2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem

Özet

Burada, bir cDNA ara ürünü olmadan kısa RNA'yı (çalışma başına <35 nt) dizilemek için doğrudan bir yöntem olarak ve tek bir çalışmada tek baz hassasiyetinde farklı nükleotid modifikasyonlarını dizilemek için genel bir yöntem olarak kullanılabilen LC-MS tabanlı bir dizileme yöntemi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Kütle spektrometresi (MS) tabanlı dizileme yaklaşımlarının, tamamlayıcı bir DNA (cDNA) ara ürününe ihtiyaç duymadan doğrudan dizileme RNA'sında yararlı olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu tür yaklaşımlar nadiren bir de novo RNA dizileme yöntemi olarak uygulanır, ancak esas olarak saflaştırılmış tek sarmallı RNA örneklerinin bilinen dizilerini doğrulamak için kalite güvencesine yardımcı olabilecek bir araç olarak kullanılır. Son zamanlarda, 2 boyutlu kütle tutma süresi hidrofobik uç etiketleme stratejisini MS tabanlı dizilemeye (2D-HELS MS Seq) entegre ederek doğrudan bir RNA dizileme yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, tek RNA dizilerinin yanı sıra 12 adede kadar farklı RNA dizisi içeren karışımları doğru bir şekilde dizileme yeteneğine sahiptir. Dört kanonik ribonükleotidi (A, C, G ve U) ek olarak, yöntem, modifiye edilmiş nükleotidler içeren RNA oligonükleotidlerini dizileme kapasitesine sahiptir. Bu mümkündür, çünkü modifiye edilmiş nükleobaz ya tanımlanmasına ve RNA dizisindeki konumuna yardımcı olabilecek özünde benzersiz bir kütleye sahiptir ya da benzersiz bir kütleye sahip bir ürüne dönüştürülebilir. Bu çalışmada, tek bir RNA oligonükleotidinin yanı sıra her biri farklı bir diziye ve/veya modifiye nükleotidlere sahip bir RNA oligonükleotid karışımının de novo dizilimi için yöntemin uygulanmasını göstermek için iki temsili modifiye nükleotid (psödouridin (Ψ) ve 5-metilsitozin (^m5C)) içeren RNA'yı kullandık. Bu model RNA'ları sıralamak için burada açıklanan prosedürler ve protokoller, standart bir yüksek çözünürlüklü LC-MS sistemi kullanıldığında diğer kısa RNA örneklerine (<35 nt) uygulanabilir olacaktır ve ayrıca modifiye edilmiş terapötik RNA oligonükleotidlerinin dizi doğrulaması için de kullanılabilir. Gelecekte, daha sağlam algoritmaların geliştirilmesi ve daha iyi aletlerle, bu yöntem daha karmaşık biyolojik örneklerin dizilenmesine izin verebilir.

Giriş

RNA'nın doğrudan dizilenmesi için yukarıdan aşağıya MS ve tandem MS 1,2,3,4 dahil olmak üzere kütle spektrometresi (MS) tabanlı dizileme yöntemleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, kütle spektrometrelerinde yüksek kaliteli RNA merdivenlerini etkili bir şekilde oluşturmak için yerinde parçalanma teknikleri şu anda de novo dizileme ^5,6'ya uygulanamamaktadır. Ayrıca, tek bir saflaştırılmış RNA dizisinin bile de novo dizilimi için geleneksel tek boyutlu (1D) MS verilerini analiz etmek çok önemsiz değildir ve karışık RNA örneklerinin MS dizilimi için daha da zor olacaktır ^7,8. Bu nedenle, iki boyutlu (2D) sıvı kromatografisi (LC)-MS tabanlı bir RNA dizileme yöntemi geliştirilmiştir ve 1D kütle merdivenlerinin yerini almak için 2D kütle tutma süresi (t_R) merdivenlerinin üretimini içerir ve RNA'ların de novo dizilimi için gerekli merdiven bileşenlerini tanımlamayı çok daha kolay hale getirir⁸. Bununla birlikte, 2D LC-MS tabanlı RNA dizileme yöntemi, yalnızca tek bir merdivene dayalı tam bir diziyi okuyamadığından, ancak bir arada var olan iki bitişik merdivene (5' ve 3' merdiven) dayanması gerektiğinden, esas olarak saflaştırılmış sentetik kısa RNA ile ^{sınırlıdır8}. Daha spesifik olarak, bu yaklaşım, düşük kütleli bölge^8'deki terminal nükleobazları okumak için çift yönlü çift uçlu okumalar gerektirir. Eşleştirilmiş uç okumanın eklenen karmaşıklığı, bu yöntemin RNA karışımlarının dizilimi için savunulamaz olmasına neden olur, çünkü bilinmeyen numuneler için hangi merdiven parçasının hangi merdivene ait olduğu konusunda kafa karışıklığı ortaya çıkar.

MS tabanlı RNA dizileme yaklaşımlarında yukarıda belirtilen engellerin üstesinden gelmek ve doğrudan RNA dizilemede bu tür uygulamaları genişletmek için iki konunun ele alınması gerekir: 1) bir RNA zincirindeki ilk nükleotidden sonuncusuna kadar tam bir diziyi okumak için kullanılabilecek yüksek kaliteli bir kütle merdiveninin nasıl oluşturulacağı ve 2) karmaşık bir MS veri setindeki her bir RNA/kütle merdiveninin nasıl etkili bir şekilde tanımlanacağı. İyi kontrol edilen asit bozunması ile birlikte, MS tabanlı dizileme tekniğine bir hidrofobik uç etiketleme stratejisi (HELS) ekleyerek yeni bir dizileme yöntemi geliştirdik ve^dizilenecek RNA'ların 5' ve/veya 3' ucuna hidrofobik bir etiket ekleyerek bu iki sorunu başarıyla ele aldık 9. Bu yöntem, RNA'dan "ideal" bir dizi merdiveni oluşturur - her merdiven parçası, yalnızca her bir fosfodiester bağındaki bölgeye özgü RNA bölünmesinden türetilir ve iki bitişik merdiven parçası arasındaki kütle farkı, bu konumdaki nükleotidin veya nükleotid modifikasyonunun tam kütlesidir ^8,9,10. Bu mümkündür, çünkü RNA'yı cihaza enjekte edilmeden önce molekül başına ortalama bir kez parçalayan yüksek kontrollü bir asidik hidroliz adımı dahil ediyoruz. Sonuç olarak, her bir bozunma parçası ürünü kütle spektrometresinde tespit edilir ve tüm parçalar birlikte bir sıralama merdiveni ^8,9,10 oluşturur. Bu yeni strateji, bir RNA zincirinin tek bir merdiveninden bir RNA dizisinin, RNA'nın diğer merdiveninden eşleştirilmiş uç okuması olmadan tam olarak okunmasını sağlar ve ayrıca kombinatoryal nükleotid modifikasyonları içeren birden fazla farklı iplikçikli RNA karışımlarının MS dizilenmesine izin verir⁹. RNA'nın 5' ve/veya 3' ucuna bir etiket ekleyerek, etiketli merdiven parçaları, iki kütle merdivenini birbirinden ve ayrıca gürültülü düşük kütleli bölgeden ayırt etmeye yardımcı olabilecek önemli bir t_R gecikmesi gösterir. Hidrofobik etiketin eklenmesinden kaynaklanan kütle-t_R kayması, kütle merdiveni tanımlamasını kolaylaştırır ve dizi oluşturma için veri analizini basitleştirir. Ayrıca, hidrofobik etiketin eklenmesi, etiketin neden olduğu kütle ve hidrofobiklik artışı nedeniyle karşılık gelen merdiven parçasının gürültülü düşük kütleli t_R bölgesinde olmasını önleyerek iplikçikteki terminal tabanın tanımlanmasına yardımcı olabilir, böylece tek bir merdivenden bir RNA'nın tam dizisinin tanımlanmasına izin verir; Eşleştirilmiş uç okumaları gerekli değildir. Sonuç olarak, daha önce herhangi bir gelişmiş dizileme algoritması⁹ kullanmadan 12 adede kadar RNA farklı zincirinden oluşan karmaşık bir karışımın başarılı bir şekilde dizilenmesini gösterdik, bu da hem kanonik hem de modifiye nükleotidler içeren RNA'nın de novo MS dizilimi için kapıyı açar ve karışık ve daha karmaşık RNA örneklerinin dizilenmesi için daha uygun hale getirir. Aslında, 2D-HELS MS Seq kullanarak, karışık bir tRNA örneği^{popülasyonunu 10} başarıyla diziledik ve uygulamasını diğer karmaşık RNA örneklerine aktif olarak genişletiyoruz.

2D-HELS MS Seq'in daha geniş bir RNA örneği yelpazesini doğrudan dizilemesini kolaylaştırmak için, burada bu dizileme yaklaşımının teknik yönlerine odaklanacağız ve tekniği RNA örneklerinin doğrudan dizilenmesine uygularken gereken tüm temel adımları kapsayacağız. Sentetik tek RNA dizileri, birden fazla farklı RNA dizisinin karışımları ve psödouridin (ψ) ve 5-metilsitozin (^m5C) gibi hem kanonik hem de modifiye nükleotidleri içeren modifiye RNA'lar dahil olmak üzere dizileme tekniğini göstermek için spesifik örnekler kullanılacaktır. RNA'ların tümü fosfodiester bağları içerdiğinden, her tür RNA, optimum koşullar altında 2D-HELS MS Seq için ideal bir dizi merdiveni oluşturmak üzere asitle hidrolize edilebilir ^8,9. Bununla birlikte, belirli bir RNA'nın tüm merdiven parçalarının tespiti alete bağlıdır. Standart bir yüksek çözünürlüklü LC-MS'de (40K), saflaştırılmış bir kısa RNA örneğinin (<35 nt) dizilenmesi için minimum yükleme miktarı, çalışma başına 100 pmol'dür. Bununla birlikte, ek deneylerin yapılması gerektiğinde (örneğin, aynı kütleleri paylaşan izomerik baz modifikasyonlarını ayırt etmek için) daha fazla materyal gereklidir (RNA örneği başına 400 pmol'e kadar). Model sentetik modifiye RNA'ların dizilenmesinde kullanılan protokol, bilinmeyen baz modifikasyonlarına sahip biyolojik RNA örnekleri de dahil olmak üzere daha geniş RNA örneklerinin dizilenmesi için de geçerli olacaktır. Bununla birlikte, standart bir LC-MS cihazı kullanılarak tRNA'yı dizilemek için 1000 pmol (~ 76 nt) gibi daha da büyük bir numune miktarı, tüm modifikasyonlarla birlikte tam tRNA'yı dizilemek için gereklidir ve de novo dizileme¹⁰ için gelişmiş bir algoritma geliştirilmelidir.

Protokol

1. RNA oligonükleotidlerini tasarlayın

1. Hem kanonik hem de modifiye nükleotidlere sahip bir (RNA #6) dahil olmak üzere farklı uzunluklarda (19 nt, 20 nt ve 21 nt) sentetik RNA oligonükleotidleri tasarlayın. ψ, kütle değiştirmeyen modifikasyonlar için bir model olarak kullanılır, bu da MS dizilemesi için zordur çünkü U. m⁵C, yaklaşımın sağlamlığını göstermek için kütle değiştiren modifikasyonlar için bir model olarak seçilmiştir.
   
   RNA #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3'
   RNA #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3'
   RNA #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3'
   RNA #4: 5'-HO-GCGUACAUCUUCCCCUUUAU-OH-3'
   RNA #5: 5'-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3'
   RNA #6: 5'-HO-AAACCGUm:⁵CUGAG-OH-3'
    
2. 100 mM'lik bir RNA stok çözeltisi elde etmek için her bir sentetik RNA'yı nükleaz içermeyen dietil pirokarbonat (DEPC) ile muamele edilmiş suda (aksi belirtilmedikçe DEPC ile muamele edilmiş H_2Oolarak ifade edilir) çözün. Stok çözeltileri -20 °C'de uzun süreli olarak saklanır.
3. Olası RNA numunesi bozulmasını önlemek için, DEPC ile arıtılmış su, mikrosantrifüj tüpleri ve pipet uçları dahil olmak üzere RNaz içermeyen deneysel malzemeler kullanın. RNase eliminasyon mendilleri kullanarak laboratuvar malzemelerinin yüzeylerini sık sık silin.

2. RNA'ların 3' ucunu biyotin ile etiketleyin

1. İki aşamalı reaksiyon protokolü (adenilasyon ve ligasyon)
   1. 50 mM sodyum asetat, pH 6.0, 10 mM MgCl₂, 5 mM diklorodifeniltrikloroetan (DTT), 0.1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1 μL 1 mM ATP, 1 μL 100 μM biyotinillenmiş sitidin bifosfat (pCp-biotin), 1 μL 50 μM Mth RNA ligaz ve 6 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O (toplam hacim 10 μL) içeren 1 μL 10x adenilasyon reaksiyonu tamponunu RNaz içermeyen ince duvarlı 0.2 mL PCR tüpüne ekleyin.
      NOT: İki aşamalı reaksiyondan önce reaktifleri -20 °C'de saklayın. Reaktifleri oda sıcaklığında çözün ve reaksiyona eklemeden önce girdap ve santrifüjleme ile iyice karıştırın.
   2. Reaksiyonu bir PCR makinesinde 65 °C'de 1 saat inkübe edin ve reaksiyonu 85 °C'de 5 dakika inaktive edin.
   3. Ligasyon adımını, 50 mM tris (hidroksimetil) aminometan (Tris) -HCl, pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1.5 μL içeren 10 μL 10x T4 RNA ligaz reaksiyon tamponu ekleyerek önceki adımdan 10 μL reaksiyon çözeltisi içeren RNaz içermeyen, ince duvarlı 0.2 mL PCR tüpünde gerçekleştirin. %10 (h/v), 1 μL T4 RNA ligaz (10 birim/μL) ve 11.5 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O'ya (toplam 30 mL hacim) ulaşmak için 3 μL susuz dimetil sülfoksit (DMSO). Reaksiyonu gece boyunca bir PCR makinesinde 16 °C'de inkübe edin.
      NOT: DMSO'nun yüksek donma noktası (18.45 °C) nedeniyle reaksiyon bileşenlerini oda sıcaklığında birleştirin.
   4. Reaksiyonu gece boyunca 16 °C'de inkübe edin.
   5. Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA, ABD) kullanarak enzimleri ve serbest pCp-biyotini uzaklaştırmak için kolon saflaştırma ile reaksiyonu söndürün ve saflaştırın. Kit içerisinde Oligo Bağlayıcı Tampon, DNA Yıkama Tamponu, spin kolonları ve toplama tüpleri bulunmaktadır. Bağlayıcı Tamponu eklemeden önce 50 mL'lik bir numune hacmine ulaşmak için reaksiyon çözeltisine 20 mL DEPC ile muamele edilmiş H₂O ekleyin.
   6. Her reaksiyon çözeltisine 100 mL bağlayıcı tampon ekleyin. 400 μL etanol ekleyin, pipetleyerek karıştırın ve karışımı kolona aktarın. 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
   7. Kolona 750 μL DNA Yıkama Tamponu ekleyin. Sırasıyla 10.000 x g'da ve maksimum hızda 30 s ve 1 dakika santrifüjleyin.
   8. Kolonu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kolona 15 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O ekleyin ve RNA ürününü elüte etmek için 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
      NOT: Numuneler bu aşamada bir sonraki adım gerçekleştirilene kadar -20 °C'de saklanabilir.
2. Tek adımlı reaksiyon protokolü
   1. 2 μL 150 μM adenosin-5'-5'-difosfat-{5'-(sitidin-2'-O-metil-3'-fosfat-TEG}C-biyotin (AppCp-biotin), 3 μL 10x ligaz reaksiyon tamponu, dizilenecek RNA'nın 100 mM'lik numune stoğunun 1.5 μL'si, %10'a (h/h) ulaşmak için 3 μL susuz DMSO, 1 μL T4 RNA ligaz (10 birim/μL), ve 1.5 mL RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpünde 19.5 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O (toplam 30 mL hacim için).
   2. Reaksiyonu gece boyunca bir PCR makinesinde 16 °C'de inkübe edin.
   3. Yukarıda 2.1.5-2.1.8 adımlarında açıklandığı gibi sütun saflaştırması gerçekleştirin.
      NOT: Her RNA örneği için ayrı/özel bir reaksiyon tüpü hazırlayın (150 pmol RNA ölçeği). RNA'ların 5' ucunun sülfo-Siyanin3 (Cy3) veya Cy3 ile etiketlenmesi gerekebilir (örneğin, çift yönlü sıralama doğrulaması için). Yöntem, 3'-biyotinilasyondan farklıdır ve önceki bir yayın^9'da açıklanmıştır.

3. Streptavidin boncukları üzerinde biyotinile RNA örneği yakalayın

1. 1,5 mL RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne 200 μL 1x S&B tampon (5 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl) ekleyerek 200 μL streptavidin C1 mıknatıs boncuklarını aktive edin. Bu çözeltiyi girdaplayın ve 2 dakika boyunca bir mıknatıs standına yerleştirin. Ardından, çözeltiyi dikkatlice pipetleyerek süpernatanı atın.
2. Boncukları iki kez 200 μL Çözelti A (DEPC ile muamele edilmiş 0.1 M NaOH ve DEPC ile muamele edilmiş 0.05 M NaCl) ve 200 μL Çözelti B'de bir kez (DEPC ile muamele edilmiş 0.1 M NaCl) yıkayın. Her yıkama adımı için, çözeltiyi girdaplayın ve 2 dakika boyunca bir mıknatıs standına yerleştirin, ardından süpernatantı atın. Daha sonra 100 μL 2x S&B tampon (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) ekleyin.
3. Hacim 100 μL olana kadar biyotinile edilmiş RNA örneğine 1x S&B tamponu ekleyin. Daha sonra bu çözeltiyi 100 μL 2x S&B tamponda saklanan yıkanmış boncuklara ekleyin. 100 rpm'de sallanan bir platform çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Tüpü 2 dakika boyunca bir mıknatıs standına yerleştirin ve süpernatanı atın.
4. Kaplanmış boncukları 1x S&B tamponda 3 kez yıkayın ve hedef RNA moleküllerinin boncuklar üzerinde kaldığını doğrulamak için geri kazanım analizi için Nanodrop ile her yıkama adımında nihai süpernatant konsantrasyonunu ölçün.
5. Boncukları 10 mM EDTA, pH 8.2'de% 95 formamid ile 65 ° C'de bir PCR makinesinde 5 dakika inkübe edin. Tüpü mıknatıs standında 2 dakika tutun ve süpernatanı (streptavidin boncuklarından salınan biyotinile RNA'ları içeren) pipetle toplayın.
   NOT: Asit bozunmasından önceki bu fiziksel ayırma adımı, yalnızca Şekil 1c'deki RNA # 1'in dizilimi için kullanılır ve hidrofobik biyotin etiketi, 3' etiketli merdiven parçalarının LC-MS ölçümü sırasında önemli ölçüde gecikmeli bir t_R'ye sahip olmasına neden olabileceğinden, etiketli 3' merdiven parçalarını 2B kütle-t_R grafiğindeki etiketsiz 5' merdiven parçalarından açıkça ayırt edebilir.

4. Dizileme için MS merdivenleri oluşturmak için RNA'nın asit hidrolizi

1. Her RNA örneğini üç eşit alikota bölün. Örneğin, hacmi 15 μL olan bir RNA örneğini 5 μL'lik üç alikota bölün.
2. Reaksiyon karışımında %50 (h/h) formik asit elde etmek için eşit hacimde formik asit ekleyin ^8,9.
3. Reaksiyonu bir PCR makinesinde 40 ° C'de, bir reaksiyon sırasıyla 2 dakika, biri 5 dakika ve diğeri 15 dakika boyunca çalışacak şekilde inkübe edin.
4. Her reaksiyon bittikten sonra numuneyi kuru buz üzerinde hemen dondurarak asit bozunmasını söndürün.
5. Numuneyi kurutmak için bir santrifüj vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Numune tipik olarak 30 dakika içinde tamamen kurutulur ve kurutma işlemi sırasında formik asit H 2_{O ile}birlikte çıkarılır çünkü formik asit H₂O'nunkine (100 ° C) benzer bir kaynama noktasına (100.8 ° C) sahiptir.
6. LC-MS ölçümü için 20 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O'da toplam üç kurutulmuş numuneyi askıya alın ve birleştirin.
   NOT: Numuneler bu aşamada LC-MS ölçümü beklenirken -20 °C'de saklanabilir.

5. ψ CMC-ψ eklentisine dönüştürün

1. 0.0141 g N-sikloheksil-Nʹ- (2-morfolinoetil)-karbodiimid meto-p-toluensülfonat (CMC) ve 0.07 g üre içeren 1.5 mL RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne 80 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O ekleyin. Dizilenecek RNA'nın 100 μM'lik numune stoğunun 10 μL'sini, 8 μL'sini 1 M bikain tamponunu (pH 8.3) ve 1.28 μL'sini 0.5 M EDTA'yı ekleyin. Toplam 160 μL hacme ulaşmak için DEPC ile muamele edilmiş H₂O ekleyin. Nihai konsantrasyonlar 50 mM bicine (pH 8.3^{) içinde} 0.17 M CMC, 7 M üre ve 4 mM EDTA'dır11.
   NOT: Bu protokol, tek bir sentetik RNA dizisine veya RNA karışımlarına uygulanabilir.
2. 160 μL reaksiyon çözeltisini RNaz içermeyen, ince duvarlı 0.2 mL PCR tüplerinde dört eşit alikota bölün ve bir PCR makinesinde 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Tüp başına 50 μL, bir PCR makinesinde kullanılabilecek maksimum reaksiyon hacmidir.
3. Her reaksiyonu 10 μL 1.5 M sodyum asetat ve 0.5 mM EDTA (pH 5.6) ile söndürün.
4. Adım 2.1.5-2.1.8'de açıklanan prosedüre göre aşırı reaktanları uzaklaştırmak için dört paralel döndürme sütunu ile kolon saflaştırması gerçekleştirin. Saflaştırılmış ürünü, her 1.5 mL RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpünde 15 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O içinde çözün.
5. Saflaştırılmış ürünü dört RNaz içermeyen, ince duvarlı 0.2 mL PCR tüpüne aktarın. Her 15 μL saflaştırılmış ürüne 20 μL 0.1 M_Na2CO3tamponu (pH 10.4) ekleyin ve her reaksiyon tüpü için 40 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için DEPC ile muamele edilmiş H₂O ekleyin (toplam dört tüp). Reaksiyonu bir PCR makinesinde 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
6. Adım 2.1.5'te açıklandığı gibi dört paralel spin sütunu ile kolon saflaştırarak reaksiyonu söndürün ve saflaştırın. CMC-ψ dönüştürülmüş ürünü, her biri 15 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O içeren 1,5 mL RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın.
7. Saflaştırılmış CMC-ψ dönüştürülmüş numuneyi dört toplama tüpünden tek bir tüpte birleştirin. Dizileme için MS merdivenleri oluşturmak için adım 4.1-4.6'da açıklanan prosedürlere göre formik asit bozunmasını %50 (h/h) gerçekleştirin.

6. LC-MS ölçümü

1. LC-MS ölçümü için mobil fazları hazırlayın. Mobil faz A, LC-MS dereceli suda 10 mM diizopropilamin ile 25 mM heksafloro-2-propanoldür; mobil faz B metanoldür.
2. Numuneyi analiz için LC-MS numune şişesine aktarın. Her numune enjeksiyon hacmi, 100-400 pmol RNA içeren 20 μL'dir.
3. Aşağıdaki LC koşullarını kullanın: 35 °C kolon sıcaklığı, 0,3 mL/dk akış hızı; 15 dakika boyunca %2-20 mobil faz B'den doğrusal bir gradyan ve ardından %90 mobil faz B ile 2 dakikalık bir yıkama adımı.
   NOT: Bölüm 2'de belirtildiği gibi Cy3 ve sülfo-Cy3 gibi daha hidrofobik uç etiketler için, numune elüsyonu için daha yüksek bir organik çözücü yüzdesi gerekli olabilir (yani, benzer bir gradyan kullanılabilir, ancak mobil faz B'nin artan bir yüzde aralığı ile). Örneğin, %90 mobil faz B ile 2 dakikalık bir yıkama adımı ile 30 dakika boyunca %2-38 mobil faz B.
4. Bir otomatik numune alma cihazı ve bir MS HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) sistemi ile donatılmış bir LC sistemine bağlı bir Agilent Q-TOF (Dört Kutuplu Uçuş Süresi) kütle spektrometresinde numuneleri ayırın ve analiz edin. LC kolonu, partikül boyutu 1,7 μm olan 50 mm x 2,1 mm C18 kolonudur. Aşağıdaki MS ayarlarını kullanın: negatif iyon modu; aralık, 350 m/z ila 3200 m/z; tarama hızı, 2 spektrum/sn; kurutma gazı akışı, 17 L/dak; kurutma gazı sıcaklığı, 250 °C; nebulizatör basıncı, 30 psig; kılcal gerilim, 3500 V; ve parçalayıcı voltajı, 365 V. Lütfen bu parametrelerin kullanılan kütle spektrometresinin tipine veya modeline özgü olduğunu unutmayın.
5. Agilent MassHunter edinme yazılımı ile veri elde edin. Kütle, alıkonma süresi, hacim (ilgili iyon türleri için MFE bolluğu) ve kalite puanı vb. dahil olmak üzere bileşik bilgilerini çıkarmak için Agilent moleküler özellik ekstraksiyonu (MFE) iş akışını kullanın. Aşağıdaki MFE ayarlarını kullanın: "centroid veri formatı, küçük moleküller (kromatografik), yüksekliği 100≥ olan tepe, maksimum 1000'e kadar, kalite puanı ≥ 50".
   NOT: MFE ayarlarını, en ≥ 50 kalite puanlarıyla maksimum 1000'e kadar mümkün olduğunca çok sayıda potansiyel bileşik elde edecek şekilde optimize edin.

7. Hesaplamalı bir algoritma ile RNA dizisi oluşturmayı otomatikleştirin

NOT: Bu prosedür yalnızca Şekil 1c'de RNA #1 için gösterilmiştir.

1. MFE ekstrakte edilen bileşikleri azalan hacim (tepe yoğunluğu) ve t_R sırasına göre sıralayın. 1) biyotin tarafından etiketlenen RNA fragmanlarını seçmek için t_R'yi 4 ila 10 dakika arasında ayarlayarak veri ön seçimini gerçekleştirin, çünkü biyotin etiketli kütle merdiveni bileşenlerinin t_R'leribu t_R penceresine kaydırılır (4 dakika ila 10 dakika) ve 2) hacme dayalı veri miktarını azaltmak için algoritma hesaplaması için merdiven parçalarının sayısından daha yüksek bir büyüklük sırası daha yüksek bir girdi bileşiği kullanarak. Örneğin, 20 nt'lik bir RNA için, 20 nt'lik RNA'nın dizilimi için 20 etiketli kütle-t_R merdiven bileşeni gerekecektir ve bu nedenle, MFE veri dosyasından 200 bileşik hacme dayalı olarak seçilecektir. Farklı tipte veya model bir kütle spektrometresi kullanıldığında t_R penceresinin farklı olabileceğini lütfen unutmayın.
2. Yayınlanmış bir algoritmanın gözden geçirilmiş bir sürümünü kullanarak RNA #1'in veri işlemesini ve dizi üretimini gerçekleştirin⁸. Gözden geçirilmiş algoritmanın kaynak kodları daha önce açıklanmıştır (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)⁹.
3. Algoritmayı kullanarak dizi oluşturmayı otomatikleştirmenin yanı sıra, temel arama için iki bitişik merdiven bileşeni arasındaki kütle farklarını manuel olarak hesaplayın. RNA'daki tüm bazlar manuel olarak çağrılabilir ve RNA nükleotid ve modifikasyon veri tabanındaki teorik olanlarla eşleştirilebilir⁸; bu nedenle, RNA zincirinin tam dizisi manuel olarak doğru bir şekilde okunabilir, bu da algoritma tarafından bildirilen dizi okumasının doğruluğunu doğrulamak için kullanılır. RNA modifikasyon veritabanlarında¹² daha fazla RNA modifikasyon yapısı bulunabilir ve bunlara karşılık gelen teorik kütleler ChemBioDraw ile elde edilir. Tablo S1–S2'de, gözlemlenen kütle belirli bir merdiven bileşeni için teorik kütlesi ile karşılaştırıldığında ppm (milyonda parça) kütle farkı gösterilir ve 10 ppm'den küçük bir değer, her bir temel çağrı için iyi bir eşleşme olarak kabul edilir.

8. Dizileme RNA karışımları

1. Beş RNA zincirinin (RNA # 1 ila # 5) bir karışımını 3' uçlarında A (5 ') pp (5 ') Cp-TEG-biyotin ile adım 2.2'de açıklanan tek adımlı bir protokol kullanarak etiketleyin. Toplam 150 μL reaksiyon çözeltisi hacminde, 15 μL 10x T4 RNA ligaz reaksiyon tamponu, her RNA zincirinden 1.5 μL (toplam 7.5 μL hacim için sırasıyla 100 μM RNA # 1 ila # 5 stoğu), 10 μL 150 μM A (5 ') pp (5 ') Cp-TEG-biotin, 15 μL susuz DMSO, 5 μL T4 RNA ligaz (10 birim / μL) ve 97.5 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O. Reaksiyon çözeltisini beş alikota eşit olarak dağıtın. Her RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpü 30 μL reaksiyon çözeltisi içerir.
2. Reaksiyonu gece boyunca bir PCR makinesinde 16 °C'de inkübe edin.
3. Beş paralel döndürme sütunu ile 2.1.5-2.1.8 adımlarında açıklanan prosedüre göre sütun saflaştırmasını gerçekleştirin. 3'-biyotinile edilmiş 5 RNA ipliğinden (RNA #1 ila #5 karışımı) oluşan bir karışım örneğini, her biri 15 μL DEPC ile muamele edilmiş H₂O içeren 1.5 mL RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın.
4. Beş toplama tüpünden saflaştırılmış karışım örneklerini tek bir tüpte birleştirin. Formik asit bozunmasını Bölüm 4'te açıklanan prosedüre göre gerçekleştirin.
5. Numuneleri Bölüm 6'da açıklandığı gibi LC-MS ile ölçün ve adım 6.5'te açıklandığı gibi kütle, t_R ve hacim içeren verileri çıkarmak için optimize edilmiş MFE ayarlarına sahip veri analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Tipik işleme ve temel çağırma algoritması, karışımdan kaynaklanan önemli ölçüde artan veri karmaşıklığı nedeniyle uygulanmaz. Karışık numunenin RNA'sındaki tüm bazlar, Bölüm 7.3'e benzer bir yöntemle manuel olarak çağrılır ve RNA nükleotidi ve modifikasyon veritabanı^8'deki teorik olanlarla iyi bir şekilde eşleşir, böylece karışık numunedeki beş RNA zincirinin tümünün tam dizileri doğru bir şekilde okunur. Tablo S7-S11'de, gözlenen kütle, t_R, hacim, kalite puanı ve ppm kütle farkı dahil olmak üzere tüm bilgiler listelenmiştir.

Sonuçlar

Kolayca tanımlanabilen kütle-t_R merdivenleri üretmek için RNA'nın 3' ucuna bir biyotin etiketi eklemek. 2D-HELS MS Seq yaklaşımının iş akışı Şekil 1a'da gösterilmiştir. RNA'nın 3' ucuna eklenen hidrofobik biyotin etiketi (bakınız Bölüm 2), 3' etiketli merdiven bileşenlerinin kütlelerini ve t_R'lerini, etiketlenmemiş muadillerine kıyasla arttırır. Böylece, 3' merdiven eğrisi, 2B kütle-t_R...

Tartışmalar

Tandem tabanlı MS fragmantasyonundan farklı olarak, bir kütle spektrometresi^9,10 ile analizden önce RNA'yı parçalamak için 2D-HELS MS Seq yaklaşımında yüksek kontrollü asidik hidroliz kullanılır. Sonuç olarak, asitle bozunmuş her parça, bir sıralama merdiveninin eşdeğerini oluşturan cihaz tarafından tespit edilebilir. Optimal koşullar altında, bu yöntem, yalnızca bir fosfodiester bağında

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5' DNA Adenylation kit	New England Biolabs	E2610S	50uM concentration
6550 Q-TOF mass spectrometer	Agilent Technologies	5991-2116EN	Coupled to a 1290 Infinity LC system
A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotin-3´	ChemGenes	91718	HPLC purified
ATPγS	Sigma-Aldrich	11162306001	Lithium salt
Bicine	Sigma-Aldrich	B8660	BioXtra, ≥99% (titration)
Biotin maleimide	Vector Laboratories	SP-1501	Long arm
C18 column	Waters	186003532	50 mm × 2.1 mm Xbridge C18 column with a particle size of 1.7 μm
Centrifugal Vacuum Concentrator	Labconco	Refrig 115v/60hz 7310022	Labconco CentriVap
ChemBioDraw	PerkinElmer	ChemDraw Prime	Generate a chemical structure and property data of structures & fragments
CMC (N-cyclohexyl-N?-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)	Sigma-Aldrich	2491-17-0	95% Purifiy
Cyanine3 maleimide (Cy3)	Lumiprobe	11080	Water insoluble
DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906	Autoclaved, certified nuclease-free
Diisopropylamine (DIPA)	Thermo Fisher Scientific	108-18-9	99% Alfa Aesar
DMSO	Sigma-Aldrich	276855	Anhydrous dimethyl sulfoxide, 99.9%
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	Anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture
Formic acid	Merck	64-18-6	98-100%, ACS reag, Ph Eur
Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	920-66-1	99% Acros Organics
LC-MS sample vials	Thermo Fisher Scientific	C4000-11	Plastic screw thread vials
LC-MS vial caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-54A	Autosampler vial screw thread caps
Na2CO3 buffer	Sigma-Aldrich	88975	BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4060	Spin column
OriginLab	OriginLab	OriginPro	Data analysis and graphing software
pCp-biotin	TriLink BioTechnologies	NU-1706-BIO	20 ul (1 mM)
RNA #1--#6	Integrated DNA Technologies	Custom RNA oligos	19nt-21nt single-stranded RNAs, used without further purification
Rocking platform shaker	VWR	Orbital Shaker Standard 1000	Speed Range 40 to 300 rpm
Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88816	Binding approx. 55ug biotinylated rabbit lgG per mg of beads
Sulfonated Cyanine3 maleimide	Lumiprobe	11380	Water soluble
T4 DNA ligase 1	New England Biolabs	M0202S	400 units/uL
T4 polynucleotide kinase	Sigma-Aldrich	T4PNK-RO	From phage T4 am N81 pse T1 infected Escherichia coli BB
Tris-HCl buffer	Sigma-Aldrich	T6455	Tris-HCl Buffer, pH 10, 10×, Antigen Retriever
Urea	Sigma-Aldrich	81871	Urea for synthesis. CAS No. 57-13-6, EC Number 200-315-5.