Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada açıklanan, nano-mikromolar florofor konsantrasyonlarında tek molekül görüntüleme için metal kaplı cam mikroskopi kapak kapağındaki nanoapertures dizileri olan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemidir. Yöntem, bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal kendi kendine montajdan yararlanır.

Özet

Tek moleküllü floresan enzimolojisinde, çözeltideki etiketli substratlardan gelen arka plan floresanları genellikle florofor konsantrasyonu ile piko- nanomolar aralıkları, birçok fizyolojik ligand konsantrasyonundan daha az büyüklük sırasını sınırlar. Alüminyum veya altın gibi ince iletken bir metalde üretilen 100−200 nm çapında diyafram açıklıkları olan sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen optik nanoyapılar, görünür ışık eksiltmeyi zeptoliter etkili hacimlere hapsederek floroforların mikromoler konsantrasyonlarında tek tek moleküllerin görüntülenmesini sağlar. Bununla birlikte, pahalı ve özel nanofabrikasyon ekipmanına duyulan ihtiyaç, ZMW'lerin yaygın kullanımının önüne geçmektedir. Tipik olarak, ZMWs gibi nanoyapılar, sıralı ve yavaş olan elektron ışını litografisi kullanılarak doğrudan yazılarak elde edilir. Burada kolloidal veya nanosfer litografi, dalga kılavuzu imalatı için nanometre ölçeğinde maskeler oluşturmak için alternatif bir strateji olarak kullanılır. Bu rapor, yaklaşımı her aşama için pratik hususlarla ayrıntılı olarak açıklar. Yöntem, son dalga kılavuzu çapları ve derinlikleri 100−200 nm olan binlerce alüminyum veya altın ZMW'ın paralel olarak yapılmasına izin verir. Metal biriktirme için sadece ortak laboratuvar ekipmanı ve termal evaporatör gereklidir. Bu yöntem, ZMW'leri biyokimyasal topluluk için daha erişilebilir hale getirerek, moleküler süreçlerin hücresel konsantrasyonlarda ve oranlarda incelenmesini kolaylaştırabilir.

Giriş

Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) veya tek moleküllü floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) gibi tek moleküllü teknikler moleküler biyofizik için güçlü araçlardır, transkripsiyon1, 2 ,3, çeviri4,5,6ve diğerleri gibi süreçlerde bireysel biyomoleküllerin dinamik hareketlerinin, konformasyonlarının ve etkileşimlerinin incelenmesine izin verir7. SmFRET için, total iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisi yaygın bir yöntemdir, çünkü birçok bağlı molekül zamanla takip edilebilir ve TIR tarafından oluşturulan evanescent dalgası kapak8'ebitişik 100−200 nm bölgesi ile sınırlıdır. Bununla birlikte, ekscitasyon hacmindeki bu kısıtlamaya rağmen, arka plan floresanının üzerindeki tek molekül sinyallerini tespit etmek için ilgi flüforlarının pM veya nM aralıklarına seyreltilmesi gerekir9. Hücresel enzimlerin Michaelis-Menten sabitleri tipik olarak μM ila mM aralığında10olduğundan, tek molekül çalışmalarında biyokimyasal reaksiyonlar genellikle hücredekilerden çok daha yavaştır. Örneğin, protein sentezi E. coli11 , 12'de saniyede15−20amino asittegerçekleşirken,smFRET deneylerindeki prokaryotik ribozomların çoğu saniyede 0.1−1 amino asitte tercümeedilir 13. Protein sentezinde, duran ribozomlardaki kristal yapılar ve smFRET, transfer RNA'larının (tRNA'lar) tRNA-mRNA translokasyon adımı14,15'denönce 'hibrit' ve 'klasik' durumlar arasında dalgalanarak dalgalandırdığını göstermiştir. Bununla birlikte, translokasyon GTPase faktörüNÜN fizyolojik konsantrasyonları ef-G mevcut olduğunda, smFRET6'damelez ve klasik durumlar arasında orta olan farklı bir konformasyon gözlenmiştir. Dinamik moleküler süreçleri hücredekilere benzer oranlarda ve konsantrasyonlarda incelemek önemlidir, ancak teknik bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Floresan substrat konsantrasyonunu artırmaya yönelik bir strateji,16 diyafram açıklıkları içinde lokalize biyomolekülleri seçici olarak heyecanlandıran sınırlı uyarlama alanları oluşturmak için sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen metal bazlı, alt görünür dalga boyu diyaframlarının kullanılmasıdır (Şekil 1). Diyafram açıklıkları tipik olarak 100−200 nm çapında ve 100−150 nm derinlik17' dir. Kuyuların büyüklüğü ve şekli ile ilgili bir kesme dalga boyunun üzerinde (φc ≈ dielektrik orta 18 olarak su ile dairesel dalga kılavuzları için çapın2,3katı), dalga kılavuzunda yayılma modlarına izin verilmez, bu nedenle sıfır mod dalga kılavuzları terimi. Bununla birlikte, salınımlı bir elektromanyetik alan, evanescent dalgası olarak adlandırılan, yoğunlukta katlanarak çürüyen hala dalga kılavuzuna kısa bir mesafe tüneller18,19. TIR evanescent dalgalarına benzer olmasına rağmen, ZMW evanescent dalgaları daha kısa bir çürüme sabitine sahiptir ve bu da dalga kılavuzu içinde 10−30 nm etkili bir eksitasyon bölgesine neden olur. Floresan etiketli ligandların mikromolar konsantrasyonlarında, ekscitasyon bölgesinde aynı anda sadece bir veya birkaç molekül bulunur. Uyarım hacminin bu şekilde kısıtlanması ve bunun sonucunda arka plan floresanının azaltılması, tek moleküllerin biyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda floresan görüntülenmesini sağlar. Bu, tek protein difüzyon21'inFCS ölçümleri, düşük benzeşimli ligand-protein22'nintek moleküllü FRET ölçümleri ve protein-protein etkileşimleri23 ve tek moleküler devir olaylarının spektro-elektrokimyasal ölçümleri dahil olmak üzere birçoksisteme uygulanmıştır 24.

ZMW'ler, iyon ışın frezeleme25, 26veya elektron ışını litografisi (EBL) ve ardından plazma gravür16,27kullanılarak metal bir tabakanın doğrudan desenlenerek üretilmiştir. Bu maskesiz litografi yöntemleri seri olarak dalga kılavuzları oluşturur ve tipik olarak ZMW teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesini önleyen özel nanofabrikasyon tesislerine erişim gerektirir. Başka bir yöntem, ultraviyole nanoimprint litografi lift-off28, ters bir ZMW şablonunu damga gibi bir direnç filmine bastırmak için kuvars slayt kalıbı kullanır. Bu yöntem daha aerodinamik olsa da, kuvars kalıbının imalatı için hala EBL gerektirir. Bu makalede, EBL veya iyon ışın frezeleme gerektirmeyen ve litografik bir maske oluşturmak için nanosferlerin yakın paketlenmesine dayanan basit ve ucuz şablonlu bir imalat yöntemi için protokol sunulmaktadır.

İlk olarak 1982 yılında Deckman ve Dunsmuir29,30tarafından önerilen nanosfer veya "doğal" litografi, malzemelerin gravür ve / veya biriktirme yoluyla yüzey deseni için şablonlar oluşturmak için onlarca nanometreden onlarca mikrometre31'ekadar değişen monodisperz kolloidal parçacıkların kendi kendine montajını kullanır. Kolloidal kristaller olarak adlandırılan kolloidal parçacıkların iki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) genişletilmiş periyodik dizileri, saçılma ve kırınım32'denparlak bir yanardönerlik ile karakterize edilir. Elektron ışını veya fotolitografiden daha az yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu maskeleme metodolojisi basit, düşük maliyetlidir ve 100 nm'nin altında özellik boyutları oluşturmak için kolayca ölçeklendirilir.

Kolloidal parçacıkların kendi kendine birliğini yönlendirmek, kolloidal kristallerin yüzey desenleme için maske olarak kullanılmasının başarısını belirler. Parçacıkların boyutu ve şekli homojen ise, kolloidal parçacıklar entropik tükenme33tarafından tahrik edilen altıgen ambalaj ile kolayca kendi kendine monte edilebilir. Damla kaplamadan sonra su buharlaşması kolloidal parçacıkları tortulamak için etkili bir yoldur, ancak diğer yöntemler daldırmakaplama 34, spin kaplama35, elektroforetik biriktirme36ve hava-su arayüzünde konsolidasyon37içerir. Aşağıda sunulan protokol, uygulanması en basit olan buharlaşma sedimasyon yöntemine dayanmaktadır. Üçgen, yakın paketlenmiş polistiren boncuklar arasındaki kesişmeler, kurbanlık bir metalin kaplanacağı açıklıklar oluşturur, direkler oluşturur (Şekil 2 ve Ek Şekil 1). Bu adımdan önce boncukların kısa tavlanması, bu direklerin şeklini ve çapını ayarlar. Boncuklar çıkarılır, direklerin etrafına son bir metal tabaka biriktirilir ve ardından direkler kaldırılır. kolloidal nanoküme, ara direklerin çıkarılması ve pasivasyon ve bağlama için yüzey kimyası modifikasyonu üzerine iki metal biriktirme adımından sonra, ZMW dizileri tek molekül görüntüleme için kullanıma hazırdır. İmalat sonrası ZMW optik özelliklerinin daha kapsamlı karakterizasyonu, eşlik eden bir makalede bulunabilir38. Metallerin buhar biriktirmesi için bir termal evaporatör dışında, özel bir alet gerekmez.

Protokol

NOT: Tüm adımlar genel laboratuvar alanında tamamlanabilir.

1. Cam kapak temizliği

  1. Kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı birikmesi için temiz bir yüzey sağlamak için, temizlik için coplin cam boyama kavanozunun yivli kesici uçlarına 24 x 30 mm optik borosilikat cam kapak örtüleri (0,16−0,19 mm kalınlık) yerleştirin.
    NOT: Temizlik işlemi sırasında tüm yüzeylerin net bir şekilde açığa çıkması için kapakların dik durduğundan ve iyi ayrıldığından emin olun.
  2. Boyama kavanozuna örtüleri örtecek, kapağı yerize edecek ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate edecek kadar aseton dökün.
  3. Asetonu dökün ve boyama kavanozuna damıtılmış H2O doldurup suyu dökerek kapakları durulayın. 2 kez daha tekrarlayın.
  4. Aseton sonication (adım 1.2 ve 1.3) bir kez daha tekrarlayın.
  5. 40 ° C'de 20 dakika boyunca örtüleri ve sonikatı kaplayacak kadar kavanoza 200 mM KOH dökün.
    NOT: KOH camı hafifçe etches.
  6. Kapakları damıtılmış H 2 Oile 6kez durulayın.
  7. Kapakları örtmek için etanol ekleyin, kapağı ekleyin ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate.
  8. Kapakları damıtılmış H ile2O 3 kez durulayın.
  9. Yumuşak tokparlaplar kullanarak her kapak kapağını kenardan alın ve kapakları N2 gazı ile kurutun. Sadece kapak ucunun kenarlarına dokunun. Kurutulmuş, temizlenmiş kapak örtülerinin her birini ayrı bir temiz Petri kabına yerleştirin.

2. Polistiren boncukların buharlaştırıcı birikmesi

  1. ZMW dizisi için kolloidal kristal maske oluşturmak için, 1 μm çapında 50 μL santrifüj, 15.000 x g,25 °C'de 5 dakika boyunca işlevsel olmayan polistiren boncuklar (suda% 2,5 w/ v).
    NOT: Boncukları pipetlemeden önce, boncukların şişenin dibine yerleşmesi durumunda stok çözeltisi kısa bir süre girdaplanmalıdır.
  2. Mümkün olduğunca az su bırakarak süpernatant atın.
    NOT: Artık su etanol resüspenzyon39buharlaşma özelliklerini değiştirebilir, bu nedenle tüm suyu çıkarmak için az miktarda boncuk çıkarılması kabul edilebilir.
  3. Boncukları adım 2.2'den 1:400 TritonX-100:etanol çözücünün 50 μL'sinde yeniden atın. Pipet, boncukları çözücü ile iyice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı.
    NOT: TritonX-100:etanol çözücü kullanımdan sonra parafin filmi ile kapatılmalı ve ayda bir kez taze olarak hazırlanmalıdır. Boncuklar, mikrosantrifüj tüpü gibi plastik bir kabın kenarlarına yapışma eğilimindedir, bu nedenle tüm boncukların yeniden dirilmesini sağlamak için yanlar boyunca pipet.
  4. Biriktirme için bir nem odası kurmak için, her biri bir kapaklı 6 Petri kabını, kapakları biraz aralık bırakılmış bir çizgide bir bankın üzerine yerleştirin. Her yemekte, bir sonraki adımda nem arttığında kapak örtülerinin ortama maruz kalabilmesi için kapakçığı açık bölgeye taşıyın.
  5. Petri tabaklarının arkasına bir higrometre ve küçük bir elektrikli fan yerleştirin.
  6. Laboratuvarda başlangıç bağıl nemini (RH) kaydedin. 200 mL'lik bir kabı 150−200 mL ~75 °C su ile doldurun ve fanın arkasına yerleştirin.
  7. Fanı açın ve Petri kaplarını, fanı, kabı ve higrometreyi devrilmiş, şeffaf bir plastik saklama kabıyla (66 cm x 46 cm x 38 cm) örtün.
  8. Haznedeki RH'nin %70−75'e yükselmesine izin verin, bu da tipik olarak 5−10 dakika sürer.
    NOT: Ortam laboratuvarı RH'si düşükse (~%50'nin altında), biriktirme sırasındaki nem kaybını telafi etmek için odanın daha yüksek bir RH'ye ulaşmasını, ancak% 80'den yüksek olmamasını sağlar (aşağıya bakın).
  9. RH% 70−75'e ulaştığında, RH'yi kaydedin ve plastik saklama kabını hafifçe kaldırarak petri kaplarına kapakları hızlı bir şekilde yerleştirin, bu da kapakların aşırı ıslanmasını önler.
    NOT: Haznedeki sıcaklık, nemlendirme sonucu oda sıcaklığından biraz daha sıcak olacaktır, tipik olarak 25−26 °C. Kapaklarda nem görünüyorsa, cam yüzeyler çok ıslaktır. Ticari bir torpido gözü protokolün bu bölümünü basitleştirebilir.
  10. Odadaki RH%85'e yükselmeye devam etsin. Bu noktada, RH'yi nem haznesine kaydedin ve boncuk süspansiyonunun pipeti 5 μL'yi her kapak kapağının ortasına kaydedin.
  11. Nem kaybını en aza indirmek için her biriktirmeden sonra odayı ve Petri tabaklarını kapatın. 2 dakika içinde tüm 6 ifadeleri bitirmek hedefleyin.
  12. İfadeden sonra RH'yı hazneye kaydedin.
    NOT: Biriktirmeden sonraki RH, ortam laboratuvarı koşullarına bağlı olarak biriktirme sırasında nemin ne kadar hızlı kaybolduğunu ölçmeye yardımcı olacaktır. Tipik bir başarılı çalışma için, oda ifadeden önce% 85 RH'den başlayacak ve ifadeden sonra% 70−75 RH'de sona erecektir.
  13. Boncuk damlacıklarının yayılmasına ve 5 dakika kurumasına izin verin.
    NOT: Kolloidal kristallerin çok sayıda deliği veya çok katmanlı bölgesi varsa, oda sırasıyla çok nemli veya kuruydu. Petri kaplarını kapatmak ve ifadelere başlamak için bağıl nemi ayarlayın (optimizasyonun daha fazla tartışılması için sonuçlar bölümüne bakın).

3. Kolloidal kristal şablonunda gözenek boyutunu azaltmak için boncuk tavlama

  1. Boncuklar arası kesişme yerlerini daraltan ve interstices'in köşelerini yuvarlayan polistiren boncukların tavlama için düzgün bir sıcaklık yüzeyi sağlamak için, standart bir seramik sıcak plakanın üzerine düz, öğütülmüş bir alüminyum plaka yerleştirin.
  2. Sıcak plakanın sıcaklığını 107 °C'ye, polistirenin cam geçiş sıcaklığını40'aayarlayın.
    NOT: Kararlı ve doğru sıcaklık elde etmek için alüminyum plakada 2−3 mm genişliğinde ve 4−5 mm derinliğinde bir delikte bir termokuple probu tutulmuş.
  3. Sıcak alüminyum plakaya boncuk şablonunun ve 20 sn tavlamanın üzerine boncuk şablonunun bulunduğu bir kapak ucu yerleştirin (erime süresinin açıklanması için tartışma bölümüne bakın).
  4. Isıttıktan sonra, kapak kapağını alüminyum plakadan çıkarın ve soğutmak için derhal başka bir oda sıcaklığındaki alüminyum yüzeye yerleştirin.
    NOT: Kapakların teslim alımını kolaylaştırmak için kapak kapaklarının plakanın kenarına hafifçe asması veya sığ kanalları (beraberindeki videoya bakın) plakaya asması yararlıdır.

4. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak alüminyum sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu

  1. Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, boncuklar arasındaki kafeslerde direkler oluşturmak için kolloidal kristal şablonun üzerine 2 Å/sn'de 300 nm bakır biriktirin.
  2. Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun.
    NOT: Bant çekildikten sonra bazı küçük yansıtıcı fazla metal lekeleri kalabilir ve bunlar genellikle N2 gazı akışı ile çıkarılabilir. Bant çekildikten sonra önemli yansıtıcı fazla metal lekeleri kalırsa, polistiren boncukları kısmen çözmek için şablonları 2 saat boyunca toluen içine çekmeyi deneyin. Kapakları damıtılmış suyla yıkayın, N2ile kurulayın ve bant çekmesini tekrarlayın. Boncuklar bant çekme sırasında direkleri hasardan korumaya yardımcı olduğu için ek ıslatma boncukları tamamen çözmemelidir.
  3. Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın.
    DİkKAT: Toluen dumanı toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında toluen ile çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Toluen yanıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.
  4. Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Hassas 200−300 nm boyundaki metal direkler artık açığa çıktığı için bu noktada kapak örtülerini dikkatlice tutturun. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer ve kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın.
    DİkKAT: Kloroform dumanlar toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında kloroformla çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Kloroform, diğer yanıcı çözücülerden uzakta havalandırılmış dolaplarda saklanmalıdır.
  5. Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından bakır direklerin etrafında ve üstünde 4 Å/s'de 100−150 nm alüminyum biriktirin.
    NOT: Daha derin kılavuzlar ve arka plan floresanının daha iyi zayıflamasını elde etmek için daha kalın kaplamalar kullanılabilir, ancak bu aynı zamanda bir sonraki adımda gönderileri açığa çıkardıktan ve çözdükten sonra verimi azaltır (tartışma bölümüne bakın).
  6. Metal direkleri çözmek için, kapakları bakır etchant (sitrik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 2 saat boyunca.
    DİkKAT: Metal etchant cilt yanıklara neden olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında etchantlarla çalışın ve koruyucu ekipman giyin. Elleçlemeden sonra ellerinizi iyice yıkayın. Metal etchant, aşındırıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.
  7. Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 2 saat daha bakır vbhant içine yerleştirin, sonra damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın.
    NOT: ZMW slaytlar, kirleticilerden uzak tutmak için kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.

5. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak altın sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu

NOT: Alüminyum ZMWs imal protokolü yansıtan altın ZMWs(Ek Şekil 1)imal yöntemi bu bölümde verilmiştir.

  1. Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından 4 Å/s'de 300 nm alüminyum biriktirin.
  2. Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun.
  3. Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın.
  4. Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın.
  5. Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirmeyi kullanarak, alüminyum direklerin etrafında ve üstünde 5 Å/s'de 100−150 nm altın biriktirin.
  6. Metal direkleri çözmek için, kapakları alüminyum etchant (fosforik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 1 saat boyunca.
  7. Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 1 saat boyunca alüminyum vbhant içine geri yerleştirin, ardından damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın.
    NOT: ZMW slaytlar kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.

Sonuçlar

Polistiren kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı sedimansasyon yoluyla kendi kendine montajı (adım 2.1−2.13), çözücü buharlaşma hızının kontrol edilmesi gerektirdiğinden bir dizi sonuç üretebilir. Bununla birlikte, ifadeler hızlı olduğundan (tur başına 10−15 dk), prosedür farklı ortam laboratuvarı koşulları için hızlı bir şekilde optimize edilebilir. Şekil 3A, biriktirme ve buharlaşmadan sonra iyi biçimlendirilmiş bir kolloidal şablon gösterir. Ma...

Tartışmalar

Kolloidal kendi kendine montaj için (protokol bölüm 2), süspansiyon çözücü olarak su yerine etanol kullanımı buharlaşma işlemini hızlandırır, böylece şablonlar önceki yöntemlerde olduğu gibi 1−2 saat yerine 2−3 dakika içinde hazırlanır48,49. Burada sunulan evaporatif sedimentasyon protokolü, süspansiyon49,50,51'inüzerindeki yüzey eğimini, sıcaklığı ve hava ha...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH hibeleri R01GM080376, R35GM118139 ve NSF Mühendislik Merkezi MechanoBiology CMMI: 15-48571'den Y.E.G.'ye ve NIAID doktora öncesi NRSA bursu F30AI114187'den R.M.J.'ye desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Glass Coverslip Cleaning
AcetoneSigma322011 L
Coplin glass staining jarFisher Scientific08-817Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
CoverslipsVWR48404-46724 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
EthanolSigmaE70231 L
KOHSigma30603Potassium hydroxide
Petri dishesFisher ScientificR80115TS100 mm diameter, 15 mm deep
SonicatorBransonZ245143Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage containerFisher Scientific50-110-822226 x 18 x 15 in.
Desk fanO2CoolFD05001AAny small desk (~5 in.) fan will work
Glass beakerFisher Scientific02-555-25B250 mL
Humidity meterFisher Scientific11-661-19
Microcentrifuge tubesFisher Scientific21-402-9031.5 mL
Polystyrene microspheresPolysciences18602-151.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgentSigmaX100100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plateFisher ScientificAA11062RYCustomized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplateFisher ScientificHP8885710013 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controllerMcMaster-Carr38615K71Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probeMcMaster-Carr9251T93Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchantTranseneType A
Aluminum pelletsKurt J. LeskerEVMAL40QXHBFor electron beam evaporation
ChloroformSigma2883061 L
Copper etchantTransene49-1
Copper pelletsKurt J. LeskerEVMCU40QXQAFor electron beam evaporation
Gold pelletsKurt J. LeskerEVMAUXX40GFor electron beam evaporation
Lens paperThorlabsMC-5
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Scotch tapeStaplesMMM119
Thin film deposition systemKurt J. LeskerPVD-75Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pelletsKurt J. LeskerEVMTI45QXQAFor electron beam evaporation
TolueneSigma2445111 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling SoftwareCOMSOL, Inc.
Dual View spectral splitterPhotometrics, Inc.

Referanslar

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. . Electromagnetism. , (2002).
  19. Jackson, J. D. . Classical electrodynamics. Third edition. , (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v. Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 159s f r mod dalga k lavuzlarnano diyaframtek molek l floresannanosfer litografikolloidal kristalkendi kendine montaj

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır