قياس حركية المحاصيل والطعام في Drosophila

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو قياس انكماش المحاصيل وتحديد كمية توزيع الأغذية في الأمعاء الدوزوفيا.

Abstract

معظم الحيوانات استخدام الجهاز الهضمي (GI) للهضم الغذاء. حركة الطعام الذي يتم تناوله في الجهاز الهضمي أمر ضروري لامتصاص المغذيات. اضطراب GI الحركة وإفراغ المعدة يسبب أمراض وأعراض متعددة. ككائن حي قوي نموذج وراثي، Drosophila يمكن استخدامها في البحوث GI الحركة. محصول Drosophila هو الجهاز الذي يتعاقد ويتحرك الطعام إلى منتصف الgut لمزيد من الهضم ، وتشبه وظيفيا المعدة الثدييات. قدم هو بروتوكول لدراسة Drosophila حركية المحاصيل باستخدام أدوات قياس بسيطة. ويرد وصف لطريقة لحساب تقلصات المحاصيل لتقييم حركية المحاصيل وطريقة للكشف عن توزيع الأغذية المُصَوَّل الأزرق بين المحصول والأمعاء باستخدام مقياس طيفي للتحقيق في تأثير المحصول على النتوء الغذائي. وقد استخدمت هذه الطريقة للكشف عن الفرق في حركية المحاصيل بين التحكم وprprl2 الذباب متحولة. وهذا البروتوكول يتسم بالكفاءة من حيث التكلفة وحساسية شديدة لحركية المحاصيل.

Introduction

معظم الحيوانات لديها أنبوب الجهاز الهضمي يسمى الجهاز الهضمي (GI) لامتصاص الطاقة والمواد المغذية من البيئة. يتكون الجهاز الهضمي البشري من أربعة أجزاء: المريء، والمعدة، والأمعاء الدقيقة، والأمعاء الغليظة (القولون). مرور الطعام من المعدة إلى الأمعاء ضروري لامتصاص المغذيات. بعض الآثار، مثل الشيخوخة، والعقاقير السامة، والعدوى، تسبب اضطراب الجهاز الهضمي حركية الجهاز الهضمي وإفراغ المعدة، والذي يرتبط ببعض الأمراض وأعراضها مثل عسر الهضم، مرض الجزر المعدي المريئي، والإمساك¹.

ذبابة الفاكهة(Drosophila melanogaster)هو نموذج يستخدم على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية بسبب التلاعب الجينية السهل. الأهم من ذلك، حوالي 77٪ من الجينات المرتبطة بمرض الإنسان لديها homolog في Drosophila². وقد حققت البحوث باستخدام دروسوفيا تقدما هائلا في فهمنا للعديد من آليات الأمراض. ككائن قوي نموذج وراثي، Drosophila يستخدم على نطاق واسع في بحوث الجهاز الهضمي³. Drosophila لديه الجهاز الهضمي أبسط، والتي تنقسم إلى ثلاثة مجالات منفصلة: foregut، midgut، و hindgut⁴. المحصول، وهو جزء من الـ foregut، هو هيكل يشبه الكيس الذي يعمل كموقع لتخزين المواد الغذائية التي يتم تناولها. midgut هو أنبوب طويل ويعمل كموقع لهضم الطعام وامتصاص المغذيات من خلال طبقة الظهارية ، والتي تتكون من enterocytes absorptive (ECs) وإفرازات enteroendocrine (EE) الخلايا^5. ومن المثير للاهتمام، وتنقسم وظيفة المعدة في دروسوفيليا إلى قسمين: وظائف المحاصيل وتخزين المواد الغذائية ومنطقة خلية النحاس (CCR) هي منطقة حمضية للغاية مع درجة الحموضة < 3⁶. في Drosophila، يتم نقل الطعام الذي تم تناوله في البداية إلى المحصول ثم ضخه في منتصف^7. وهكذا، فإن المحاصيل تلعب دورا حاسما في تمرير الطعام. المغلفة من قبل العضلات الحشوية وتتألف من مجموعة معقدة من الصمامات وsphincters، المحصول يحتفظ التعاقد ونقل الطعام في منتصف هضم.

هذا البروتوكول يسمح للكشف عن حركة الغذاء من المحصول إلى منتصف في Drosophila. يتم تقييم انكماش المحاصيل عن طريق حساب تواتر انكماش المحاصيل. وبالإضافة إلى ذلك، يتم دراسة تأثير المحصول على الأعلاف الغذائية عن طريق الكشف عن توزيع الأغذية بين المحاصيل والأمعاء. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام توزيع الأغذية لتعكس الحركة الغذائية الفورية أو الحالة الغذائية الأساسية باستخدام فترات تغذية مختلفة. معا، وهذا البروتوكول يوفر أساليب لتقييم بسرعة حركية المحاصيل والطعام passaging في Drosophila.

Protocol

1. صيانة وإعداد الذباب التجريبي

1. الحفاظ على الذباب في قارورة تحتوي على 10 مل من الأغذية الطازجة (1٪ أجار، 2.4٪ خميرة البيرة، 3٪ السكروز، 5٪ دقيق الذرة) في حاضنة في 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪. تعيين دورة الضوء من الحاضنة إلى 12 ساعة ضوء: 12-ساعة الظلام.
2. لضمان أن عددا كبيرا من أنواع الجيلية المطلوبة الذباب ecloses في وقت واحد، ثقافة الذباب الشباب (1-3 أيام من العمر) في الغذاء القياسية مع الخميرة الجافة على السطح لمدة 3 أيام. نقل الكبار إلى قارورة الغذاء الجديد مع الغذاء القياسية بما في ذلك الخميرة الرطبة، لمدة 2 أيام للسماح وضع البيض. ترك البيض في الحاضنة لتطوير ونقل الذباب الكبار إلى قارورة جديدة لجمع المزيد من البيض.
3. جمع ذباب الذكور أو الإناث eclosed كل يوم وثقافتها في قارورة جديدة مع الغذاء القياسية في حالة الصيانة إلى العمر المطلوب.
   ملاحظة: للحصول على المزيد من الذباب في نفس العمر، قد يتم إعداد قوارير متعددة من النمط الجيني المطلوب في وقت واحد. يجب تغيير قارورة استزراع الذبابة الخاصة بالغًا كل 3-5 أيام.

2- عد تقلصات المحاصيل

1. تخدير الذباب مع CO₂ واتخاذ ذبابة واحدة في لوحة تشريح جيدا تحتوي على 200 ميكرولتر من 1x الفوسفات المالحة المخزنة (PBS، pH = 7.4) تتألف من 136.89 mM NaCl، 2.67 mM KCl، 8.1 mM Na₂HPO_4،و 1.76 mM KH₂PO₄.
2. فهم ذبابة في الصدر باستخدام زوج واحد من ملاقط، بسلاسة فتح الصدر باستخدام زوج آخر من ملاقط، ومن ثم سحب نهاية في اتجاهين متعاكسين لفتح البطن. تأخذ المحاصيل والأمعاء من الجسم بعناية.
3. انتظر ذبابة لتستيقظ ومن ثم تصور المحصول وعدد عدد المرات التي يتعاقد في 1 دقيقة.
   ملاحظة: يتم احتساب موجة كاملة فقط على فصوص المحاصيل كانكماش واحد.
4. كرر الخطوة 2.3 لـ 5x بين فواصل 30 s.
5. حساب متوسط عدد تقلصات المحاصيل في الدقيقة.
   ملاحظة: أثناء العد الانكماشي، يجب أن تكون الذبابة على قيد الحياة، وينبغي أن يكون الأمعاء سليمة ومتعلقة في طرفيه الأمامي والخلفي بعد تشريح.

3. إعداد الأغذية المُزهَلَة

1. وزن وحل الصبغة الزرقاء(جدول المواد)في برنامج تلفزيوني بتركيز 20٪ (ث / الخامس).
2. أضف الصبغة الزرقاء بنسبة 20% إلى طعام الصيانة السائل المسلوق (الخطوة 1.1) مع تخفيف 1:40 إلى تركيز نهائي بنسبة 0.5٪ (ث/ الخامس) أثناء عملية تبريد الطعام.
   ملاحظة: يتم إضافة الصبغة الزرقاء قبل تبريد الطعام وخلطها جيدًا مع التحريك. ومن الاختياري لإذابة الصبغة الزرقاء في برنامج تلفزيوني؛ المياه المقطرة هي أيضا مناسبة.

4. إطعام الذباب مع الطعام المُقَلَم

1. نقل مجموعات من الذباب في نفس العمر إلى قوارير مع الغذاء المجاعة (1٪ أجار في الماء المقطر) لمدة 4 ساعات لضمان تناول الطعام.
2. نقل الذباب إلى قارورة جديدة مع الغذاء المُغَلَّل الأزرق وثقافة الذباب في الوقت المطلوب.
   ملاحظة: وقت التغذية هو عامل حاسم ويعتمد على الغرض البحثي. يمكن استخدام التغذية القصيرة ، في وقت مرور الطعام ، لتقييم سرعة حركة الطعام من المحاصيل إلى الأمعاء. في ظروف الصيانة، والغذاء يمر من خلال في حوالي 2 ساعة. ومع ذلك، قد يكون وقت المرور مرتبطًا بظروف الثقافة. يمكن استخدام التغذية الطويلة، التي تصل إلى بضعة أيام، لتقييم حالة توزيع الطعام المستمر بين المحاصيل والأمعاء.

5. تشريح الذباب وجمع عينات صبغ في المحاصيل والأمعاء

1. تخدير الذباب مع CO₂ واتخاذ ذبابة واحدة في لوحة تشريح جيدا تحتوي على 200 ميكرولتر من 1X PBS.
2. فهم ذبابة في الصدر باستخدام زوج واحد من ملاقط واتخاذ رئيس قبالة الجسم باستخدام زوج آخر من ملاقط. نقل الجسم المتبقية إلى بئر جديد يحتوي على 200 ميكرولتر من 1X PBS.
3. غسل الجسم 2x عن طريق هز بلطف في 200 ميكرولتر من 1X PBS باستخدام زوج من ملاقط لتنظيف الصبغة تعلق على الجسم ذبابة.
4. بلطف وسلاسة فتح البطن باستخدام اثنين من أزواج من ملاقط وفصل بعناية كامل القناة الهضمية من الجسم.
5. بعناية خلع المحصول من الأمعاء كلها ووضعها في أنبوب مع 100 ميكرولتر من 1X PBS.
6. وأخيرا، وضع القناة الهضمية كله دون المحاصيل (المشار إليها فيما بعد باسم الأمعاء) في أنبوب آخر مع 100 ميكرولتر من 1X PBS.
7. طحن المحاصيل والأمعاء على التوالي في أنابيب باستخدام نصائح ماصة لجعل صبغة تذوب في برنامج تلفزيوني.
8. كرر الخطوات 5.1−5.7 حتى يتم جمع ما يكفي من المحاصيل والأحشاء للتجربة المصممة.
   ملاحظة: يجب أن يكون المحصول والأمعاء متجانسين بالكامل، ويجب أن تذوب جميع الصبغة في المخزن المؤقت. لأغراض البحث، يمكن جمع محصول واحد أو عدة أو أحشاء في أنبوب واحد.

6. حساب كميات الصبغة في المحاصيل والأمعاء

1. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب العينة في أعلى سرعة لمدة 1 دقيقة ونقل 90 ميكرولتر من فائقة إلى آبار 96 بئر.
2. جعل سلسلة من تخفيف صبغة زرقاء بتركيزات من 1 × 10^-7 غرام / مل إلى 1 × 10^-4 غرام / مل وفقا للمعايير.
3. أضف سلسلة من معايير 90 ميكرولتر إلى آبار 96 بئر.
4. قياس امتصاص العينات والمعايير في 630 نانومتر مع مطياف لوحة.
5. لإنشاء منحنى قياسي، رسم رسم بياني خط من امتصاص مقابل التركيز لكل من المعايير. ثم رسم خط من أفضل تناسب من خلال النقاط للحصول على المعادلة المستخدمة لحساب تركيز صبغة في العينات.
6. حساب كمية الصبغة بضرب تركيز العينة في 0.1 مل.

النتائج

ويمكن استخدام هذه الطرق لحساب معدل انكماش المحاصيل والكشف عن توزيع الأغذية المصوغة لتقييم وظيفة المحاصيل على الحركة الغذائية. يعكس انكماش المحاصيل تردد دفع الطعام إلى الأمعاء. توزيع الصبغة في الذبابة بعد فترة تغذية قصيرة يشير إلى تمرير الغذاء الفوري من المحاصيل إلى منتصفgut.

Discussion

في دروسوفيليا المواد الغذائية بلعها ينتقل من المحاصيل إلى الأمعاء للهضم. خلال هذه العملية، يتم امتصاص المواد الغذائية، ويتم طرد النفايات من الجسم كبراز. وهكذا، يمكن استخدام مقارنة ابتلاع الطعام مع طرد البراز لتقييم سرعة حركة الطعام في الجسم تقريبًا. طريقة تغذية الشعيرات الدموية (CAFE)...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Thermo fisher	269620
Brillant Blue FCF	Solarbio	E8500	also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge	Thermo fisher	Heraeus Pico 17
Spectrophotometer	Spectra Max	cMax plus
Tweezers	Dumont	11252-30