجافة مع N2.
    ملاحظة: يجب تخزين شرائح ZMW في أطباق بيتري مغطاة ونظيفة.

النتائج

يمكن للتجميع الذاتي للجسيمات الغروية البوليسترين عن طريق الترسيب التبخري (الخطوات 2.1-2.13) أن ينتج مجموعة من النتائج لأنه يتطلب التحكم في معدل تبخر المذيبات. ومع ذلك، لأن الترسبات سريعة (10-15 دقيقة في الجولة الواحدة)، يمكن تحسين الإجراء بسرعة لظروف المختبر المحيط المختلفة. الشكل 3أ...

Discussion

بالنسبة للتجميع الذاتي الغرواني (القسم 2 من البروتوكول)، فإن استخدام الإيثانول بدلا من الماء كمذيب معلق يسرع عملية التبخر بحيث تكون القوالب جاهزة في 2-3 دقائق بعد الترسب بدلا من 1−2 ساعة كما هو الحال في الطرق السابقة48،49. بروتوكول الترسيب التبخري المعروض هنا ه...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01GM080376، R35GM118139، ومركز NSF للهندسة الميكانيكية CMMI: 15-48571 إلى Y.E.G. ، وزمالة NIAID قبل الدكتوراه NRSA F30AI114187 إلى R.M.J.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Glass Coverslip Cleaning
AcetoneSigma322011 L
Coplin glass staining jarFisher Scientific08-817Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
CoverslipsVWR48404-46724 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
EthanolSigmaE70231 L
KOHSigma30603Potassium hydroxide
Petri dishesFisher ScientificR80115TS100 mm diameter, 15 mm deep
SonicatorBransonZ245143Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage containerFisher Scientific50-110-822226 x 18 x 15 in.
Desk fanO2CoolFD05001AAny small desk (~5 in.) fan will work
Glass beakerFisher Scientific02-555-25B250 mL
Humidity meterFisher Scientific11-661-19
Microcentrifuge tubesFisher Scientific21-402-9031.5 mL
Polystyrene microspheresPolysciences18602-151.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgentSigmaX100100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plateFisher ScientificAA11062RYCustomized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplateFisher ScientificHP8885710013 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controllerMcMaster-Carr38615K71Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probeMcMaster-Carr9251T93Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchantTranseneType A
Aluminum pelletsKurt J. LeskerEVMAL40QXHBFor electron beam evaporation
ChloroformSigma2883061 L
Copper etchantTransene49-1
Copper pelletsKurt J. LeskerEVMCU40QXQAFor electron beam evaporation
Gold pelletsKurt J. LeskerEVMAUXX40GFor electron beam evaporation
Lens paperThorlabsMC-5
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Scotch tapeStaplesMMM119
Thin film deposition systemKurt J. LeskerPVD-75Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pelletsKurt J. LeskerEVMTI45QXQAFor electron beam evaporation
TolueneSigma2445111 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling SoftwareCOMSOL, Inc.
Dual View spectral splitterPhotometrics, Inc.

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. . Electromagnetism. , (2002).
  19. Jackson, J. D. . Classical electrodynamics. Third edition. , (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v. Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved