Измерение подвижности урожая и продовольственных пропусков в Drosophila

Резюме

Целью этого протокола является измерение сокращения сельскохозяйственных культур и количественная оценка распределения продовольствия в кишечнике дрозофилы.

Аннотация

Большинство животных используют желудочно-кишечного тракта (ГИ) для переваривания пищи. Движение проглатываемой пищи в желудочно-кишечном тракте имеет важное значение для усвоения питательных веществ. Неупорядоченое подвижность Г.И. и опорожнение желудка вызывают многочисленные заболевания и симптомы. Как мощная генетическая модель организма, Drosophila может быть использован в исследованиях подвижности GI. Урожай drosophila является органом, который сокращается и перемещает пищу в мидгут для дальнейшего пищеварения, функционально похож на желудок млекопитающих. Представлен протокол для изучения моторики культур Drosophila с помощью простых инструментов измерения. Описан метод подсчета сжатия урожая для оценки подвижности сельскохозяйственных культур и метод обнаружения распределения пищевого окрашенного синего цвета между культурой и кишечником с помощью спектрофотометра для исследования влияния урожая на прохождение пищевых продуктов. Метод был использован для обнаружения разницы в подвижности урожая между контролем и nprl2 мутант мух. Этот протокол является экономически эффективным и очень чувствительным к подвижности сельскохозяйственных культур.

Введение

Большинство животных имеют пищеварительную трубку, называемую желудочно-кишечного тракта (GI) для поглощения энергии и питательных веществ из окружающей среды. Человеческий желудочно-кишечного тракта состоит из четырех частей: пищевод, желудок, тонкий кишечник, и толстой кишки (толстой кишки). Пищевой проход из желудка в кишечник необходим для усвоения питательных веществ. Некоторые эффекторы, такие как старение, токсичные препараты, и инфекции, вызывают неупорядочение желудочного тракта подвижность и опорожнения желудка, что связано с некоторыми заболеваниями и их симптомы, такие как диспепсия, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, и запор¹.

Плодовая муха(Drosophila melanogaster) является широко используемой моделью животных в биомедицинских исследований из-за его легкой генетической манипуляции. Важно отметить, что около 77% генов, связанных с болезнью человека, имеют омолог в Drosophila². Исследования с использованием Drosophila сделал огромные успехи в нашем понимании многих механизмов болезни. Как мощная генетическая модель организма, Drosophila широко используется в исследованиях желудочно-кишечного тракта³. Drosophila имеет более простой пищеварительный тракт, который делится на три дискретных доменов: форегут, мидгут, и задний⁴. Урожай, часть foregut, мешок-как структура которая служит как место для ingested хранения еды. Мидгут представляет собой длинную трубку и функционирует как место для пищеварения и усвоения питательных веществ через эпителиальный слой, который состоит из абсорбтивных энтероцитов (ЭК) и секреторных энтероэндокринных (EE) клеток^5. Интересно, что функция желудка в Drosophila делится на две части: урожай функции хранения продуктов питания и области медных клеток (CCR) является высококислой области с рН йтт; 3⁶. В Drosophila, попадает пищи первоначально переехал в урожай, а затем закачивается в midgut⁷. Таким образом, урожай играет важнейшую роль в прохождении продуктов питания. Окутанный висцеральными мышцами и состоящий из сложного массива клапанов и сфинктеров, урожай продолжает сокращаться и переносить пищу в мидгут для дальнейшего пищеварения.

Этот протокол позволяет обнаруживать движение пищи от урожая до середины в Дрозофиле. Сжатие урожая оценивается путем подсчета частоты сокращения урожая. Кроме того, влияние урожая на пищевые пропуска исследуется путем выявления распределения пищи между культурой и кишечником. Кроме того, распределение продовольствия может быть использовано для отражения немедленного перемещения пищи или основного продовольственного статуса с использованием различных периодов кормления. В совокупности этот протокол предоставляет методы для быстрой оценки подвижности сельскохозяйственных культур и пропуска продуктов питания в Дрозофиле.

протокол

1. Поддержание и подготовка экспериментальных мух

1. Поддерживайте мухи в флаконах, содержащих 10 мл свежеприготовленной пищи (1% агар, 2,4% пивных дрожжей, 3% сахарозы, 5% кукурузной муки) в инкубаторе при температуре 25 градусов по Цельсию при 60% влажности. Установите световой цикл инкубатора до 12-h света: 12-h темно.
2. Для того, чтобы большое количество желаемого генотипа мухи ecloses одновременно, культура молодых мух (1-3 дней) в стандартной пище с сухими дрожжами на поверхности в течение 3 дней. Перенесите взрослых на новый пищевой флакон со стандартной пищей, включая влажные дрожжи, в течение 2 дней, чтобы позволить откладывание яиц. Оставьте яйца в инкубаторе для разработки и передачи взрослых мух на новый флакон, чтобы собрать больше яиц.
3. Собирайте закрытых самцов или женщин-мух каждый день и культура их в новых флаконах со стандартной пищей при условии обслуживания до желаемого возраста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить больше летает одного возраста, несколько флаконов желаемого генотипа могут быть настроены одновременно. Флаконы для взрослых летать культуры должны быть изменены каждые 3-5 дней.

2. Подсчет сокращений урожая

1. Анестезия мух с CO₂ и принять одну муху в вскрытии пластины хорошо, содержащий 200 мл 1x фосфат буферного солевого раствора (PBS, рН No 7,4) состоит из 136,89 мМ NaCl, 2,67 м KCl, 8,1 мМ Na₂HPO₄, и 1,76 м КХ₂PO₄.
2. Возьмитесь за грудную клетку с помощью одной пары пинцета, плавно откройте грудную клетку с помощью другой пары пинцета, а затем потяните конец в противоположных направлениях, чтобы открыть живот. Возьмите урожай и кишечник из тела тщательно.
3. Подождите, пока муха проснется, а затем визуализировать урожай и подсчитать количество раз, когда она контракты в 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только полная волна на долях урожая засчитана как одно сужение.
4. Повторите шаг 2.3 для 5x между интервалами 30 s.
5. Рассчитайте среднее количество сокращений урожая в минуту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время подсчета сокращения, муха должна быть жива, и кишечник должен быть нетронутым и прилагается на его передней и задней концах после вскрытия.

3. Приготовление окрашенной пищи

1. Взвешивать и растворять синий краситель(Таблица материалов)в PBS с концентрацией 20% (w/v).
2. Добавьте 20% синий краситель в вареную пищу для поддержания жидкости (шаг 1.1) с разбавлением 1:40 до конечной концентрации 0,5% (w/v) в процессе охлаждения пищи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Синий краситель добавляется перед охлаждением пищи и хорошо перемешивают с перемешиванием. Это необязательно, чтобы растворить синий краситель в PBS; также подходит дистиллированная вода.

4. Кормление мух с окрашенной пищей

1. Передача группы одного возраста летит на флаконы с голодной пищей (1% агар в дистиллированной воде) на 4 ч для обеспечения приема пищи.
2. Перенесите мух на новые флаконы с едой, окрашенной в синий цвет, и культура мух в нужное время.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время кормления является критическим фактором и зависит от цели исследования. Короткое кормление, в течение времени пищи, проходящей через, может быть использован для оценки скорости подвижности пищи от урожая к кишечнику. В условиях технического обслуживания, пища проходит через около 2 ч. Однако время прохождения может быть связано с культурными условиями. Длительное кормление, до нескольких дней, может быть использовано для оценки постоянного состояния распределения пищи между культурой и кишечником.

5. Рассекирование мух и сбор образцов красителей в сельскохозяйственных культурах и кишечнике

1. Обезболить мух со CO₂ и взять одну муху в рассекая пластины хорошо содержащие 200 мл 1x PBS.
2. Возьмите муху на его грудной клетки с помощью одной пары пинцета и снять голову с тела с помощью другой пары пинцета. Переместите оставшееся тело в новый колодец, содержащий 200 МЛ 1x PBS.
3. Вымойте тело 2x, аккуратно встряхивая его в 200 мл 1x PBS с помощью пары пинцетов для очистки красителя, прикрепленного к телу мухи.
4. Аккуратно и плавно откройте живот двумя парами пинцета и аккуратно отделите весь кишечник от тела.
5. Аккуратно снять урожай со всего кишечника и положить его в трубку с 100 мл 1x PBS.
6. Наконец, положить весь кишечник без урожая (далее называют кишки) в другую трубку с 100 мл 1x PBS.
7. Измельчить урожай и кишечник, соответственно, в трубках с помощью пипетки советы, чтобы краситель растворяются в PBS.
8. Повторите шаги 5.1'5.7 до тех пор, пока достаточно культур и кишки собраны для эксперимента разработан.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Урожай и кишечник должны быть полностью гомогенизированы, и все красители должны быть растворены в буфере. Для исследовательских целей, один или несколько культур или кишки могут быть собраны в одной трубке.

6. Расчет количества красителей в сельскохозяйственных культурах и кишечнике

1. Центрифуга пробных труб на самой высокой скорости в течение 1 мин и передача 90 мл супернатанта в скважины 96 скважин пластины.
2. Сделать серию голубых красителей разбавления в концентрациях от 1 х 10^-7 г/мл до 1 х 10^-4 г/мл в качестве стандартов.
3. Добавьте серию стандартов 90 МЛ в скважины 96-й скважины.
4. Измерьте абсорбции образцов и стандартов на 630 нм с помощью спектрофотометра пластины.
5. Чтобы создать стандартную кривую, настипите линейный график абсорбции против концентрации для каждого из стандартов. Затем нарисуйте линию лучше всего подходят через точки, чтобы получить уравнение, используемое для расчета концентрации красителя в образцах.
6. Рассчитайте количество красителя путем умножения концентрации образца на 0,1 мл.

Результаты

Эти методы для подсчета скорости сокращения урожая и выявления окрашенных продуктов питания могут быть использованы для оценки функции сельскохозяйственных культур на подвижность пищевых продуктов. Сокращение урожая отражает частоту толкания пищи в кишечник. Распределение красите?...

Обсуждение

В Drosophila попадает пища перемещается из урожая в кишечник для пищеварения. Во время этого процесса, питательные вещества поглощаются, и отходы выгоняются из организма, как фекалии. Таким образом, сравнение приема пищи вместе с выбросом кала может быть использовано для приблизительн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Thermo fisher	269620
Brillant Blue FCF	Solarbio	E8500	also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge	Thermo fisher	Heraeus Pico 17
Spectrophotometer	Spectra Max	cMax plus
Tweezers	Dumont	11252-30