АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь описан метод наносферной литографии для параллельного изготовления волноводов нулевого режима, которые представляют собой массивы наноапертур в покрытой металлом стеклянной микроскопии для визуализации одной молекулы при нано- и микромолярных концентрациях флуорофоров. Метод использует преимущества самосборки коллоидных кристаллов для создания шаблона волноводов.

Аннотация

В одномолекулярной флуоресцентной энзимологии фоновая флуоресценция от меченых субстратов в растворе часто ограничивает концентрацию флуорофора пико- на наномолярными диапазонами, что на несколько порядков меньше, чем многие физиологические концентрации лигандов. Оптические наноструктуры, называемые волноводами нулевого режима (ZMW), которые представляют собой отверстия диаметром 100−200 нм, изготовленные из тонкого проводящего металла, такого как алюминий или золото, позволяют визуалировать отдельные молекулы при микромолярных концентрациях флуорофоров, ограничивая возбуждение видимого света эффективными объемами зептолита. Однако потребность в дорогостоящем и специализированном оборудовании для нанопроизводства исключила широкое использование ZMW. Как правило, наноструктуры, такие как ZMW, получают путем прямой записи с использованием электронно-лучевой литографии, которая является последовательной и медленной. Здесь коллоидная, или наносферная, литография используется в качестве альтернативной стратегии создания нанометровых масок для изготовления волноводов. В настоящем докладе подробно описывается этот подход с практическими соображениями для каждого этапа. Метод позволяет параллельно изготавливать тысячи алюминиевых или золотых ЗМВт с конечными диаметрами волноводов и глубиной 100−200 нм. Требуется только обычное лабораторное оборудование и термический испаритель для осаждения металла. Делая ZMW более доступными для биохимического сообщества, этот метод может облегчить изучение молекулярных процессов в клеточных концентрациях и скоростях.

Введение

Одномолекулярные методы, такие как одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) или одномолекулярная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), являются мощными инструментами для молекулярной биофизики, позволяющими изучать динамические движения, конформации и взаимодействия отдельных биомолекул в таких процессах, как транскрипция1,2,3,трансляция4,5,6и многие другие7. Для smFRET микроскопия полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) является распространенным методом, поскольку многие привязанные молекулы могут наблюдаться с течением времени, а испаряющаяся волна, генерируемая TIR, ограничена областью 100-200 нм, прилегающей к покровному листу8. Однако даже при таком ограничении объема возбуждения интересующий флуорофоры все равно необходимо разбавлять до диапазонов pM или nM, чтобы обнаружить сигналы одной молекулы выше фоновой флуоресценции9. Поскольку константы Михаэлиса-Ментена клеточных ферментов обычно находятся в диапазоне от мкМ домМ 10,биохимические реакции в исследованиях одной молекулы обычно намного медленнее, чем в клетке. Например, синтез белка происходит со скоростью 15−20 аминокислот в секунду у E. coli11,12,в то время как большинство прокариотических рибосом в экспериментах smFRET переводят на 0,1−1 аминокислоту в секунду13. В синтезе белка кристаллические структуры и smFRET на застопорившихся рибосомах показали, что трансферные РНК (тРНК) колеблются между «гибридным» и «классическим» состояниями до этапа транслокации тРНК-мРНК14,15. Однако при наличии физиологических концентраций транслокационного фактора ГТФазы, EF-G, в smFRET6наблюдалась иная конформация, промежуточная между гибридным и классическим состояниями. Изучение динамических молекулярных процессов со скоростью и концентрациями, аналогичными тем, которые происходят в клетке, важно, но остается технической проблемой.

Стратегия увеличения концентрации флуоресцентной подложки заключается в использовании субзримых апертур на основе металлов, называемых волноводами нулевого режима (ZMW), для создания ограниченных полей возбуждения, которые селективно возбуждают биомолекулы, локализованные в отверстиях16 (рисунок 1). Отверстия обычно имеют диаметр 100−200 нм и глубину 17 мм100−150нм. Выше длины волны отсечки, связанной с размером и формой скважин (λc ≈ в 2,3 раза больше диаметра для круговых волноводов с водой в качестве диэлектрической среды18),в волноводе не допускаются режимы распространения, отсюда и термин волноводы нулевого режима. Однако колеблющееся электромагнитное поле, названное испаряющейся волной, экспоненциально распадающейся по интенсивности, все еще туннелирует на небольшом расстоянии в волновод18,19. Несмотря на сходство с испаряющимися волнами МДП, испаряющиеся волны ZMW имеют более короткую постоянную распада, что приводит к эффективной области возбуждения 10−30 нм в волноводе. При микромолярных концентрациях флуоресцентно меченых лигандов в области возбуждения одновременно присутствует только одна или несколько молекул. Это ограничение объема возбуждения и последующее уменьшение фоновой флуоресценции позволяет флуоресцентно визуализировать отдельные молекулы в биологически значимых концентрациях. Это было применено ко многим системам20,включая измерения FCS диффузии одного белка21,измерения одной молекулы FRET низкородных лиганд-белковых22 и белково-белковых взаимодействий23и спектроэлектрохимические измерения событий одиночного молекулярного оборота24.

ZMW были получены путем непосредственного рисунка металлического слоя с использованием ионно-лучевого фрезерования25,26 или электронно-лучевой литографии (EBL) с последующим плазменным травлением16,27. Эти методы бесмаскировочной литографии создают волноводы последовательно и, как правило, требуют доступа к специализированным установкам нанопроизводства, что препятствует широкому внедрению технологии ZMW. Другой метод, ультрафиолетовая наноимпринтная литография lift-off28,использует кварцевую скользящую форму для прессования обратного шаблона ZMW на резистивную пленку, такую как штамп. Хотя этот метод более упрощен, он по-прежнему требует EBL для изготовления кварцевой формы. В данной статье представлен протокол для простого и недорогого шаблонного метода изготовления, который не требует EBL или ионно-лучевого фрезерования и основан на тесной упаковке наносфер для формирования литографической маски.

Наносферная или «естественная» литография, которая была впервые предложена в 1982 году Декманом и Дансмуиром29,30,использует самосборку монодисперсных коллоидных частиц, начиная от десятков нанометров до десятков микрометров31,для создания шаблонов для моделирования поверхности путем травления и / или осаждения материалов. Двумерные (2D) или трехмерные (3D) расширенные периодические массивы коллоидных частиц, называемые коллоидными кристаллами, характеризуются яркой радужной радужностью от рассеяния и дифракции32. Хотя эта методология маскировки используется менее широко, чем электронно-лучевая или фотолитография, она проста, недорога и легко масштабируется для создания размеров объектов ниже 100 нм.

Направление самосборки коллоидных частиц определяет успех использования коллоидных кристаллов в качестве масок для поверхностного рисунка. Если размер и форма частиц однородны, коллоидные частицы могут быть легко собраны с помощью гексагональной упаковки, вызванной энтропийным истощением33. Испарение воды после капельного покрытия является эффективным путем к осаждению коллоидных частиц, хотя другие способы включают погружное покрытие34,спиновое покрытие35,электрофоретическое осаждение36и консолидацию на границераздела 37воздух-вода. Протокол, представленный ниже, основан на методе испарения седиментации, который был самым простым в реализации. Треугольные промежутки между плотно упакованными полистирольными шариками образуют отверстия, в которых можно облицовать жертвенный металл, формируя столбы(рисунок 2 и дополнительный рисунок 1). Краткий отжиг бусин перед этим этапом корректирует форму и диаметр этих стоек. Бусины удаляются, вокруг столбов наносится окончательный металлический слой, а затем столбы удаляются. После двух ступеней осаждения металла на коллоидную наномаску, удаления промежуточных столбов и модификации химического состава поверхности для пассивации и привязки массивы ZMW готовы к использованию для визуализации одной молекулы. Более обширную характеристику оптических свойств ZMW после изготовления можно найти в сопроводительной статье38. Кроме термического испарителя для осаждения металлов из пара, никаких специализированных инструментов не требуется.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги могут быть выполнены в общем лабораторном пространстве.

1. Очистка стеклянных крышек

  1. Для обеспечения чистой поверхности для испарительного осаждения коллоидных частиц поместите 24 x 30 мм оптических боросиликатных стеклянных покровов (толщиной 0,16−0,19 мм) в рифленые вставки витражной банки для очистки коплинского стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что крышки стоят вертикально и хорошо разделены, чтобы все поверхности были четко открыты во время процесса очистки.
  2. Налейте достаточно ацетона в банку для окрашивания, чтобы покрыть крышки, поместите крышку и обжарьте ультразвуком в течение 10 минут при 40 °C.
  3. Вылейте ацетон и промойте крышки, заполнив банку для окрашивания дистиллированнойH2O и вылив воду. Повторите еще 2 раза.
  4. Повторите ацетоновую ультразвуковую обивку (шаги 1.2 и 1.3) еще раз.
  5. Вылейте достаточно 200 мМ KOH в банку, чтобы покрыть крышки и ультразвуком, покрытым, в течение 20 мин при 40 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: KOH слегка вытряхывает стекло.
  6. Промойте крышки дистиллированной H2O 6 раз.
  7. Добавьте этанол, чтобы покрыть крышки, добавьте крышку и соник в течение 10 мин при 40 °C.
  8. Промойте крышки дистиллированнойH2O 3 раза.
  9. Подберите каждый обтеканий по краю с помощью мягких щипцов и высушите крышки газом N2. Касайтесь только краев крышки. Поместите каждый из высушенных, очищенных крытых липов в индивидуальную чистую чашку Петри.

2. Испарительное осаждение полистирольных шариков

  1. Для создания коллоидной кристаллической маски для массива ZMW центрифуга диаметром 50 мкл диаметром 1 мкм, нефункционализированные полистирольные шарики (2,5% мас./об.в воде) при 15 000 х г,25 °C в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед пипеткой бусин следует кратковременно вихрь булавочного раствора на случай, если бусины осядят на дно бутылки.
  2. Выбросьте супернатант, оставив как можно меньше воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточная вода может изменять свойства испарения этанола39,поэтому удаление небольшого количества шариков с целью удаления всей воды является приемлемым.
  3. Повторно суспендирует шарики со ступени 2.2 в 50 мкл растворителя 1:400 TritonX-100:этанол. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы тщательно смешать шарики с растворителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворитель ТритонХ-100:этанол следует запечатывать парафиновой пленкой после использования и готовить свежим один раз в месяц. Бусины, как правило, прилипают к сторонам пластикового сосуда, такого как трубка микроцентрифуги, поэтому пипетка по бокам гарантирует, что все бусины будут повторно суспендированы.
  4. Чтобы установить камеру влажности для осаждения, поместите 6 чашек Петри, каждая с одним чехлом, на скамейку в линию с крышками, оставленными слегка приоткрытыми. В каждой посуде переместите крышку в открытую область, чтобы крышки подвергались воздействию окружающей среды при повышении влажности на следующем этапе.
  5. Поместите гигрометр и небольшой электрический вентилятор в центре за чашками Петри.
  6. Запишите начальную относительную влажность (RH) в лаборатории. Наполните 200 мл воды 150−200 мл ~ 75 °C и поместите его за вентилятор.
  7. Включите вентилятор и накройте чашку Петри, вентилятор, замок и гигрометр перевернутым прозрачным пластиковым контейнером для хранения (66 см х 46 см х 38 см).
  8. Пусть RH в камере поднимется до 70−75%, что обычно занимает 5−10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если относительная влажность окружающей среды в лаборатории низкая (ниже ~50%), пусть камера достигает более высокой относительной влажности, но не выше 80%, чтобы компенсировать потерю влажности во время осаждения (см. Ниже).
  9. Когда RH достигнет 70−75%, запишите RH и слегка поднимите пластиковый контейнер для хранения, чтобы быстро разместить крышки на чашках Петри, что предотвращает чрезмерное смачивание крышек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура в камере будет немного теплее, чем комнатная температура, обычно 25−26 °C, в результате увлажнения. Если на обложек видна влага, то стеклянные поверхности слишком влажные. Коммерческий бардачок может упростить эту часть протокола.
  10. Пусть RH в камере продолжит расти до 85%. В этот момент запишите RH в камеру влажности и пипетку 5 мкл суспензии бусины на центр каждого крышки.
  11. Закрывайте камеру и чашки Петри после каждого осаждения, чтобы свести к минимуму потерю влажности. Постарайтесь закончить все 6 осаждений в течение 2 минут.
  12. Запишите RH в камере после осаждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Rh после осаждения поможет оценить, насколько быстро влажность была потеряна во время осаждения, что зависит от условий окружающей среды. Для типичного успешного запуска камера будет начинаться с 85% RH до осаждения и заканчиваться при 70-75% RH после осаждения.
  13. Дайте шарикам растекатся и высохнет в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если коллоидные кристаллы имеют много отверстий или многослойных областей, то камера, вероятно, была слишком влажной или сухой соответственно. Отрегулируйте относительную влажность, при которой закрываются чашки Петри и начинается осаждение (см. раздел результатов для дальнейшего обсуждения оптимизации).

3. Отжиг бусин для уменьшения размера пор в коллоидном кристаллическом шаблоне

  1. Чтобы обеспечить равномерную температурную поверхность для отжига полистирольных шариков, которая сужает межшковые межшковые межударные межударные углы и закругляет углы интерстиков, поместите плоскую, фрезерованную алюминиевую пластину поверх стандартной керамической конфорки.
  2. Установите температуру конфорки на 107 °C, температуру стеклопротека полистирола40.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения стабильной и точной температуры термопарный зонд проводили в отверстии шириной 2−3 мм и глубиной 4−5 мм в алюминиевой пластине.
  3. Поместите крышку, содержащую шаблон бусины, на горячую алюминиевую пластину и отжиг в течение 20 с (см. раздел обсуждения для объяснения времени плавления).
  4. После нагрева снимите крышку с алюминиевой пластины и быстро поместите ее на алюминиевую поверхность другой комнатной температуры, чтобы охладить ее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно либо слегка повесить крышки над краем пластины, либо перемешивать неглубокие каналы (см. прилагаемое видео) в пластину, чтобы облегчить подбор крышек.

4. Нанофабрикация алюминиевых волноводов нулевого режима с использованием коллоидного кристаллического шаблона

  1. Используя тепловое или электронно-лучевое испарительное осаждение, нанесите 300 нм меди со скоростью 2 Å/с на коллоидный кристаллический шаблон для создания столбов в промежутках между шариками.
  2. Удалите лишний металл сверху бусин, аккуратно прижав поверхность скотчем. Медленно снимите ленту, чтобы оттянуть металл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые небольшие пятна отражающего избытка металла могут остаться после натяжения ленты, и они часто могут быть удалены потоком газа N2. Если после вытягивания ленты остаются значительные пятна отражающего избытка металла, попробуйте замочить шаблоны в толуоле в течение 2 ч, чтобы частично растворить полистирольные шарики. Вымойте обтекаемы дистиллированной водой, высушитеn2и повторите потягивание ленты. Дополнительное замачивание не должно полностью растворять бусины, так как бусины помогают защитить стойки от повреждений во время натяжения ленты.
  3. Чтобы растворить полистирольные шарики, поместите шаблоны бусин в толуол и замочите на ночь.
    ВНИМАНИЕ: Пары толуола могут быть токсичными. Работайте с толуолом под хорошо проветриваемым капюшоном и носите средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защитные очки и лабораторное покрытие. Толуол следует хранить в вентилируемых шкафах, предназначенных для легковоспламеняющихся жидкостей.
  4. После инкубации толуола промыть шаблоны один раз хлороформом и дважды этанолом. В этот момент осторожно обрабатывайте крышки, потому что теперь открыты тонкие металлические стойки высотой 200−300 нм. Высушите шаблоныN2 и удалите остаточный полимер и загрязняющие вещества в кислородно-плазменном очистителем в течение 30 мин.
    ВНИМАНИЕ: Пары хлороформа могут быть токсичными. Работайте с хлороформом под хорошо проветриваемым капюшоном и носите средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Хлороформ следует хранить в вентилируемых шкафах вдали от других легковоспламеняющихся растворителей.
  5. Используя тепловое или электронно-лучевое испарительное осаждение, нанесите 3 нм слоя адгезии титана при 1 Å/с, а затем 100−150 нм алюминия при 4 Å/с вокруг и поверх медных столбов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать более толстую облицовку для получения более глубоких направляющих и лучшего затухания фоновой флуоресценции, но это также уменьшает выход после экспонирования и растворения столбов на следующем этапе (см. раздел обсуждения).
  6. Для растворения металлических столбов замочите крышки в медном травленте (на основе лимонной кислоты; Таблица материалов) в течение 2 ч.
    ВНИМАНИЕ: Металлический травильный материал может вызвать ожоги кожи. Работайте с травильонами под хорошо проветриваемым капотом и носите защитные средства. Тщательно вымойте руки после обработки. Металлический травиль следует хранить в вентилируемых шкафах, предназначенных для агрессивных жидкостей.
  7. Промойте крышки дистиллированной водой, высушитеn2и аккуратно облицовите поверхность металлической облицовки бумагой для линз, чтобы обнажить любые столбы, которые все еще покрыты облицовкой. Поместите крышки обратно в медный травил еще на 2 ч, затем снова промойте дистиллированной водой и высушитеN2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды ZMW следует хранить в закрытых, чистых чашках Петри, чтобы они не загрязняли их.

5. Нанофабрикация волноводов нулевого режима золота с использованием коллоидного кристаллического шаблона

ПРИМЕЧАНИЕ: Способ изготовления золотых ZMW(дополнительный рисунок 1),который отражает протокол изготовления алюминиевых ZMW, приведен в этом разделе.

  1. Используя тепловое или электронно-лучевое испарительное осаждение, нанесите 3 нм слоя адгезии титана при 1 Å/с, а затем 300 нм алюминия при 4 Å/s.
  2. Удалите лишний металл сверху бусин, аккуратно прижав поверхность скотчем. Медленно снимите ленту, чтобы оттянуть металл.
  3. Чтобы растворить полистирольные шарики, поместите шаблоны бусин в толуол и замочите на ночь.
  4. После инкубации толуола промыть шаблоны один раз хлороформом и дважды этанолом. Высушите шаблоныN2 и удалите остаточные полимерные загрязнения в кислородно-плазменном очистителем в течение 30 мин.
  5. Используя тепловое или электронно-лучевое испарительное осаждение, нанесите 100−150 нм золота со скоростью 5 Å/s вокруг и поверх алюминиевых столбов.
  6. Для растворения металлических столбов замочите крышки в алюминиевом травленте (на основе фосфорной кислоты; Таблица материалов) в течение 1 ч.
  7. Промойте крышки дистиллированной водой, высушитеn2и аккуратно облицовите поверхность металлической облицовки бумагой для линз, чтобы обнажить любые столбы, которые все еще покрыты облицовкой. Поместите крышки обратно в алюминиевый травил на 1 ч, затем снова промойте дистиллированной водой и высушитеN2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды ZMW следует хранить в закрытых, чистых чашках Петри.

Результаты

Самосборка коллоидных частиц полистирола путем испарительного осаждения (этапы 2.1−2.13) может дать ряд результатов, поскольку требует контроля скорости испарения растворителя. Однако, поскольку осаждение является быстрым (10−15 мин на раунд), процедура может быть быстро оптимизирована д...

Обсуждение

Для коллоидной самосборки (раздел протокола 2) использование этанола, а не воды в качестве суспензионного растворителя ускоряет процесс испарения таким образом, что шаблоны готовы через 2−3 мин после осаждения, а не через 1−2 ч, как в предыдущих способах48,49.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH R01GM080376, R35GM118139 и NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 to Y.E.G., а также преддокторской стипендией NIAID NRSA F30AI114187 для R.M.J.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Glass Coverslip Cleaning
AcetoneSigma322011 L
Coplin glass staining jarFisher Scientific08-817Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
CoverslipsVWR48404-46724 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
EthanolSigmaE70231 L
KOHSigma30603Potassium hydroxide
Petri dishesFisher ScientificR80115TS100 mm diameter, 15 mm deep
SonicatorBransonZ245143Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage containerFisher Scientific50-110-822226 x 18 x 15 in.
Desk fanO2CoolFD05001AAny small desk (~5 in.) fan will work
Glass beakerFisher Scientific02-555-25B250 mL
Humidity meterFisher Scientific11-661-19
Microcentrifuge tubesFisher Scientific21-402-9031.5 mL
Polystyrene microspheresPolysciences18602-151.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgentSigmaX100100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plateFisher ScientificAA11062RYCustomized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplateFisher ScientificHP8885710013 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controllerMcMaster-Carr38615K71Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probeMcMaster-Carr9251T93Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchantTranseneType A
Aluminum pelletsKurt J. LeskerEVMAL40QXHBFor electron beam evaporation
ChloroformSigma2883061 L
Copper etchantTransene49-1
Copper pelletsKurt J. LeskerEVMCU40QXQAFor electron beam evaporation
Gold pelletsKurt J. LeskerEVMAUXX40GFor electron beam evaporation
Lens paperThorlabsMC-5
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Scotch tapeStaplesMMM119
Thin film deposition systemKurt J. LeskerPVD-75Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pelletsKurt J. LeskerEVMTI45QXQAFor electron beam evaporation
TolueneSigma2445111 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling SoftwareCOMSOL, Inc.
Dual View spectral splitterPhotometrics, Inc.

Ссылки

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. . Electromagnetism. , (2002).
  19. Jackson, J. D. . Classical electrodynamics. Third edition. , (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v. Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены