JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لطريقة التسلسل المستندة إلى LC-MS والتي يمكن استخدامها كطريقة مباشرة لتسلسل الحمض النووي الريبي القصير (<35 nt لكل تشغيل) بدون وسيط (كدنا) ، وكطريقة عامة لتسلسل تعديلات النيوكليوتيدات المختلفة في دراسة واحدة بدقة قاعدة واحدة.

Abstract

ثبت أن مناهج التسلسل القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) مفيدة في التسلسل المباشر للحمض النووي الريبي دون الحاجة إلى وسيط تكميلي للحمض النووي (cDNA). ومع ذلك ، نادرا ما يتم تطبيق مثل هذه الأساليب كطريقة تسلسل الحمض النووي الريبي من جديد ، ولكنها تستخدم بشكل أساسي كأداة يمكن أن تساعد في ضمان الجودة لتأكيد التسلسلات المعروفة لعينات الحمض النووي الريبي أحادية الشريطة المنقى. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتطوير طريقة تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر من خلال دمج استراتيجية وضع العلامات الطرفية الكارهة للماء ثنائية الأبعاد في التسلسل القائم على MS (2D-HELS MS SEQ). هذه الطريقة قادرة على التسلسل الدقيق لتسلسلات الحمض النووي الريبي المفردة بالإضافة إلى المخاليط التي تحتوي على ما يصل إلى 12 تسلسلا مميزا من الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى الريبونوكليوتيدات الأربعة الكنسية (A و C و G و U) ، فإن الطريقة لديها القدرة على تسلسل قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على نيوكليوتيدات معدلة. هذا ممكن لأن القاعدة النووية المعدلة إما لها كتلة فريدة في جوهرها يمكن أن تساعد في تحديدها وموقعها في تسلسل الحمض النووي الريبي ، أو يمكن تحويلها إلى منتج ذو كتلة فريدة. في هذه الدراسة ، استخدمنا الحمض النووي الريبي ، الذي يتضمن اثنين من النيوكليوتيدات المعدلة التمثيلية (pseudouridine (Ψ) و 5-methylcytosine (م5C)) ، لتوضيح تطبيق طريقة التسلسل من جديد لقليل النوكليوتيد RNA واحد بالإضافة إلى خليط من قليل النوكليوتيدات RNA ، ولكل منها تسلسل مختلف و / أو نيوكليوتيدات معدلة. ستكون الإجراءات والبروتوكولات الموضحة هنا لتسلسل هذه الحمض النووي الريبي النموذجي قابلة للتطبيق على عينات الحمض النووي الريبي القصيرة الأخرى (<35 nt) عند استخدام نظام LC-MS قياسي عالي الدقة ، ويمكن استخدامها أيضا للتحقق من تسلسل قليل النوكليوتيدات العلاجية المعدلة للحمض النووي الريبي المعالج. في المستقبل ، مع تطوير خوارزميات أكثر قوة وأدوات أفضل ، يمكن أن تسمح هذه الطريقة بتسلسل عينات بيولوجية أكثر تعقيدا.

Introduction

تم تطوير طرق التسلسل القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) ، بما في ذلك MS من أعلى إلى أسفل و MSالترادفي 1،2،3،4 ، من أجل التسلسل المباشر للحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، لا يمكن حاليا تطبيق تقنيات التجزئة في الموقع لتوليد سلالم الحمض النووي الريبي عالية الجودة بشكل فعال في مطياف الكتلة على تسلسل de novo 5،6. علاوة على ذلك ، ليس من التافه جدا تحليل بيانات MS التقليدية أحادية البعد (1D) لتسلسل de novo حتى لتسلسل RNA منقى واحد ، وسيكون الأمر أكثر صعوبة بالنسبة لتسلسل MS لعينات الحمض النووي الريبي المختلط7،8. لذلك ، تم تطوير طريقة تسلسل الحمض النووي الريبي ثنائية الأبعاد (2D) المستندة إلى الكروماتوغرافيا السائلة (LC)-MS ، والتي تتضمن إنتاج سلالم ثنائية الأبعاد لوقت الاحتفاظ بالكتلة (tR) لتحل محل سلالم الكتلة 1D ، مما يجعل من الأسهل بكثير تحديد مكونات السلم اللازمة لتسلسل من جديد للRNAs8. ومع ذلك ، فإن طريقة تسلسل الحمض النووي الريبي المستندة إلى 2D LC-MS تقتصر بشكل أساسي على الحمض النووي الريبي القصير الاصطناعي المنقى ، حيث لا يمكنها قراءة تسلسل كامل يعتمد فقط على سلم واحد واحد ، ولكن يجب أن تعتمد على سلمين متجاورين متزامنين (5 'و 3'-سلالم )8. وبشكل أكثر تحديدا ، يتطلب هذا النهج قراءات ثنائية الاتجاه مزدوجة النهاية لقراءة القواعد النووية الطرفية في المنطقة منخفضة الكتلة8. يؤدي التعقيد الإضافي للقراءة المزدوجة إلى أن تكون هذه الطريقة غير قابلة للدفاع عن تسلسل مخاليط الحمض النووي الريبي لأنه يثار الارتباك حول جزء السلم الذي ينتمي إلى أي سلم للعينات غير المعروفة.

للتغلب على الحواجز المذكورة أعلاه في مناهج تسلسل الحمض النووي الريبي المستندة إلى MS وتوسيع مثل هذه التطبيقات في تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر ، يجب معالجة مسألتين: 1) كيفية إنشاء سلم كتلة عالي الجودة يمكن استخدامه لقراءة تسلسل كامل ، من النيوكليوتيدات الأولى إلى الأخيرة في خيط الحمض النووي الريبي ، و 2) كيفية التعرف بشكل فعال على كل سلم RNA / كتلة في مجموعة بيانات MS المعقدة. جنبا إلى جنب مع تحلل الحمض الذي يتم التحكم فيه جيدا ، قمنا بتطوير طريقة تسلسل جديدة من خلال إدخال استراتيجية وضع العلامات الطرفية الكارهة للماء (HELS) في تقنية التسلسل المستندة إلى MS ، ونجحنا في معالجة هاتين المسألتين عن طريق إضافة علامة كارهة للماء إما في نهاية 5 و / أو 3 من الحمض النووي الريبي ليتمتسلسلها 9. تنشئ هذه الطريقة سلم تسلسل "مثالي" من الحمض النووي الريبي - كل جزء سلم مشتق من انقسام الحمض النووي الريبي الخاص بالموقع حصريا في كل رابطة فوسفوديستر ، وفرق الكتلة بين شظايا سلم متجاورة هو الكتلة الدقيقة إما لتعديل النيوكليوتيدات أو النيوكليوتيدات في هذا الموضع 8،9،10. هذا ممكن لأننا ندرج خطوة تحلل مائي حمضي يتم التحكم فيه بشكل كبير، والتي تجزأ الحمض النووي الريبي، في المتوسط، مرة واحدة لكل جزيء، قبل حقنه في الجهاز. نتيجة لذلك ، يتم الكشف عن كل منتج جزء من التحلل على مطياف الكتلة وتشكل جميع الأجزاء معا سلم تسلسل8،9،10. تتيح هذه الإستراتيجية الجديدة القراءة الكاملة لتسلسل الحمض النووي الريبي من سلم واحد من خيط الحمض النووي الريبي دون قراءة طرفية مزدوجة من السلم الآخر للحمض النووي الريبي ، وتسمح بالإضافة إلى ذلك بتسلسل MS لمخاليط الحمض النووي الريبي مع خيوط مختلفة متعددة تحتوي على تعديلات النيوكليوتيداتالاندماجية 9. من خلال إضافة علامة في نهاية 5 و / أو 3 'من الحمض النووي الريبي ، تعرض شظايا السلم المسماة تأخيرا كبيرا ل tR ، مما يمكن أن يساعد في تمييز السلالمين الكتليين عن بعضهما البعض وأيضا عن المنطقة الصاخبة منخفضة الكتلة. يسهل تحول كتلة tR الناجم عن إضافة العلامة الكارهة للماء تحديد سلم الكتلة ويبسط تحليل البيانات لتوليد التسلسل. علاوة على ذلك ، يمكن أن تساعد إضافة العلامة الكارهة للماء في تحديد القاعدة الطرفية في الخيط عن طريق منع جزء السلم المقابل لها من التواجدفي منطقة R منخفضة الكتلة الصاخبة بسبب زيادة الكتلة ومقاومة الماء التي تسببها العلامة ، مما يسمح بتحديد التسلسل الكامل للحمض النووي الريبي من سلم واحد ؛ لا يلزم إجراء قراءات مقترنة. نتيجة لذلك ، أظهرنا سابقا التسلسل الناجح لمزيج معقد من ما يصل إلى 12 خيطا متميزا من الحمض النووي الريبي دون استخدام أي خوارزمية تسلسل متقدمة9 ، مما يفتح الباب أمام تسلسل de novo MS للحمض النووي الريبي الذي يحتوي على كل من النيوكليوتيدات الأساسية والمعدلة ويجعله أكثر جدوى لتسلسل عينات الحمض النووي الريبي المختلطة والأكثر تعقيدا. في الواقع ، باستخدام 2D-HELS MS Seq ، نجحنا في تسلسل مجموعة مختلطة من عينات الحمض النووي الريبي10 ونعمل بنشاط على توسيع تطبيقها على عينات الحمض النووي الريبي المعقدة الأخرى.

لتسهيل 2D-HELS MS SEQ لتسلسل مجموعة واسعة من عينات الحمض النووي الريبي مباشرة ، سنركز هنا على الجوانب الفنية لنهج التسلسل هذا وسنغطي جميع الخطوات الأساسية اللازمة عند تطبيق التقنية نحو التسلسل المباشر لعينات الحمض النووي الريبي. سيتم استخدام أمثلة محددة لتوضيح تقنية التسلسل ، بما في ذلك تسلسلات الحمض النووي الريبي المفردة الاصطناعية ، ومخاليط من تسلسلات الحمض النووي الريبي المتميزة المتعددة ، والحمض النووي الريبي المعدل الذي يحتوي على كل من النيوكليوتيدات الأساسية والمعدلة مثل السودودوريدين (ψ) و 5-ميثيل سيتوزين (م5درجة مئوية). نظرا لأن الحمض النووي الريبي تحتوي جميعها على روابط فوسفوديستر ، يمكن تحلل أي نوع من الحمض النووي الريبي بالحمض لتوليد سلم تسلسل مثالي ل 2D-HELS MS SEQ في ظل الظروف المثلى8،9. ومع ذلك ، فإن اكتشاف جميع شظايا السلم لجهاز RNA معين يعتمد على الأداة. في LC-MS القياسي عالي الدقة (40 كيلو) ، فإن الحد الأدنى لكمية التحميل لتسلسل عينة الحمض النووي الريبي القصير المنقى (<35 nt) هو 100 مليون دولار لكل شوط. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى المزيد من المواد (حتى 400 مليون دولار لكل عينة من الحمض النووي الريبي) عند إجراء تجارب إضافية (على سبيل المثال ، للتمييز بين تعديلات القاعدة المتشابهة التي تشترك في كتل متطابقة). سيكون البروتوكول المستخدم في تسلسل نموذج الحمض النووي الريبي الاصطناعي المعدل قابلا للتطبيق أيضا على تسلسل عينات الحمض النووي الريبي الأوسع نطاقا ، بما في ذلك عينات الحمض النووي الريبي البيولوجي مع تعديلات أساسية غير معروفة. ومع ذلك ، فإن كمية عينة أكبر ، مثل 1000 ملي مولية لتسلسل الحمض النووي الريبي (~ 76 nt) باستخدام أداة LC-MS قياسية ، مطلوبة لتسلسل الحمض النووي الريبي الكامل مع جميع التعديلات ، ويجب تطوير خوارزمية متقدمة لتسلسل de novo 10.

Protocol

1. تصميم قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي

  1. صمم قليل النوكليوتيدات الاصطناعية من الحمض النووي الريبي بأطوال مختلفة (19 nt و 20 nt و 21 nt) ، بما في ذلك واحد (RNA # 6) مع كل من النيوكليوتيدات الأساسية والمعدلة. يتم استخدام ψ كنموذج للتعديلات غير المتغيرة للكتلة ، وهو أمر يمثل تحديا لتسلسل MS لأنه يحتوي على كتلة مماثلة ل U. يتم اختيارm 5C كنموذج لتعديلات تغيير الكتلة لإثبات متانة النهج.

    الحمض النووي الريبي # 1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAA-OH-3'
    الحمض النووي الريبي # 2: 5 '- هو-أواغككاجوكاجوكوآكج-أوه-3'
    RNA # 3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUACUGAG-OH-3'
    الحمض النووي الريبي # 4: 5'-HO-GCGUACAUUCUCCCCUUUAU-OH-3'
    RNA # 5: 5'-HO-GCGGAUUAGCUCAGUGGGA-OH-3'
    RNA # 6: 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm5CUGAG-OH-3 '
     
  2. قم بإذابة كل RNA اصطناعي في المياه المعالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) الخالية من النوكلياز (معبرا عنها بH 2O المعالج ب DEPC ما لم يذكر خلاف ذلك) للحصول على محلول مخزون 100 ملي مولار من الحمض النووي الريبي. يتم تخزين محاليل المخزون على المدى الطويل عند -20 درجة مئوية.
  3. لتجنب التدهور المحتمل لعينة الحمض النووي الريبي، استخدم الإمدادات التجريبية الخالية من RNase بما في ذلك المياه المعالجة DEPC وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأطراف الماصة. امسح بشكل متكرر أسطح مستلزمات المختبر باستخدام مناديل التخلص من RNase.

2. قم بتسمية 3'-end من الحمض النووي الريبي بالبيوتين

  1. بروتوكول التفاعل المكون من خطوتين (الأدينيل والربط)
    1. أضف 1 ميكرولتر من 10x محلول تفاعل الأدينيل يحتوي على 50 ملي مولار من أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 6.0 ، و 10 ملي مولار MgCl2 ، و 5 ملي مولار ثنائي كلورو ثنائي الفينيل ثلاثي كلورو الإيثان (DTT) ، و 0.1 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، و 1 ميكرولتر من 1 ملي مولار ATP ، و 1 ميكرولتر من 100 ميكرومولار ثنائي فوسفات السيتيدين البيوتينيل (pCp-biotin) ، و 1 ميكرولتر من 50 ميكرومتر Mth RNA ligase ، و 6 ميكرولتر من H2O المعالج ب DEPC (حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر) في أنبوب PCR رقيق الجدران 0.2 مل خال من RNase.
      ملاحظة: قم بتخزين الكواشف عند -20 درجة مئوية قبل التفاعل المكون من خطوتين. قم بإذابة الكواشف في درجة حرارة الغرفة واخلطها جيدا عن طريق الدوامة والطرد المركزي قبل إضافتها إلى التفاعل.
    2. احتضان التفاعل في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وقم بتعطيل التفاعل عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإجراء خطوة الربط في أنبوب PCR رقيق الجدران 0.2 مل خال من RNase يحتوي على 10 ميكرولتر من محلول التفاعل من الخطوة السابقة عن طريق إضافة 3 ميكرولتر من 10x T4 RNA renae regase buffer يحتوي على 50 ملي مولار tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) -HCl ، درجة الحموضة 7.8 ، 10 ملي MgCl2 ، 1 ملي مولار DTT ، 1.5 ميكرولتر من مخزون عينة 100 ملي مولار من الحمض النووي الريبي المراد تسلسله ، 3 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائي (DMSO) لتصل إلى 10٪ (حجم / حجم) ، 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase (10 وحدات / ميكرولتر) ، و 11.5 ميكرولتر من H2O المعالج ب DEPC (لحجم إجمالي يبلغ 30 مل). احتضان التفاعل طوال الليل عند 16 درجة مئوية في جهاز PCR.
      ملاحظة: اجمع مكونات التفاعل في درجة حرارة الغرفة بسبب نقطة التجمد العالية ل DMSO (18.45 درجة مئوية).
    4. احتضان التفاعل طوال الليل عند 16 درجة مئوية.
    5. قم بإخماد وتنقية التفاعل عن طريق تنقية العمود لإزالة الإنزيمات وتحرير pCp-biotin باستخدام Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research ، Irvine ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). يتم توفير Oligo Binding Buffer و DNA Wash Buffer وأعمدة الدوران وأنابيب التجميع في المجموعة. أضف 20 مل من H2O المعالج ب DEPC إلى محلول التفاعل للوصول إلى حجم عينة 50 مل قبل إضافة المخزن المؤقت للربط.
    6. أضف 100 مل من المخزن المؤقت الملزم لكل محلول تفاعل. أضف 400 ميكرولتر من الإيثانول ، واخلطه عن طريق الماصة ، وانقل الخليط إلى العمود. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق.
    7. أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل الحمض النووي إلى العمود. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم والسرعة القصوى لمدة 30 ثانية و 1 دقيقة على التوالي.
    8. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أضف 15 ميكرولتر من H2O المعالج ب DEPC إلى العمود وجهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 30 ثانية لتصفية منتج الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية في هذه المرحلة حتى يتم تنفيذ الخطوة التالية.
  2. بروتوكول رد الفعل بخطوة واحدة
    1. قم بإجراء تفاعل وضع العلامات من خطوة واحدة عن طريق الجمع بين 2 ميكرولتر من 150 ميكرومتر من الأدينوزين -5'-5'-ثنائي الفوسفات-{5'-(سيتيدين-2'-O-ميثيل-3'-فوسفات-TEG} C-biotin (AppCp-biotin) ، 3 ميكرولتر من 10x المخزن المؤقت لتفاعل الليغاز ، 1.5 ميكرولتر من مخزون عينة 100 ملي مولار من الحمض النووي الريبي المراد تسلسله ، 3 ميكرولتر من DMSO اللامائي للوصول إلى 10٪ (v / v) ، 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase (10 وحدات / ميكرولتر) ، و 19.5 ميكرولتر من H2O المعالج ب DEPC (بحجم إجمالي قدره 30 مل) في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من RNase سعة 1.5 مل.
    2. احتضان التفاعل طوال الليل عند 16 درجة مئوية في جهاز PCR.
    3. قم بإجراء تنقية العمود كما هو موضح أعلاه في الخطوات 2.1.5-2.1.8.
      ملاحظة: قم بإعداد أنبوب تفاعل منفصل / حصري لكل عينة من الحمض النووي الريبي (مقياس 150 مليون من الحمض النووي الريبي). قد تكون هناك حاجة إلى وضع العلامات على الطرف 5 من الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي) باستخدام سلفو سيانين 3 (Cy3) أو Cy3 (على سبيل المثال ، للتحقق من التسلسل ثنائي الاتجاه). تختلف الطريقة عن طريقة 3'-biotinylation وتم وصفها في منشور سابق9.

3. التقاط عينة الحمض النووي الريبي البيوتينيل على حبات الستربتافيدين

  1. قم بتنشيط 200 ميكرولتر من حبات المغناطيس ستربتافيدين C1 عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 1x عازلة أبيض وأسود (5 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ، 0.5 ملي EDTA ، 1 M كلوريد الصوديوم) في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من RNase سعة 1.5 مل. قم بتدوير هذا الحل وضعه على حامل مغناطيسي لمدة 2 دقيقة. ثم تخلص من المادة الطافية عن طريق سحب المحلول بعناية.
  2. اغسل الخرزات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المحلول A (0.1 M هيدروكسيد الصوديوم المعالج ب DEPC و 0.05 M كلوريد الصوديوم المعالج ب DEPC) ومرة واحدة في 200 ميكرولتر من المحلول B (0.1 M كلوريد الصوديوم المعالج ب DEPC). لكل خطوة غسيل ، قم بتدوير المحلول وضعه على حامل مغناطيسي لمدة دقيقتين ، متبوعا بالتخلص من المادة الطافية. ثم أضف 100 ميكرولتر من 2x عازلة أبيض وأسود (10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 7.5 ، 1 ملي EDTA ، 2 م كلوريد الصوديوم).
  3. أضف 1x مخزن مؤقت B & W إلى عينة الحمض النووي الريبي الحيوي حتى يصبح الحجم 100 ميكرولتر. ثم أضف هذا المحلول إلى الخرزات المغسولة المخزنة في 100 ميكرولتر من 2x أبيض وأسود عازلة. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر منصة هزاز عند 100 دورة في الدقيقة. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة 2 دقيقة وتخلص من المادة الطافية.
  4. اغسل الخرزات المطلية 3 مرات في 1x عازلة بالأبيض والأسود وقم بقياس التركيز النهائي للطافي في كل خطوة غسيل بواسطة Nanodrop لتحليل الاسترداد ، للتأكد من بقاء جزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة على الخرز.
  5. احتضان الخرزات في 10 ملي مولار EDTA ، درجة الحموضة 8.2 مع 95٪ فورماميد عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في جهاز PCR. احتفظ بالأنبوب على حامل المغناطيس لمدة دقيقتين واجمع المادة الطافية (التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الحيوي المنبعث من حبات الستربتافيدين) بواسطة الماصة.
    ملاحظة: يتم استخدام خطوة الفصل المادي هذه قبل تحلل الحمض فقط لتسلسل الحمض النووي الريبي # 1 في الشكل 1 ج ، وهي ليست إلزامية ل 2D-HELS MS SEQ نظرا لأن ملصق البيوتين الكارهة للماء يمكن أن يتسبب في تأخير شظايا السلم المسمى 3 't R بشكلكبير أثناء قياس LC-MS ، والتي يمكن أن تميز بوضوح شظايا السلم 3 'المسمى عن شظايا السلم 5'-dislabelsفي مخطط 2D mass-t R.

4. التحلل المائي الحمضي للحمض النووي الريبي لتوليد سلالم MS للتسلسل

  1. قسم كل عينة من عينة الحمض النووي الريبي إلى ثلاثة حصص متساوية. على سبيل المثال ، قسم عينة الحمض النووي الريبي بحجم 15 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي إلى ثلاثة حصص من 5 ميكرولتر.
  2. أضف حجما متساويا من حمض الفورميك لتحقيق 50٪ (v / v) حمض الفورميك في خليط التفاعل8،9.
  3. احتضان التفاعل عند 40 درجة مئوية في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مع تفاعل واحد يعمل لمدة دقيقتين ، وواحد لمدة 5 دقائق ، وواحد لمدة 15 دقيقة ، على التوالي.
  4. قم بإخماد تحلل الحمض عن طريق تجميد العينة على الفور على الجليد الجاف بعد انتهاء كل تفاعل.
  5. استخدم مكثف فراغ الطرد المركزي لتجفيف العينة. عادة ما يتم تجفيف العينة تماما في غضون 30 دقيقة ، ويتم إزالة حمض الفورميك مع H2O أثناء عملية التجفيف لأن حمض الفورميك له نقطة غليان (100.8 درجة مئوية) مماثلة لتلك الموجودة في H2O (100 درجة مئوية).
  6. قم بتعليق ودمج ما مجموعه ثلاث عينات مجففة في 20 ميكرولتر من H2O المعالج ب DEPC لقياس LC-MS.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية في هذه المرحلة أثناء انتظار قياس LC-MS.

5. تحويل ψ إلى CMC-ψ addduct

  1. أضف 80 ميكرولتر من H2O المعالج ب DEPC إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من RNase سعة 1.5 مل يحتوي على 0.0141 جم من N-cyclohexyl-Nʹ- (2-morpholinoethyl) -carbodiimide metho-p-toluenesulfonate (CMC) و 0.07 غرام من اليوريا. أضف 10 ميكرولتر من مخزون العينة 100 ميكرومتر من الحمض النووي الريبي المراد تسلسله ، و 8 ميكرولتر من 1 M bicine buffer (درجة الحموضة 8.3) ، و 1.28 ميكرولتر من 0.5 M EDTA. أضف H2O المعالج ب DEPC للوصول إلى الحجم الإجمالي البالغ 160 ميكرولتر. التركيزات النهائية هي 0.17 M CMC و 7 M يوريا و 4 ملي مولار EDTA في 50 ملي مولار بيسين (درجة الحموضة 8.3) 11.
    ملاحظة: ينطبق هذا البروتوكول إما على تسلسل RNA اصطناعي واحد أو مخاليط RNA.
  2. قسم محلول التفاعل سعة 160 ميكرولتر إلى أربعة حصص متساوية في أنابيب PCR الخالية من RNase وذات الجدران الرقيقة سعة 0.2 مل واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في جهاز PCR.
    ملاحظة: 50 ميكرولتر لكل أنبوب هو الحد الأقصى لحجم التفاعل الذي يمكن استخدامه في جهاز PCR.
  3. قم بإخماد كل تفاعل ب 10 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 1.5 M و 0.5 ملي مولار EDTA (الرقم الهيدروجيني 5.6).
  4. قم بإجراء تنقية العمود بأربعة أعمدة دوران متوازية لإزالة المواد المتفاعلة المفرطة وفقا للإجراء كما هو موضح في الخطوات 2.1.5-2.1.8. قم بإذابة المنتج المنقى في 15 ميكرولتر من H2O المعالج ب DEPC في كل أنبوب طرد مركزي دقيق خال من RNase سعة 1.5 مل.
  5. انقل المنتج المنقى إلى أربعة أنابيب PCR خالية من RNase ورقيقة الجدران سعة 0.2 مل. أضف 20 ميكرولتر من 0.1 M Na2CO3 buffer (الرقم الهيدروجيني 10.4) في كل 15 ميكرولتر من المنتج المنقى وأضف H2O المعالج ب DEPC لتكوين حجم نهائي قدره 40 ميكرولتر لكل أنبوب تفاعل (في المجموع أربعة أنابيب). احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين في جهاز PCR.
  6. قم بإخماد وتنقية التفاعل عن طريق تنقية العمود بأربعة أعمدة دوران متوازية كما هو موضح في الخطوة 2.1.5. قم بإزالة المنتج المحول CMC-ψ إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من RNase سعة 1.5 مل يحتوي كل منها على 15 ميكرولتر من H2O المعالج ب DEPC.
  7. اجمع بين العينة المحولة CMC-ψ المنقاة من أربعة أنابيب تجميع في أنبوب واحد. إجراء تحلل حمض الفورميك بنسبة 50٪ (حجم / حجم) وفقا للإجراءات كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.6 لإنشاء سلالم MS للتسلسل.

6. قياس LC-MS

  1. إعداد المراحل المتنقلة لقياس LC-MS. المرحلة المتنقلة A هي 25 ملي مولار سداسي فلورو-2-بروبانول مع 10 ملي مولار ثنائي الأيزوبروبيلأمين في الماء من الدرجة LC-MS. المرحلة المتنقلة B هي الميثانول.
  2. انقل العينة إلى قارورة عينة LC-MS للتحليل. يبلغ حجم حقن كل عينة 20 ميكرولتر يحتوي على 100-400 ممول من الحمض النووي الريبي.
  3. استخدم شروط LC التالية: درجة حرارة العمود 35 درجة مئوية ، معدل تدفق 0.3 مل / دقيقة ؛ تدرج خطي من 2-20٪ مرحلة متنقلة B على مدى 15 دقيقة متبوعة بخطوة غسيل لمدة دقيقتين مع 90٪ مرحلة متنقلة B.
    ملاحظة: بالنسبة لمزيد من الملصقات النهائية الكارهة للماء مثل Cy3 و sulfo-Cy3 كما هو مذكور في القسم 2 ، قد تكون هناك حاجة إلى نسبة أعلى من المذيبات العضوية لشطف العينة (على سبيل المثال ، يمكن استخدام تدرج مماثل ولكن مع نطاق نسبة مئوية متزايد من المرحلة المتنقلة B). على سبيل المثال ، 2-38٪ المرحلة المتنقلة B على مدى 30 دقيقة مع خطوة غسيل لمدة دقيقتين مع 90٪ مرحلة متنقلة ب.
  4. افصل العينات وحللها على مطياف الكتلة Agilent Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) مقترنا بنظام LC مزود بجهاز أخذ العينات الآلي ونظام MS HPLC (الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء). عمود LC عبارة عن عمود C18 مقاس 50 مم × 2.1 مم بحجم جسيمات 1.7 ميكرومتر. استخدم إعدادات MS التالية: وضع الأيونات السالبة. المدى ، 350 م / ز إلى 3200 م / ز ؛ معدل المسح ، 2 أطياف / ثانية ؛ تدفق غاز التجفيف ، 17 لتر / دقيقة ؛ درجة حرارة غاز التجفيف ، 250 درجة مئوية ؛ ضغط البخاخات ، 30 رطل لكل بوصة مربعة ؛ الجهد الشعري ، 3500 فولت ؛ والجهد المجزأ ، 365 فولت. يرجى ملاحظة أن هذه المعلمات خاصة بنوع أو طراز مطياف الكتلة المستخدم.
  5. احصل على البيانات باستخدام برنامج الاستحواذ Agilent MassHunter. استخدم سير عمل استخراج الميزة الجزيئية Agilent (MFE) لاستخراج المعلومات المركبة بما في ذلك الكتلة ووقت الاحتفاظ والحجم (وفرة MFE لأنواع الأيونات المعنية) ودرجة الجودة ، وما إلى ذلك. استخدم إعدادات MFE التالية: "تنسيق بيانات النقطة الوسطى ، الجزيئات الصغيرة (الكروماتوغرافية) ، الذروة بارتفاع ≥ 100 ، بحد أقصى 1000 ، درجة الجودة ≥ 50".
    ملاحظة: قم بتحسين إعدادات MFE لاستخراج أكبر عدد ممكن من المركبات المحتملة، بحد أقصى 1000، بدرجات جودة ≥ 50.

7. أتمتة إنشاء تسلسل الحمض النووي الريبي بواسطة خوارزمية حسابية

ملاحظة: يظهر هذا الإجراء فقط للحمض النووي الريبي # 1 في الشكل 1 ج.

  1. فرز المركبات المستخرجة MFE بترتيب الحجم المتناقص (ذروة الشدة) و tR. قم بإجراء التحديد المسبق للبيانات عبر 1) إعداد tR من 4 إلى 10 دقائق لتحديد شظايا الحمض النووي الريبي المسمى بواسطة البيوتين ، حيث يتم نقل tRs لمكونات سلم الكتلة المسمى بالبيوتين إلى نافذة tR هذه (4 دقائق إلى 10 دقائق) ، و 2) باستخدام ترتيب أعلى من حيث الحجم لمركبات الإدخال من عدد شظايا السلم لحساب الخوارزمية لتقليل كمية البيانات بناء على الحجم. على سبيل المثال ، بالنسبة للRNA 20 nt ، ستكون هناك حاجة إلى 20 مكونا من مكونات سلم mass-tR المسمى لتسلسل 20 nt RNA ، وبالتالي ، سيتم تحديد 200 مركب من ملف بيانات MFE بناء على الحجم. يرجى ملاحظة أن نافذة tR قد تكون مختلفة عند استخدام نوع أو نموذج مختلف من مطياف الكتلة.
  2. قم بإجراء معالجة البيانات وتوليد تسلسل الحمض النووي الريبي # 1 باستخدام نسخة منقحة من خوارزمية منشورة8. تم وصف شفرات المصدر للخوارزمية المنقحة سابقا (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)9.
  3. بالإضافة إلى أتمتة إنشاء التسلسل باستخدام الخوارزمية ، احسب يدويا فروق الكتلة بين مكونين متجاورين للسلم للاستدعاء الأساسي. يمكن استدعاء جميع القواعد الموجودة في الحمض النووي الريبي يدويا ومطابقتها مع القواعد النظرية في قاعدة بيانات نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي والتعديل8 ؛ وبالتالي ، يمكن قراءة التسلسل الكامل لخيط الحمض النووي الريبي يدويا بدقة ، والذي يستخدم لتأكيد دقة قراءة التسلسل المبلغ عنه بواسطة الخوارزمية. يمكن العثور على المزيد من هياكل تعديلات الحمض النووي الريبي في قواعد بيانات تعديل الحمض النوويالريبي 12 ، ويتم الحصول على الكتل النظرية المقابلة لها بواسطة ChemBioDraw. في الجداول S1-S2 ، يظهر فرق كتلة جزء في المليون (أجزاء في المليون) عند مقارنة الكتلة المرصودة بكتلتها النظرية لمكون سلم معين ، وتعتبر القيمة الأقل من 10 جزء في المليون مطابقة جيدة لكل استدعاء أساسي.

8. تسلسل مخاليط الحمض النووي الريبي

  1. قم بتسمية مزيج من خمسة خيوط من الحمض النووي الريبي (RNA # 1 إلى # 5) في نهاياتها 3 بوصات باستخدام A (5 ') pp (5 ') Cp-TEG-biotin باستخدام بروتوكول من خطوة واحدة موضح في الخطوة 2.2. في الحجم الإجمالي لمحلول تفاعل 150 ميكرولتر ، أضف 15 ميكرولتر من 10x T4 RNA ligase regase buffer ، 1.5 ميكرولتر من كل خيط RNA (100 ميكرومتر من مخزون الحمض النووي الريبي # 1 إلى # 5 ، على التوالي ، لحجم إجمالي يبلغ 7.5 ميكرولتر) ، 10 ميكرولتر من 150 ميكرومتر A (5 ') pp (5 ') Cp-TEG-biotin ، 15 ميكرولتر من DMSO اللامائي ، 5 ميكرولتر من T4 RNA ligase (10 وحدات / ميكرولتر) ، و 97.5 ميكرولتر من H2O. قم بتوزيع محلول التفاعل بالتساوي إلى خمسة حصص. يحتوي كل أنبوب طرد مركزي دقيق خال من RNase على 30 ميكرولتر من محلول التفاعل.
  2. احتضان التفاعل طوال الليل عند 16 درجة مئوية في جهاز PCR.
  3. قم بإجراء تنقية العمود وفقا للإجراء كما هو موضح في الخطوات 2.1.5-2.1.8 بخمسة أعمدة دوران متوازية. قم بإخراج عينة خليط من 3 '- بيوتينيل 5 خيوط RNA (خليط من RNA # 1 إلى # 5) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من RNase 1.5 مل لكل منها 15 ميكرولتر من H2O المعالج ب DEPC.
  4. اجمع عينات الخليط النقي من أنابيب التجميع الخمسة في أنبوب واحد. قم بإجراء تحلل حمض الفورميك وفقا للإجراء الموضح في القسم 4.
  5. قم بقياس العينات بواسطة LC-MS كما هو موضح في القسم 6، وقم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات مع إعدادات MFE المحسنة لاستخراج البيانات التي تحتوي على الكتلة و tR والحجم كما هو موضح في الخطوة 6.5. لا يتم تطبيق خوارزمية المعالجة النموذجية واستدعاء القاعدة بسبب التعقيد المتزايد بشكل كبير في البيانات الناتجة عن الخليط. يتم استدعاء جميع القواعد الموجودة في الحمض النووي الريبي للعينة المختلطة يدويا بطريقة مشابهة للقسم 7.3 وتتطابق جيدا مع القواعد النظرية في قاعدة بيانات نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي والتعديل8 ، وبالتالي تتم قراءة التسلسلات الكاملة لجميع خيوط الحمض النووي الريبي الخمسة في العينة المختلطة بدقة. في الجداول S7-S11 ، يتم سرد جميع المعلومات بما في ذلك الكتلة المرصودة و tR والحجم ودرجة الجودة وفرق كتلة جزء في المليون.

النتائج

إدخال علامة البيوتين إلى نهاية 3 'من الحمض النووي الريبي لإنتاج سلالم كتلة R يمكن التعرف عليها بسهولة. يتم توضيح سير عمل نهج 2D-HELS MS SEQ في الشكل 1 أ. يزيد ملصق البيوتين الكارهة للماء الذي تم إدخاله إلى نهاية 3 'من الحمض النووي الريبي (انظر القسم 2)...

Discussion

على عكس تجزئة MS الترادفية ، يتم استخدام التحلل المائي الحمضي الذي يتم التحكم فيه بدرجة عالية في نهج 2D-HELS MS Seq لتفتيت الحمض النووي الريبي قبل التحليل باستخدام مطياف الكتلة9،10. نتيجة لذلك ، يمكن اكتشاف كل جزء متحلل بالحمض بواسطة الأداة ، مما ?...

Disclosures

قدم المؤلفون براءة اختراع مؤقتة تتعلق بالتكنولوجيا التي تمت مناقشتها في هذه المخطوطة.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بمنحة R21 من المعاهد الوطنية للصحة (1R21HG009576) إلى SZ و WL ومنح الدعم المؤسسي للبحث والإبداع من معهد نيويورك للتكنولوجيا (NYIT) إلى S.Z. ، والتي دعمت هذا العمل. يود المؤلفون أن يشكروا طالب الدكتوراه Xuanting Wang (جامعة كولومبيا) على المساعدة في صنع الأشكال ، ويشكرون البروفيسور مايكل هادجيارجيرو (NYIT) ، والبروفيسور Jingyue Ju (جامعة كولومبيا) ، والد. جيمس روسو ، وشيف كومار ، وشياوكسو لي ، وستيفين جوكوش ، وأعضاء آخرين في مختبر Ju (جامعة كولومبيا) ، والدكتور Yongdong Wang (Cerno Bioscience) ، ومينا عزيز (NYIT) ، وWenhao Ni (NYIT) على المناقشات والاقتراحات المفيدة لمخطوطتنا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5' DNA Adenylation kitNew England BiolabsE2610S50uM concentration
6550 Q-TOF mass spectrometerAgilent Technologies5991-2116ENCoupled to a 1290 Infinity LC system
A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotin-3´ChemGenes91718HPLC purified
ATPγSSigma-Aldrich11162306001Lithium salt
BicineSigma-AldrichB8660BioXtra, ≥99% (titration)
Biotin maleimideVector LaboratoriesSP-1501Long arm
C18 columnWaters18600353250 mm × 2.1 mm Xbridge C18 column with a particle size of 1.7 μm
Centrifugal Vacuum ConcentratorLabconcoRefrig 115v/60hz 7310022Labconco CentriVap
ChemBioDrawPerkinElmerChemDraw PrimeGenerate a chemical structure and property data of structures & fragments
CMC (N-cyclohexyl-N?-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)Sigma-Aldrich2491-17-095% Purifiy
Cyanine3 maleimide (Cy3)Lumiprobe11080Water insoluble
DEPC-treated waterThermo Fisher ScientificAM9906Autoclaved, certified nuclease-free
Diisopropylamine (DIPA)Thermo Fisher Scientific108-18-999% Alfa Aesar
DMSOSigma-Aldrich276855Anhydrous dimethyl sulfoxide, 99.9%
EDTASigma-AldrichE6758Anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture
Formic acidMerck64-18-698-100%, ACS reag, Ph Eur
Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Fisher Scientific920-66-199% Acros Organics
LC-MS sample vialsThermo Fisher ScientificC4000-11Plastic screw thread vials
LC-MS vial capsThermo Fisher ScientificC5000-54AAutosampler vial screw thread caps
Na2CO3 bufferSigma-Aldrich88975BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3
Oligo Clean & ConcentratorZymo ResearchD4060Spin column
OriginLabOriginLabOriginProData analysis and graphing software
pCp-biotinTriLink BioTechnologiesNU-1706-BIO20 ul (1 mM)
RNA #1--#6Integrated DNA TechnologiesCustom RNA oligos19nt-21nt single-stranded RNAs, used without further purification
Rocking platform shakerVWROrbital Shaker Standard 1000Speed Range 40 to 300 rpm
Streptavidin magnetic beadsThermo Fisher Scientific88816Binding approx. 55ug biotinylated rabbit lgG per mg of beads
Sulfonated Cyanine3 maleimideLumiprobe11380Water soluble
T4 DNA ligase 1New England BiolabsM0202S400 units/uL
T4 polynucleotide kinaseSigma-AldrichT4PNK-ROFrom phage T4 am N81 pse T1 infected Escherichia coli BB
Tris-HCl bufferSigma-AldrichT6455Tris-HCl Buffer, pH 10, 10×, Antigen Retriever
UreaSigma-Aldrich81871Urea for synthesis. CAS No. 57-13-6, EC Number 200-315-5.

References

  1. Addepalli, B., Venus, S., Thakur, P., Limbach, P. A. Novel ribonuclease activity of cusativin from Cucumis sativus for mapping nucleoside modifications in RNA. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (24), 5645-5654 (2017).
  2. Gao, H., Liu, Y., Rumley, M., Yuan, H., Mao, B. Sequence confirmation of chemically modified RNAs using exonuclease digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (21), 3423-3430 (2009).
  3. McLuckey, S. A., Van Berkel, G. J., Glish, G. L. Tandem mass spectrometry of small, multiply charged oligonucleotides. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 3 (1), 60-70 (1992).
  4. Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (7), 646-653 (2003).
  5. Taucher, M., Breuker, K. Characterization of modified RNA by top-down mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 51 (45), 11289-11292 (2012).
  6. Kellner, S., Burhenne, J., Helm, M. Detection of RNA modifications. RNA Biology. 7 (2), 237-247 (2010).
  7. Thomas, B., Akoulitchev, A. V. Mass spectrometry of RNA. Trends in Biochemical Sciences. 31 (3), 173-181 (2006).
  8. Bjorkbom, A., et al. Bidirectional direct sequencing of noncanonical RNA by two-dimensional analysis of mass chromatograms. Journal of the American Chemical Society. 137 (45), 14430-14438 (2015).
  9. Zhang, N., et al. A general LC-MS-based RNA sequencing method for direct analysis of multiple-base modifications in RNA mixtures. Nucleic Acids Research. 47 (20), 125 (2019).
  10. Zhang, N., et al. Direct sequencing of tRNA by 2D-HELS-AA MS Seq reveals its different isoforms and dynamic base modifications. ACS Chemical Biology. 15 (6), 1464-1472 (2020).
  11. Bakin, A., Ofengand, J. Four newly located pseudouridylate residues in Escherichia coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center: analysis by the application of a new sequencing technique. Biochemistry. 32 (37), 9754-9762 (1993).
  12. Cantara, W. A., et al. The RNA Modification Database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39 (Database issue), D195-D201 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

2D HELS MS SEQ Pseudouridine 5 methylcytosine LC MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved