测量果蝇的作物运动性和食物通度

摘要

该协议的目标是测量作物收缩和量化食物分布在果蝇肠道。

摘要

大多数动物使用胃肠道（GI）来消化食物。摄入的食物在胃肠道的运动对营养吸收至关重要。紊乱的GI运动和胃排空导致多种疾病和症状。作为一种强大的基因模型生物体，果蝇可用于GI运动性研究。D罗友病作物是一种器官，它收缩并移动食物进入中腹，以便进一步消化，其功能类似于哺乳动物的胃。介绍是一种使用简单测量工具研究果蝇作物动性的协议。介绍了一种计算作物收缩以评估作物运动性的方法，以及一种利用分光光度计检测作物和肠道之间染蓝色食物分布的方法，以调查作物对食物传传的影响。该方法用于检测控制与nprl2突变苍蝇在作物运动性上的差异。该协议既具有成本效益，又对作物的动性高度敏感。

引言

大多数动物有一个消化管称为胃肠道（GI），以吸收来自环境的能量和营养。人类胃肠道由四个部分组成:食道、胃、小肠和大肠（结肠）。从胃到肠的食物通道对营养吸收至关重要。一些影响因素，如老化，有毒药物和感染，导致胃肠道运动障碍和胃排空，这与一些疾病及其症状，如消化不良，胃食管反流病，^便秘1。

果蝇（果蝇黑色素）是生物医学研究中广泛使用的模型动物，因为它易于基因操作。重要的是，大约77%与人类疾病相关的基因在果蝇2中具有同^源性。使用果蝇的研究在了解许多疾病机制方面取得了巨大的进展。作为一种强大的遗传模型生物体，果蝇在胃肠道研究^{中得到了广泛的应用}。果蝇有一个更简单的消化道，分为三个离散域:前脑、中生道和后脑^4。作物是前种的一部分，是一个袋式结构，作为摄入食物储存的场地。中肠是一个长管，作为食物消化和营养吸收的站点，通过上皮层，其中包括吸收性肠细胞（CS）和分泌肠分泌细胞^5。有趣的是，果蝇的胃功能分为两部分:作物功能作为食物储存和铜细胞区（CCR）是一个高酸性区域与pH <^{3 6}。在果蝇，摄入的食物最初被转移到作物，然后泵入中果^7。因此，作物在食物传传中起着至关重要的作用。被内脏肌肉包裹，由一系列复杂的阀门和括约肌组成，作物不断收缩，将食物移动到中游，以作进一步消化。

该协议允许检测食物从作物到中游的果蝇运动。通过计算作物收缩频率来评估作物收缩。此外，通过检测作物和肠道之间的食物分布，对作物对食物传通的影响进行了调查。此外，食物分配可用于反映使用不同喂养期的直接食物运动或基本食物状况。综合起来，该协议提供了快速评估作物运动性和食物传通性的方法。

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研究方案

1. 维护和准备实验苍蝇

1. 在25°C的孵化器中，在含有10 mL新鲜食物（1%agar，2.4%的啤酒酵母，3%蔗糖，5%玉米粉）的培养箱中保持苍蝇，湿度为60%。将培养箱的光循环设置为 12 小时光:12-h 暗。
2. 为了确保大量所需的基因型苍蝇同时出现，培养幼蝇（1~3天大）在标准食品中，表面有干酵母，3天。将成人转移到一个新的食物小瓶与标准食品，包括湿酵母，2天，让产卵。将卵子留在孵化器中，以发育和转移成年苍蝇到新瓶收集更多的卵子。
3. 每天收集被围住的雄蝇或雌蝇，并在标准食品的维护条件下用标准食物培养它们，达到所需的年龄。
   注:为了得到更多的同龄苍蝇，可以同时设置所需基因型的多个小瓶。成人苍蝇养殖的小瓶应每3~5天更换一次。

2. 计算作物收缩

1. 用CO₂对苍蝇进行麻醉，将一只苍蝇放入含有200μL的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH = 7.4）的解剖板井中，这些盐由136.89 mM NaCl、2.67 mM KCl、8.1 mM Na₂HPO₄和 1.76 mM KH₂PO_{4 组成}。
2. 用一对钳子抓住它的胸，用另一对钳子平稳地打开胸部，然后用相反的方向拉端打开腹部。小心地把庄稼和肠道从身体里拿出来。
3. 等待苍蝇醒来，然后可视化作物，并在 1 分钟内计算其收缩次数。
   注:作物叶上只有一个完整的波算作一次收缩。
4. 在 30 s 间隔之间重复步骤 2.3 5 倍。
5. 计算每分钟作物收缩的平均数。
   注:在收缩计数期间，苍蝇应是活的，并且肠道应完好无损，并在解剖后附着在它的前部和后部。

3. 准备染色食品

1. 在PBS中，以20%（w/v）的浓度称重和溶解PBS中的蓝色染料（材料表）。
2. 在食品冷却过程中，将 20% 的蓝色染料加入煮沸液体维护食品（步骤 1.1），稀释 1:40 至最终浓度为 0.5%（w/v）。
   注:蓝色染料在食物冷却前加入，并很好地与搅拌混合。在PBS中溶解蓝色染料是可选的;蒸馏水也适用。

4. 用染色食物喂养苍蝇

1. 将一组同年龄苍蝇转移到小瓶与饥饿的食物（1%的阿加在蒸馏水中）4小时，以确保食物的摄入量。
2. 将苍蝇转移到新小瓶与食物染成蓝色，培养苍蝇在期望的时间。
   注:喂食时间是一个关键因素，取决于研究目的。在食物通过时，短喂养可以用来评估从作物到肠道的食物运动速度。在维护条件下，食物大约在2小时内通过。但是，通过的时间可能与文化条件有关。长喂养，最多几天，可用于评估作物和肠道之间的持续食物分布状态。

5. 解剖苍蝇，收集作物和肠道中的染料样本

1. 用CO2对苍蝇进行麻醉_，将一只苍蝇放入含有200μL1x PBS的解剖板井中。
2. 用一对钳子抓住苍蝇的胸部，用另一对钳子把头从身上拿开。将剩余主体移动到包含 200 μL 1x PBS 的新井。
3. 用一对钳子在 200 μL 的 1x PBS 中轻轻摇动身体 2x，以清洁附着在苍蝇身上的染料。
4. 用两对钳子轻轻、平稳地打开腹部，小心地将整个肠道与身体分开。
5. 小心地从整个肠道中脱下作物，并放入 100 μL 的 1x PBS 的管子中。
6. 最后，把整个肠道没有作物（以下简称肠道）在另一管与100μL的1xPBS。
7. 使用移液器尖端在管中分别研磨作物和肠道，使染料溶解在 PBS 中。
8. 重复步骤 5.1~5.7，直到为设计的实验收集足够的作物和胆量。
   注:作物和肠道应完全均匀化，所有染料应溶解在缓冲液中。出于研究目的，一个或多个作物或胆量可以收集在一个管中。

6. 计算作物和肠道中的染料量

1. 以最高速度离心样品管 1 分钟，将 90 μL 的上流液转移到 96 孔板的孔中。
2. 以 1 x 10^{-7 g/mL 到}1 x 10^-4 g/mL 的浓度进行一系列蓝色染料稀释。
3. 在 96 孔板的油井中加入一系列 90 μL 标准。
4. 使用板分光光度计在 630 nm 下测量样品和标准的吸光度。
5. 要创建标准曲线，请绘制每个标准的吸光度与浓度的线图。然后通过点绘制一条最佳拟合线，以获得用于计算样品中染料浓度的方程。
6. 通过将样品浓度乘以 0.1 mL 来计算染料量。

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结果

这些计算作物收缩率和检测染色食物分布的方法可用于评估作物对食物活力的功能。作物收缩反映了将食物推入肠道的频率。短喂养期后，染料在苍蝇中的分布表明食物从作物直接从作物到中游。

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讨论

在果蝇中，摄入的食物从作物转移到肠道进行消化。在这个过程中，营养物质被吸收，废物被排出体外作为粪便。因此，将食物摄入与粪便喷射进行比较，可以大致评估食物在体内运动的速度。毛细管喂食器（CAFE）的方法被广泛用于测量食物摄入^{10，11。10,}粪便数计数方法可用于估计粪便的产生量^12。然而，果蝇体内的食物运...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Thermo fisher	269620
Brillant Blue FCF	Solarbio	E8500	also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge	Thermo fisher	Heraeus Pico 17
Spectrophotometer	Spectra Max	cMax plus
Tweezers	Dumont	11252-30