为高浓度单分子显微镜制造零模式波导

摘要

这里描述的是一种纳米球平板成像方法，用于平行制造零模式波导，这是金属包玻璃显微镜覆盖带中的纳米阵列，用于在纳米到微摩尔浓度的荧光素下进行单分子成像。该方法利用胶体晶体自组装创建波导模板。

摘要

在单分子荧光酶学中，溶液中标记基材的背景荧光通常将荧光浓度限制在皮科至纳米摩尔范围内，其数量级小于许多生理配体浓度。称为零模式波导 （ZMWs） 的光学纳米结构，直径为 100 至 200 nm，由铝或金等薄导金属制造，通过将可见光激发限制在沸点有效体积中，从而允许在氟叶微摩尔浓度下对单个分子进行成像。然而，对昂贵和专门的纳米制造设备的需求已经排除了ZMW的广泛使用。 通常，ZMW等纳米结构是通过直接书写获得的，电子束光刻是连续的和缓慢的。在这里，胶体或纳米球，光刻学被用作替代策略，以创建纳米级的面罩，用于波导制造。本报告详细描述了该方法，并考虑到每个阶段的实际情况。该方法允许数千个铝或金ZMW并行制造，最终波导直径和深度为100-200纳米。只需要普通的实验室设备和用于金属沉积的热蒸发器。通过使ZMW更容易进入生化社区，这种方法可以促进细胞浓度和速率分子过程的研究。

引言

单分子荧光共振能量转移（smFRET）或单分子荧光相关光谱（FCS）等单分子技术是分子生物物理学的有力工具，能够研究单个生物分子在转录^1、2、3、翻译^4、5、6等^过程中的动态运动、构象和相互作用。对于 smFRET 来说，总内部反射荧光 （TIRF） 显微镜是一种常见方法，因为随着时间的推移，许多系绳分子可能会被跟踪，而 TIR 产生的消散波仅限于与盖唇⁸相邻的 100 至 200 nm 区域。然而，即使这种对激发体积的限制，感兴趣的荧光仍然需要稀释到pM或nM范围，以检测单分子信号以上的背景荧光^9。由于细胞酶的Mi michaelis-Menten常数通常在μM到mM范围¹⁰之间，单分子研究中的生化反应通常比细胞中的生化反应慢得多。例如，蛋白质合成发生在大肠杆菌11，12中每秒^15-20氨基酸，而大多数蛋白核糖体在smFRET实验中翻译为每秒0.1+1氨基酸^每秒13。在蛋白质合成中，停滞核糖体上的晶体结构和smFRET显示，在tRNA-mRNA转移步骤^14、15之前^，转移RNA（tRNA）在"混合"和"经典"状态之间波动。然而，当迁移GTPase因子（EF-G）的生理浓度存在时，在smFRET⁶中观察到了混合状态和经典状态之间的不同构象。以与细胞中相似的速度和浓度研究动态分子过程很重要，但仍然是一项技术挑战。

提高荧光基板浓度的策略是使用金属基亚可见波长光圈（称为零模式波引（ZMWs））来生成密闭激发场，选择性地激发孔径^内局部化的生物分子（图1）。光圈的直径一般为100~200纳米^，深度为100~150纳米。在与井的大小和形状相关的截止波长以上_（≈以水为介电介质¹⁸的圆形波导直径为 2.3 倍），波导不允许传播模式，因此称为"零模式波导"。然而，一个振荡的电磁场，称为消逝波，呈指数级衰减的强度仍然隧道短距离进入波导^18，19。虽然与 TIR 消逝波类似，但 ZMW 消逝波的衰变常数较短，导致波导内的有效激发区域为 10~30 nm。在荧光标记配体的微摩尔浓度下，激发区域内同时存在一个或几个分子。这种对激发体积的限制以及随之而来的背景荧光减少，使单分子在生物学上相关的浓度下能够进行荧光成像。这已应用于许多系统^20，包括FCS测量单一蛋白质扩散^21，单分子FRET测量低亲和力配体蛋白²²和蛋白质-蛋白质相互作用^23，光谱电化学测量单分子周转事件^24。

ZMW是使用离子束铣削^25、26或电子束光刻（EBL）直接对金属层进行图案化而生产的，然后是等离子体蚀刻16、27。这些无面具光刻方法可创建系列波导，通常需要访问专门的纳米制造设施，从而阻止 ZMW 技术的广泛采用。另一种方法，紫外线纳米印花平版印刷升空^28，使用石英滑动模具按反ZMW模板到电阻膜像邮票。虽然这种方法更精简，它仍然需要EBL来制造石英模具。本文介绍了一种简单且廉价的模板制造方法的协议，该方法不需要 EBL 或离子束铣削，并且基于纳米球的紧密包装，以形成平版面罩。

纳米球或"自然"光刻学于1982年由德克曼和邓斯缪尔^29，30首次提出，使用单分散胶体粒子的自组装，从几十纳米到几十微米^31，通过蚀刻和/或材料沉积创建表面图案的模板。二维（2D）或三维（3D）胶体粒子的扩展周期阵列，称为胶体晶体，其特点是散射和衍射³²的明亮虹彩。虽然比电子束或光刻技术应用较少，但这种遮盖方法简单、成本低，而且很容易缩小，以创建低于 100 nm 的功能大小。

指导胶体粒子的自组装决定了使用胶体晶体作为表面图案的面具的成功。如果粒子的大小和形状是同质的，胶体粒子可以很容易地用六边形包装自行组装，由热带耗竭³³驱动。滴涂后水蒸发是沉积胶体颗粒的有效途径，但其他方法包括浸涂^34、旋转涂层^35、电泳沉积³⁶和空气-水界面³⁷的巩固。下面提出的协议基于蒸发沉积方法，这是最简单的实现方法。紧密包装的聚苯乙烯珠之间的三角形间歇形成开口，在开口中镀一个牺牲金属，形成柱子（图2 和 补充图1）。在此步骤调整这些柱子的形状和直径之前，珠子的简短退火。删除珠子，在柱子周围沉积最后一层金属层，然后移除柱子。在两个金属沉积步骤进入胶体纳米瘤、移除中间柱子以及用于钝化和系绳的表面化学修改后，ZMW 阵列已准备好用于单分子成像。在制造后对ZMW光学特性的更广泛描述可以在附下的第³⁸条中找到。除了用于金属蒸汽沉积的热蒸发器外，不需要专门的工具。

研究方案

注:所有步骤都可以在一般实验室空间中完成。

1. 玻璃盖唇清洁

1. 为了提供胶体颗粒蒸发沉积的清洁表面，将 24 x 30 mm 光学玻色硅酸盐玻璃盖片（0.16×0.19 毫米厚度）放置在 coplin 玻璃染色罐的凹槽插入件内进行清洁。
   注意:确保盖唇直立且分离良好，以便在清洁过程中所有表面都清晰暴露。
2. 将足够的丙酮倒入染色罐中，以覆盖盖片、盖上盖子，并在 40 °C 下声波 10 分钟。
3. 倒出丙酮，冲洗盖片，用蒸馏的_H2O填充染色罐，倒出水。再重复 2 次。
4. 再次重复丙酮声波（步骤 1.2 和 1.3）。
5. 将足够的 200 mM KOH 倒入罐中，覆盖覆盖的覆盖唇和声波，在 40 °C 下浇灌 20 分钟。
   注:KOH 稍微蚀刻玻璃。
6. 用蒸馏的 H₂O 冲洗盖片 6 次。
7. 添加乙醇覆盖盖片，添加盖子，并在40°C下声波10分钟。
8. 用蒸馏的 H₂O 冲洗盖片 3 次。
9. 使用柔和的钳子在边缘拾取每个盖片，然后用 N₂ 气体干燥盖唇。只触摸盖片的边缘。将每个干燥、清洁的盖片放在单独清洁的 Petri 盘中。

2. 聚苯乙烯珠的蒸发沉积

1. 要为 ZMW 阵列创建胶体晶体面膜，离心机 50 μL 直径为 1 μm，非功能化聚苯乙烯珠（水中为 2.5% w/v），15，000 x g，25 °C 5 分钟。
   注:在管道珠子之前，应短暂地将库存溶液旋涡，以防珠子沉入瓶底。
2. 丢弃超高超，留下尽可能少的水。
   注:残留水可以改变乙醇再悬念³⁹的蒸发特性，因此去除少量珠子以去除所有水是可以接受的。
3. 从步骤 2.2 中重新使用 2.2 步骤中的珠子，50 μL 为 1:400 TritonX-100:乙醇溶剂。派佩特上下几次，彻底混合珠子与溶剂。
   注:TritonX-100:乙醇溶剂使用后应用石蜡薄膜密封，每月准备一次新鲜。珠子倾向于粘附在塑料容器的两侧，如微中心管，因此移液器沿两侧，以确保所有珠子被重新使用。
4. 要设置一个湿度室进行沉积，将6个Petri菜肴（每个菜都有一个盖片）放在长凳上，内侧的盖子稍稍偏开。在每个菜中，将盖唇移到开放区域，以便在下一步增加湿度时，盖唇暴露在环境中。
5. 放置一个卫生仪和一个小电风扇，以培养皿为中心。
6. 记录实验室中的起始相对湿度 （RH）。将 200 mL 烧饼装满 150 至 200 mL 的 +75 °C 水，并放在风扇后面。
7. 打开风扇，用翻倒的透明塑料存储容器（66 厘米 x 46 厘米 x 38 厘米）盖住 Petri 菜肴、风扇、烧甲和卫生表。
8. 让腔室中的 RH 上升到 70+75%，这通常需要 5~10 分钟。
   注意:如果环境实验室 RH 较低（低于 +50%），请让腔室达到较高的 RH，但不超过 80%，以补偿沉积过程中的湿度损失（见下文）。
9. 当 RH 达到 70+75% 时，记录 RH 并稍微抬起塑料存储容器，以快速将盖子放在 Petri 盘上，从而防止盖片过度湿润。
   注:由于加湿，室内温度将略高于室温，通常为 25°26 °C。如果在表盖上可见水分，则玻璃表面太湿。商业手套箱可能会简化协议的这一部分。
10. 让室内的 RH 继续上升到 85% 。此时，在湿度室中记录 RH，将珠子悬架的移液器 5 μL 记录到每个盖片的中心。
11. 每次沉积后关闭房间和培养皿，以尽量减少湿度损失。目标是在2分钟内完成所有6个证词。
12. 证词后在腔室中记录 RH。
    注:沉积后的RH将有助于测量沉积过程中湿度损失的速度，这取决于环境实验室条件。对于典型的成功运行，腔室将在沉积前以 85% RH 开始，在沉积后以 70+75% RH 结束。
13. 让珠子飞沫扩散干燥5分钟。
    注意:如果胶体晶体有许多孔或多层区域，则腔室可能分别太潮湿或干燥。调整相对湿度，以关闭培养皿并开始沉积（参见结果部分，以进一步讨论优化）。

3. 用于减少胶体晶体模板孔隙大小的珠子退火

1. 为降低聚苯乙烯珠的退火温度，缩小珠间插座，并圆闭盘间角落，在标准陶瓷热板顶部放置一个扁平的磨铝板。
2. 将热板温度设定为107°C，聚苯乙烯玻璃过渡温度^为40°C。
   注:为了获得稳定和准确的温度，在铝板的2~3毫米宽和4~5毫米深的孔中举行了热电偶探针。
3. 将包含珠子模板的盖片放在热铝板上，退火 20s（请参阅讨论部分，解释熔化时间）。
4. 加热后，从铝板上取下盖片，并及时将其放置在另一室温铝表面冷却。
   注:将盖片稍微挂在板的边缘或将浅通道（参见所附视频）插入板中，以方便取回盖唇，这很有帮助。

4. 使用胶体晶体模板对铝零模式波导进行纳米制造

1. 利用热束或电子束蒸发沉积，在胶体晶体模板上以2~s沉积300纳米铜，在珠子之间的隔板中产生柱子。
2. 用胶带轻轻按压表面，去除珠子顶部多余的金属。慢慢剥去胶带，把金属拉下来。
   注意:胶带拉动后，可能会保留一些微小的反射多余金属斑块，这些斑块通常可以通过 N₂ 气体流去除。如果胶带拉动后仍保留大量反射多余的金属，请尝试将模板浸泡在甲苯中 2 小时，以部分溶解聚苯乙烯珠。用蒸馏水清洗盖唇，用_N2干燥，并重复胶带拉。额外的浸泡不应完全溶解珠子，因为珠子有助于保护柱子在胶带拉扯过程中免受损坏。
3. 要溶解聚苯乙烯珠，将珠子模板放入甲苯中，浸泡过夜。
   警告:甲苯烟雾可能是有毒的。在通风良好的罩下使用甲苯，并佩戴个人防护设备，包括手套、安全眼镜和实验室外套。甲苯应储存在指定用于易燃液体的通风柜中。
4. 甲苯孵化后，用氯仿冲洗模板一次，用乙醇冲洗两次。此时小心处理盖片，因为精致的 200-300 nm 高金属柱现在已露出来。用 N₂ 干燥模板，在氧气等离子体清洁剂中去除残留聚合物和污染物 30 分钟。
   警告:氯仿烟雾可能有毒。在通风良好的罩下使用氯仿，并佩戴个人防护设备，包括手套、安全眼镜和实验室外套。氯仿应储存在通风柜中，远离其他易燃溶剂。
5. 使用热束或电子束蒸发沉积，将钛粘附层的 3 纳米沉积在 1 +/s，然后以 4 +/s 左右和铜柱顶部的 100×150 nm 铝沉积。
   注:人们可以使用更厚的包层来获得更深的指导和更好的背景荧光衰减，但这也会降低下一步暴露和溶解帖子后的产量（参见讨论部分）。
6. 要溶解金属柱，将盖片浸泡在铜等（柠檬酸基: 材料表）2 小时。
   警告:金属等损伤可导致皮肤灼伤。在通风良好的罩下处理等，并佩戴防护设备。处理后彻底洗手。金属等应储存在指定用于腐蚀性液体的通风柜中。
7. 用蒸馏水冲洗盖片，用_N2干燥，用透镜纸轻轻擦去金属包层的表面，露出任何仍然覆盖在包层中的柱子。将盖片放回铜等，再放2小时，然后用蒸馏水再次冲洗，用_N2干燥。
   注意:ZMW 滑梯应存储在盖有盖、干净的培养皿中，以使其不含污染物。

5. 使用胶体晶体模板对金零模式波导进行纳米制造

注:本节提供了制造黄金ZMW的方法（补充图1），它反映了制造铝ZMW的协议。

1. 使用热束或电子束蒸发沉积，将 3 纳米的钛粘附层沉积在 1 é/s，然后以 4 é/s 沉积 300 nm 铝。
2. 用胶带轻轻按压表面，去除珠子顶部多余的金属。慢慢剥去胶带，把金属拉下来。
3. 要溶解聚苯乙烯珠，将珠子模板放入甲苯中，浸泡过夜。
4. 甲苯孵化后，用氯仿冲洗模板一次，用乙醇冲洗两次。用 N₂ 干燥模板，在氧气等离子体清洁剂中去除残留聚合物污染物 30 分钟。
5. 使用热束或电子束蒸发沉积，在铝柱周围和顶部以 5 +/s 沉积 100×150 nm 的黄金。
6. 要溶解金属柱，将盖片浸泡在铝等（磷酸基:磷酸基:磷酸基）中浸泡。 材料表）1 小时。
7. 用蒸馏水冲洗盖片，用_N2干燥，用透镜纸轻轻擦去金属包层的表面，露出任何仍然覆盖在包层中的柱子。将盖片放回铝等1小时，然后用蒸馏水再次冲洗，用_N2干燥。
   注:ZMW 幻灯片应存储在盖有盖、干净的培养皿中。

结果

通过蒸发沉积（步骤 2.1+2.13）自组装聚苯乙烯胶体颗粒可以产生一系列结果，因为它需要控制溶剂蒸发率。但是，由于沉积速度很快（每轮 10-15 分钟），因此可以针对不同的环境实验室条件快速优化该过程。 图3A 显示沉积和蒸发后形成良好的胶体模板。从宏观上讲，珠子区域是圆形的，边界由不透明的多层珠环定义。图像中的半透明区域，但不是白色区域是所需的单层区?...

讨论

对于胶体自组装（协议第2节），使用乙醇而不是水作为悬浮溶剂加速蒸发过程，使模板在沉积后2~3分钟准备好，而不是像以前的方法^48，49那样在^1~2小时。这里提出的蒸发沉降协议也比以前的沉降协议简单，需要控制悬浮^{层49、50、51}以上的表面倾斜^、温度和空气体积。本协议中使用?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin glass staining jar	Fisher Scientific	08-817	Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Potassium hydroxide
Petri dishes	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator	Branson	Z245143	Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Desk fan	O2Cool	FD05001A	Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Humidity meter	Fisher Scientific	11-661-19
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Polystyrene microspheres	Polysciences	18602-15	1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate	Fisher Scientific	AA11062RY	Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller	McMaster-Carr	38615K71	Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe	McMaster-Carr	9251T93	Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant	Transene	Type A
Aluminum pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	For electron beam evaporation
Chloroform	Sigma	288306	1 L
Copper etchant	Transene	49-1
Copper pellets	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	For electron beam evaporation
Gold pellets	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	For electron beam evaporation
Lens paper	Thorlabs	MC-5
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Scotch tape	Staples	MMM119
Thin film deposition system	Kurt J. Lesker	PVD-75	Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	For electron beam evaporation
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter	Photometrics, Inc.