Messung der Pflanzenmotilität und Lebensmittelpassierung in Drosophila

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Kontraktion der Ernte zu messen und die Lebensmittelverteilung im Drosophila-Darm zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Die meisten Tiere verwenden den Magen-Darm-Trakt (GI), um Nahrung zu verdauen. Die Bewegung der aufgenommenen Nahrung im GI-Trakt ist für die Nährstoffaufnahme unerlässlich. Gestörte GI-Motilität und Magenentleerung verursachen mehrere Krankheiten und Symptome. Als mächtiger genetischer Modellorganismus kann Drosophila in der GI-Motilitätsforschung eingesetzt werden. Die DD-Rosophila-Ernte ist ein Organ, das sich zusammenzieht und Nahrung zur weiteren Verdauung ins Mittelgut verschiebt, funktionell ähnlich wie ein Säugetiermagen. Präsentiert wird ein Protokoll zur Untersuchung der Beweglichkeit der Drosophila-Pflanzen mit einfachen Messwerkzeugen. Beschrieben wird eine Methode zum Zählen von Erntekontraktionen zur Bewertung der Beweglichkeit von Pflanzen und eine Methode zum Nachweis der Verteilung von blau gefärbten Lebensmitteln zwischen der Ernte und dem Darm, die ein Spektralphotometer verwenden, um die Auswirkungen der Kultur auf die Weitergabe von Lebensmitteln zu untersuchen. Die Methode wurde verwendet, um den Unterschied in der Beweglichkeit der Ernte zwischen Kontroll- und nprl2-Mutantenfliegen zu erkennen. Dieses Protokoll ist sowohl kosteneffizient als auch sehr empfindlich auf Diebeszeit.

Einleitung

Die meisten Tiere haben eine Verdauungsröhre genannt magenintestinal (GI) Trakt, um Energie und Nährstoffe aus der Umwelt zu absorbieren. Der menschliche GI-Trakt besteht aus vier Teilen: Speiseröhre, Magen, Dünndarm und Dickdarm (Kolon). Der Nahrungsübergang vom Magen in den Darm ist für die Nährstoffaufnahme unerlässlich. Einige Effektoren, wie Alterung, toxische Medikamente, und Infektion, verursachen gestörte GI-Trakt Motilität und Magenentleerung, die mit einigen Krankheiten und ihre Symptome wie Dyspepsie, gastroösophageale Reflux-Krankheit, und Verstopfung¹verbunden ist.

Die Fruchtfliege(Drosophila melanogaster) ist ein weit verbreitetes Mustertier in der biomedizinischen Forschung aufgrund seiner einfachen genetischen Manipulation. Wichtig ist, dass etwa 77% der Gene, die mit menschlichen Krankheiten assoziiert sind, einen Homolog in Drosophila²haben. Die Forschung mit Drosophila hat enorme Fortschritte in unserem Verständnis vieler Krankheitsmechanismen gemacht. Als mächtiger genetischer Modellorganismus ist Drosophila weit verbreitet in der GI-Traktforschung³. Drosophila hat einen einfacheren Verdauungstrakt, der in drei diskrete Bereiche unterteilt ist: Vorgut, Mittelgut und Hinterdarm⁴. Die Ernte, ein Teil des Vorguts, ist eine beutelartige Struktur, die als Ort für die Lagerung von aufgenommenen Lebensmitteln dient. Das Midgut ist eine lange Röhre und fungiert als Ort für die Verdauung und Nährstoffaufnahme durch die Epithelschicht, die aus absorptiven Enterozyten (ECs) und sekretorischen enteroendokrinen (EE) Zellen^{besteht 5}. Interessanterweise ist die Magenfunktion in Drosophila in zwei Teile unterteilt: Die Ernte funktioniert als Lebensmittellagerung und die Kupferzellregion (CCR) ist eine hochsäugische Region mit einem pH < 3⁶. In Drosophilawird das aufgenommene Essen zunächst in die Ernte gebracht und anschließend in smittelgut⁷gepumpt. Daher spielt die Ernte eine entscheidende Rolle bei der Nahrungsweitergabe. Umhüllt von viszeralen Muskeln und bestehend aus einer komplexen Reihe von Ventilen und Schließmuskeln, zieht die Ernte immer wieder an und bewegt Nahrung zur weiteren Verdauung ins Mittelgut.

Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis der Lebensmittelbewegung von der Ernte bis zum Mittelgut in Drosophila. Die Erntekontraktion wird durch Zählen der Häufigkeit der Erntekontraktion bewertet. Darüber hinaus wird die Wirkung der Kultur auf die Weitergabe von Lebensmitteln untersucht, indem die Nahrungsverteilung zwischen Kultur und Darm festgestellt wird. Darüber hinaus kann die Lebensmittelverteilung verwendet werden, um die unmittelbare Lebensmittelbewegung oder den Grundlegendennahrungsstatus unter Verwendung unterschiedlicher Fütterungszeiten widerzuspiegeln. Zusammengenommen bietet dieses Protokoll Methoden zur schnellen Bewertung der Beweglichkeit von Pflanzen und der Nahrungsweitergabe in Drosophila.

Protokoll

1. Pflege und Vorbereitung von Experimentellen Fliegen

1. Halten Sie Fliegen in Fläschchen mit 10 ml frisch zubereiteter Nahrung (1% Agar, 2,4% Bierhefe, 3% Saccharose, 5% Maismehl) in einem Brutkasten bei 25 °C mit 60% Luftfeuchtigkeit. Stellen Sie den Lichtzyklus des Inkubators auf 12-h-Licht:12-h dunkel ein.
2. Um sicherzustellen, dass eine große Anzahl der gewünschten Genotypfliegen gleichzeitig eatiert, Kultur junge Fliegen (1-3 Tage alt) in Standard-Lebensmittel mit trockener Hefe auf der Oberfläche für 3 Tage. Übertragen Sie die Erwachsenen auf eine neue Lebensmittel-Durchstechflasche mit Standard-Lebensmittel einschließlich Nasshefe, für 2 Tage, um Eiablage zu ermöglichen. Lassen Sie die Eier im Brutkasten, um erwachsene Fliegen zu entwickeln und in eine neue Durchstechflasche zu bringen, um mehr Eier zu sammeln.
3. Sammeln Sie die geschlossenen männlichen oder weiblichen Fliegen jeden Tag und Kultur sie in neuen Fläschchen mit Standard-Essen bei der Wartung Zustand auf das gewünschte Alter.
   HINWEIS: Um mehr gleichaltrige Fliegen zu erhalten, können mehrere Durchstechflaschen des gewünschten Genotyps gleichzeitig eingerichtet werden. Die Fläschchen für die Erwachsenen-Fliegenkultur sollten alle 3 bis 5 Tage gewechselt werden.

2. Zählen von Erntekontraktionen

1. Anästhetisieren Sie die Fliegen mit CO₂ und nehmen Sie eine Fliege in eine Sezierenplatte, die 200 l 1x phosphatgepufferte Kochsaline (PBS, pH = 7,4) enthält, bestehend aus 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄und 1,76 mM KH₂PO₄.
2. Greifen Sie die Fliege an ihrem Thorax mit einem Paar Pinzette, glatt öffnen Sie den Thorax mit einem anderen Paar Pinzette, und ziehen Sie dann das Ende in entgegengesetzte Richtungen, um den Bauch zu öffnen. Nehmen Sie die Ernte und den Darm aus dem Körper sorgfältig.
3. Warten Sie, bis die Fliege aufwacht, und visualisieren Sie dann die Ernte und zählen Sie, wie oft sie sich in 1 min zusammenzieht.
   HINWEIS: Nur eine vollständige Welle auf den Erntelappen wird als eine Kontraktion gezählt.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.3 für 5x zwischen 30 s Intervallen.
5. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Erntekontraktionen pro Minute.
   HINWEIS: Während der Kontraktionszählung sollte die Fliege am Leben sein, und der Darm sollte intakt sein und an seinen vorderen und hinteren Enden nach der Zerlegung befestigt sein.

3. Zubereitung von gefärbten Lebensmitteln

1. Wiegen und lösen Sie den blauen Farbstoff (Materialtabelle) in PBS mit einer Konzentration von 20% (w/v).
2. Fügen Sie den 20% blauen Farbstoff in die gekochte flüssige Pflegenahrung (Schritt 1.1) mit einer Verdünnung von 1:40 auf eine Endkonzentration von 0,5% (w/v) während des Lebensmittelkühlprozesses ein.
   HINWEIS: Der blaue Farbstoff wird vor der Abkühlung des Lebensmittels zugegeben und gut unter Rühren vermischt. Es ist optional, den blauen Farbstoff in PBS aufzulösen; destilliertes Wasser ist ebenfalls geeignet.

4. Fütterung von Fliegen mit gefärbten Lebensmitteln

1. Transfergruppen gleichaltnierter Fliegen auf die Fläschchen mit Hungerfutter (1% Agar in destilliertem Wasser) für 4 h, um die Nahrungsaufnahme zu gewährleisten.
2. Übertragen Sie die Fliegen auf neue Fläschchen mit Lebensmittel gefärbt blau und Kultur die Fliegen für die gewünschte Zeit.
   HINWEIS: Die Fütterungszeit ist ein kritischer Faktor und hängt vom Forschungszweck ab. Kurze Fütterung, innerhalb der Zeit der Nahrung durch, kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Lebensmittel Motilität von der Ernte zu Darm zu bewerten. Bei den Wartungsbedingungen geht das Essen in ca. 2 h durch. Die Zeit des Durchgangs könnte jedoch mit den Kulturbedingungen zusammenhängen. Lange Fütterung, bis zu ein paar Tage, kann verwendet werden, um persistente Lebensmittelverteilung Status zwischen Ernte und Darm zu bewerten.

5. Fliegen sezieren und Färbeproben in Ernte und Darm sammeln

1. Anästhetisieren Sie die Fliegen mit CO₂ und nehmen Sie eine Fliege in eine Sezierenplatte, die 200 l 1x PBS enthält.
2. Greifen Sie die Fliege an ihrem Thorax mit einer Pinzette und nehmen Sie den Kopf vom Körper mit einem anderen Paar Pinzette. Bewegen Sie den restlichen Körper in einen neuen Brunnen, der 200 L 1x PBS enthält.
3. Waschen Sie den Körper 2x, indem Sie ihn vorsichtig in 200 l 1x PBS schütteln, indem Sie eine Pinzette verwenden, um den Farbstoff zu reinigen, der am Fliegenkörper befestigt ist.
4. Öffnen Sie den Bauch vorsichtig und sanft mit zwei Paarpinzette und trennen Sie vorsichtig den ganzen Darm vom Körper.
5. Nehmen Sie die Ernte vorsichtig aus dem gesamten Darm ab und legen Sie sie in ein Rohr mit 100 l 1x PBS.
6. Schließlich den ganzen Darm ohne Ernte (im Folgenden als Darm bezeichnet) in ein anderes Rohr mit 100 l 1x PBS geben.
7. Schleifen Sie die Ernte bzw. den Darm in Rohren mit Pipettenspitzen, um den Farbstoff im PBS auflösen zu lassen.
8. Wiederholen Sie die Schritte 5.1 x 5.7, bis genügend Ernten und Eingeweide für das entwickelte Experiment gesammelt werden.
   HINWEIS: Die Ernte und der Darm sollten vollständig homogenisiert sein, und alle Farbstoffe sollten im Puffer gelöst werden. Zu Forschungszwecken können eine oder mehrere Kulturen oder Eingeweide in einer Röhre gesammelt werden.

6. Berechnung der Farbstoffmengen in Ernte und Darm

1. Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen mit der höchsten Geschwindigkeit für 1 min und übertragen Sie 90 l Überstand auf die Brunnen einer 96-Wellplatte.
2. Stellen Sie eine Reihe von blauen Farbstoffverdünnungen in Konzentrationen von 1 x 10^-7 g/ml bis 1 x 10^-4 g/ml als Standard her.
3. Fügen Sie den Bohrungen der 96-Well-Platte eine Reihe von 90-L-Standards hinzu.
4. Messen Sie die Absorption der Proben und Standards bei 630 nm mit einem Plattenspektrophotometer.
5. Um eine Standardkurve zu erstellen, zeichnen Sie ein Liniendiagramm der Absorption vs. Konzentration für jeden der Standards. Zeichnen Sie dann eine Linie von der besten Passform durch die Punkte, um die Gleichung zu erhalten, die verwendet wird, um die Farbstoffkonzentration in den Proben zu berechnen.
6. Berechnen Sie die Menge des Farbstoffs, indem Sie die Probenkonzentration mit 0,1 ml multiplizieren.

Ergebnisse

Diese Methoden zur Zählung der Erntekontraktionsrate und zum Nachweis der Verteilung gefärbter Lebensmittel können verwendet werden, um die Erntefunktion auf die Beweglichkeit von Lebensmitteln zu bewerten. Die Erntekontraktion spiegelt die Häufigkeit wider, Lebensmittel in den Darm zu schieben. Die Verteilung von Farbstoff in der Fliege nach einer kurzen Fütterungszeit zeigt, dass die Nahrung von der Ernte bis zum Mittelgut sofort abgeht.

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Diskussion

In Drosophila aufgenommene Nahrung bewegt sich von der Ernte in den Darm für die Verdauung. Dabei werden die Nährstoffe aufgenommen und der Abfall als Kot aus dem Körper vertrieben. So kann der Vergleich der Nahrungsaufnahme mit dem Kotauswurf verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Nahrungsbewegung im Körper grob zu beurteilen. Die Methode der Kapillarzuführung (CAFE) ist weit verbreitet, um die Nahrungsaufnahme zu messen^10,11. Die Methode der...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Thermo fisher	269620
Brillant Blue FCF	Solarbio	E8500	also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge	Thermo fisher	Heraeus Pico 17
Spectrophotometer	Spectra Max	cMax plus
Tweezers	Dumont	11252-30