מדידת תנועתיות היבול ומזון הפסבדרוזופילה

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא למדוד את התכווצות היבול ואת התפלגות המזון לכמת בתוך הבטן Drosophila .

Abstract

רוב החיות להשתמש במערכת העיכול (GI) בדרכי לעכל מזון. התנועה של המזון הבלוע במערכת העיכול חיונית לספיגה מזינים. תנועתיות והקיבה מרוחים ומרוקנים את הגורם למחלות ותסמינים מרובים. כאורגניזם מודל גנטי רב-עוצמה, ניתן להשתמש בדרוסופילה במחקרים של מערכת העיכול. היבול של Drosophila ילה הוא איבר החוזה ומעביר מזון לתוך המעיים לעיכול נוסף, הדומה באופן פונקציונלי לבטן היונקים. מוצג הוא פרוטוקול לחקר דרוסופילה היבול התנועתיות באמצעות כלי מדידה פשוטים. שיטה לספירת התכווצויות יבול להערכת תנועתיות היבול ושיטה לגילוי התפלגות המזון הנצבע כחול בין היבול והבטן באמצעות ספקטרוסקופיה כדי לחקור את ההשפעה של היבול על מזון הפסהאייג ' מתואר. השיטה שימש כדי לזהות את ההפרש בגידול בתנועתיות בין שליטה לבין nprl2 מוטאנטים. פרוטוקול זה מהווה גם חסכוני ורגיש מאוד לחיתוך תנועתיות.

Introduction

רוב החיות יש צינור העיכול שנקרא מערכת העיכול (GI) בדרכי לקלוט אנרגיה וחומרים מזינים מהסביבה. מערכת העיכול האנושית מורכבת מארבעה חלקים: הוושט, הקיבה, המעי הדק, והמעי הגס (נקודתיים). מעבר המזון מהבטן אל המעי הוא חיוני לספיגה מזינים. חלק מהעריקים, כגון הזדקנות, סמים רעילים וזיהום, גורמים לתנועתיות בדרכי GI ולריקון הקיבה, הקשורה למחלות מסוימות ולתסמינים כגון דיספסיה, מחלת ריפלוקס ועצירות¹.

זבוב הפירות (דרוסופילה מלאנוסטר) הוא בעל חיים מודל נפוץ במחקר ביו-רפואי בשל מניפולציה גנטית קלה. חשוב מכך, כ-77% מהגנים הקשורים למחלה האנושית יש יומן הומוזוזה בדרוסופילה². המחקר בדרוסופילה התקדם בהרבה את הבנתנו את מנגנוני המחלות הרבים. כאורגניזם מודל גנטי רב עוצמה, דרוזופילה משמש רבות במחקר בדרכי העיכול³. לדרוסופילה יש מערכת עיכול פשוטה יותר, המחולקת לשלושה תחומים נפרדים: במעי הקדמי, באמצע המעיים ובבטן⁴. היבול, חלק מהבטן הקדמי, הוא מבנה דומה לתיק המשמש כאתר לאחסון מזון שבלע. המעיים היא צינורית ארוכה ומתפקדת כאתר לעיכול מזון וספיגה מזינים באמצעות שכבת האפיתל, המורכבת מתאים בנטציטים (ECs) והפרשה בתאי הנדסת חשמל⁵. מעניין, תפקוד הקיבה בדרוסופילה מחולק לשני חלקים: היבול מתפקד כאחסון מזון ואזור תא הנחושת (ccr) הוא אזור חומצי מאוד עם pH < 3⁶. בדרוזופילה, המזון הבלוע מועבר בתחילה ליבול ולאחר מכן נשאב לתוך המיבטן⁷. לפיכך, היבול ממלא תפקיד קריטי בהפסיית מזון. עטוף על ידי שרירי הקרביים והמורכב של מערך מורכב של שסתומים וספיריטרים, היבול ממשיך בקבלנות והעברת מזון לתוך המעיים לעיכול נוסף.

פרוטוקול זה מאפשר איתור תנועת מזון מן היבול לאמצע המעיים בדרוסופילה. התכווצות חיתוך מוערכת על-ידי ספירת תדירות התכווצות החיתוך. בנוסף, ההשפעה של היבול על מזון מעבר המזון הוא נחקר על ידי גילוי התפלגות המזון בין יבול לבטן. יתרה מזו, ניתן להשתמש בחלוקת המזון כדי לשקף תנועת מזון מיידית או מצב מזון בסיסי באמצעות תקופות האכלה שונות. פרוטוקול זה מספק שיטות להערכת מהירות של תנועתיות והזדקנות מזון בדרוזוהילה.

Protocol

1. שמירה והכנה של זבובים ניסיוניים

1. שמרו על זבובים בבקבוקונים המכילים 10 מ ל של מזון טרי (1% אגר, 2.4% שמרים בירה, 3% סוכרוז, 5% קמח תירס) בחממה ב -25 ° c עם 60% לחות. הגדר את מחזור האור של האינקובטור לאור 12-h: 12-h כהה.
2. כדי להבטיח שמספר רב של גנוטיפ הרצוי יעוף בו, התרבות הצעירה זבובים (1-3 ימים) במזון סטנדרטי עם שמרים יבשים על פני השטח במשך 3 ימים. להעביר את המבוגרים לבקבוקון מזון חדש עם מזון סטנדרטי כולל שמרים רטובים, עבור יומיים כדי לאפשר הנחת ביצים. להשאיר את הביצים בחממה לפתח ולהעביר זבובים מבוגרים למבחנה חדשה כדי לאסוף ביצים יותר.
3. לאסוף את הזכר הנשי או הנקבה זבובים כל יום ותרבות אותם בבקבוקונים חדשים עם מזון רגיל במצב תחזוקה לגיל הרצוי.
   הערה: כדי לקבל עוד זבובים באותו גיל, ניתן להגדיר בו מספר מבחנות של ה-גנוטיפ הרצוי. יש לשנות את הבקבוקונים לתרבות הזבוב המבוגר כל 3-5 ימים.

2. ספירת התכווצויות יבול

1. להוריד את הזבובים עם CO₂ ולקחת אחד זבוב לתוך הצלחת מנתח המכיל 200 μl של מלוחים באגירה 1x פוספט (PBS, pH = 7.4) מורכב 136.89 Mm הנאקל, 2.67 Mm kcl, 8.1 mm Na₂ההפו₄, ו 1.76 mm KH₂PO₄.
2. תפוס את הזבוב בבית החזה באמצעות זוג מלקחיים אחד, פתח בצורה חלקה את בית החזה תוך שימוש בזוג מלקחיים אחר, ולאחר מכן משוך את הקצה בכיוונים מנוגדים כדי לפתוח את הבטן. קח את היבול ואת המעיים מהגוף בזהירות.
3. המתן עד שהזבוב יתעורר ולאחר מכן תדמיין את היבול ותספור את מספר הפעמים שהוא מתכווץ בתוך 1 דקות.
   הערה: רק גל מלא על האונות היבול נספר כציר אחד.
4. חזור על שלב 2.3 עבור 5x בין מרווחי זמן של 30.
5. חישוב המספר הממוצע של התכווצויות חיתוך לדקה.
   הערה: במהלך ספירת הכיווץ, על הזבוב להיות בחיים, והבטן צריכה להיות שלמה ומחוברת בסופו הקדמי והאחורי לאחר הקרע.

3. הכנת מזון צבוע

1. שוקלים וממיסים את הצבע הכחול (טבלת חומרים) בערוץ PBS בריכוז של 20% (w/v).
2. הוסף את 20% צבע כחול לתוך מזון תחזוקה נוזלי מבושלים (שלב 1.1) עם 1:40 דילול לריכוז הסופי של 0.5% (w/v) במהלך תהליך קירור המזון.
   הערה: הצבע הכחול מתווסף לפני שהאוכל מתקרר ומעורבב היטב עם ערבוב. זה אופציונלי לפזר את הצבע הכחול ב-PBS; מים מזוקקים מתאימים גם.

4. האכלה זבובים עם מזון צבוע

1. העברת קבוצות של זבובים בגיל זהה לבקבוקונים עם מזון רעב (1% אגר במים מזוקקים) עבור 4 h כדי להבטיח צריכת מזון.
2. העבירו את הזבובים לבקבוקונים חדשים עם מזון צבוע כחול ותרבותי את הזבובים לזמן הרצוי.
   הערה: זמן ההאכלה הוא גורם קריטי ותלוי במטרת המחקר. האכלה קצרה, בזמן האוכל העובר, ניתן להשתמש כדי להעריך את מהירות התנועתיות של מזון מיבול לבטן. בתנאי התחזוקה, האוכל עובר. בסביבות השעה 2 לערך עם זאת, הזמן לעבור דרך יכול להיות קשור לתנאי התרבות. האכלה ארוכה, עד כמה ימים, ניתן להשתמש כדי להעריך מתמשך התפלגות מזון מעמד בין יבול לבטן.

5. מבתר זבובים ואיסוף דגימות צבע ביבול ובמעיים

1. להוריד את הזבובים עם CO₂ ולקחת זבוב אחד לתוך הצלחת מבתר היטב המכיל 200 μl של 1X PBS.
2. לתפוס את הזבוב בבית החזה שלה באמצעות זוג מלקחיים אחד ולקחת את הראש מהגוף באמצעות זוג אחר של מלקחיים. להעביר את הגוף הנותר היטב חדש המכיל 200 μL של 1x PBS.
3. לשטוף את הגוף 2x על ידי לטלטל אותו בעדינות 200 μL של 1x PBS באמצעות זוג מלקחיים כדי לנקות את הצבע המחובר לגוף לעוף.
4. בעדינות ובאופן חלק לפתוח את הבטן באמצעות שני זוגות של מלקחיים ובזהירות להפריד את כל הבטן מהגוף.
5. בזהירות להוריד את היבול מהבטן כולה ולשים אותו בצינור עם 100 μL של 1x PBS.
6. לבסוף, לשים את הבטן כולה ללא יבול (להלן המכונה בטן) בצינור אחר עם 100 μL של 1x PBS.
7. לטחון את היבול ואת הבטן בהתאמה בצינורות באמצעות עצות הפיפטה כדי להפוך את הצבע מתמוסס ב-PBS.
8. חזור על הצעדים 5.1 עד 5.7 עד שמספיק יבולים ומעיים ייאספו עבור הניסוי שמתוכנן.
   הערה: היבול והמעיים צריכים להיות הומוגניים לחלוטין, וכל הצבע צריך להיות מומס במאגר. למטרות מחקר, ניתן לאסוף בצינור אחד או מספר גידולים או מעיים.

6. חישוב כמויות צבע ביבול ובמעיים

1. צנטריפוגה את הצינורות לדוגמה במהירות הגבוהה ביותר עבור 1 דקות ולהעביר 90 μL של סופרנאטאנט לבארות של הצלחת הטובה 96.
2. הפוך סדרה של מדלל צבע כחול בריכוזים מ 1 x 10^-7 g/mL ל 1 x 10^-4 g/ml כמו סטנדרטים.
3. הוסף סדרה של תקן 90 μL לבארות של הצלחת הטובה 96.
4. מדוד את ספיגת הדגימות והתקנים ב-630 ננומטר עם פלטת צלחות.
5. כדי ליצור עקומה סטנדרטית, יש להתוות גרף קו של ספיגת לעומת ריכוז לכל אחד מהסטנדרטים. ואז לצייר קו של התאמה הטובה ביותר דרך הנקודות כדי לקבל את המשוואה המשמשת לחישוב הריכוז לצבוע בדגימות.
6. לחשב את כמות הצבע על ידי הכפלת הריכוז לדוגמה על ידי 0.1 mL.

תוצאות

שיטות אלה כדי לספור קצב התכווצות היבול ולזהות התפלגות מזון צבוע ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציה יבול על תנועתיות מזון. התכווצות היבול משקפת את התדירות של דחיפת מזון לבטן. התפלגות הצבע בזבוב לאחר תקופת האכלה קצרה מעיד על מזון מיידי הפסחות מפני יבול לאמצע המעיים.

היעד של rap...

Discussion

בדרוזוהילה בלע מזון נע מהיבול למעיים לעיכול. במהלך תהליך זה, החומרים המזינים נספגים, ואת הפסולת הוא גורש מהגוף כמו צואה. כך, השוואת מזון בליעה יחד עם הפליטה צואה ניתן להשתמש כדי לאמוד בערך את מהירות תנועת המזון בגוף. השיטה של ממזין קפילר (קפה) משמשת רבות למדידת מזון בליעה¹⁰

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Thermo fisher	269620
Brillant Blue FCF	Solarbio	E8500	also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge	Thermo fisher	Heraeus Pico 17
Spectrophotometer	Spectra Max	cMax plus
Tweezers	Dumont	11252-30