2D-HELS MS Seq: Un metodo generale basato su LC-MS per il sequenziamento diretto e de novo di miscele di RNA con diverse modifiche nucleotidiche

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per un metodo di sequenziamento basato su LC-MS che può essere utilizzato come metodo diretto per sequenziare RNA corto (<35 nt per corsa) senza un intermedio di cDNA e come metodo generale per sequenziare diverse modifiche nucleotidiche in un singolo studio con precisione a base singola.

Abstract

Gli approcci di sequenziamento basati sulla spettrometria di massa (MS) si sono dimostrati utili nel sequenziamento diretto dell'RNA senza la necessità di un intermedio di DNA complementare (cDNA). Tuttavia, tali approcci sono raramente applicati come metodo di sequenziamento dell'RNA de novo , ma utilizzati principalmente come strumento che può aiutare a garantire la qualità per confermare sequenze note di campioni di RNA purificati a singolo filamento. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo di sequenziamento diretto dell'RNA integrando una strategia di marcatura idrofobica del tempo di ritenzione della massa bidimensionale nel sequenziamento basato su MS (2D-HELS MS Seq). Questo metodo è in grado di sequenziare con precisione singole sequenze di RNA e miscele contenenti fino a 12 sequenze di RNA distinte. Oltre ai quattro ribonucleotidi canonici (A, C, G e U), il metodo ha la capacità di sequenziare oligonucleotidi di RNA contenenti nucleotidi modificati. Ciò è possibile perché la base nucleotica modificata ha una massa intrinsecamente unica che può aiutare nella sua identificazione e nella sua posizione nella sequenza di RNA, oppure può essere convertita in un prodotto con una massa unica. In questo studio, abbiamo utilizzato l'RNA, incorporando due nucleotidi modificati rappresentativi (pseudouridina (Ψ) e 5-metilcitosina (m⁵C)), per illustrare l'applicazione del metodo per il sequenziamento de novo di un singolo oligonucleotide di RNA e di una miscela di oligonucleotidi di RNA, ciascuno con una sequenza diversa e/o nucleotidi modificati. Le procedure e i protocolli qui descritti per sequenziare questi RNA modello saranno applicabili ad altri campioni di RNA corti (<35 nt) quando si utilizza un sistema LC-MS standard ad alta risoluzione e possono anche essere utilizzati per la verifica della sequenza di oligonucleotidi di RNA terapeutici modificati. In futuro, con lo sviluppo di algoritmi più robusti e con strumenti migliori, questo metodo potrebbe consentire il sequenziamento di campioni biologici più complessi.

Introduzione

Per il sequenziamento diretto dell'RNA sono stati sviluppati metodi di sequenziamento basati sulla spettrometria di massa (MS), tra cui MS top-down e MS 1,2,3,4 in tandem. Tuttavia, le tecniche di frammentazione in situ per generare efficacemente scale di RNA di alta qualità negli spettrometri di massa attualmente non possono essere applicate al sequenziamento de novo ^5,6. Inoltre, non è molto banale analizzare i tradizionali dati MS unidimensionali (1D) per il sequenziamento de novo anche di una sola sequenza di RNA purificata, e sarebbe ancora più impegnativo per il sequenziamento MS di campioni di RNA misti ^7,8. Pertanto, è stato sviluppato un metodo di sequenziamento dell'RNA basato su cromatografia liquida (LC)-MS bidimensionale (2D), che incorpora la produzione di scale 2D per il tempo di ritenzione di massa (t_R) per sostituire le scale di massa 1D, rendendo molto più facile l'identificazione dei componenti della scala necessari per il sequenziamento de novo degli RNA⁸. Tuttavia, il metodo di sequenziamento dell'RNA basato su LC-MS 2D è principalmente limitato all'RNA corto sintetico purificato, in quanto non è in grado di leggere una sequenza completa basata esclusivamente su una singola scala, ma deve basarsi su due scale adiacenti coesistenti (scale da 5' e 3')⁸. Più specificamente, questo approccio richiede letture bidirezionali di estremità accoppiate per la lettura di basi nucleotiche terminali nella regione di bassa massa⁸. L'aggiunta complessità della lettura paired-end fa sì che questo metodo sia insostenibile per il sequenziamento di miscele di RNA perché si crea confusione su quale frammento di ladder appartenga a quale ladder per i campioni sconosciuti.

Per superare le barriere sopra menzionate negli approcci di sequenziamento dell'RNA basati sulla SM e per ampliare tali applicazioni nel sequenziamento diretto dell'RNA, devono essere affrontate due questioni: 1) come generare una scala di massa di alta qualità che possa essere utilizzata per leggere una sequenza completa, dal primo nucleotide all'ultimo in un filamento di RNA, e 2) come identificare efficacemente ogni scala RNA/massa in un complesso set di dati MS. Insieme a una degradazione acida ben controllata, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di sequenziamento introducendo una strategia di marcatura idrofobica (HELS) nella tecnica di sequenziamento basata su MS e abbiamo affrontato con successo questi due problemi aggiungendo un tag idrofobico all'estremità 5' e/o 3' degli RNA da sequenziare⁹. Questo metodo crea una scala di sequenza "ideale" dall'RNA: ogni frammento di scala deriva dalla scissione dell'RNA sito-specifica esclusivamente in corrispondenza di ogni legame fosfodiestere e la differenza di massa tra due frammenti di scala adiacenti è la massa esatta del nucleotide o della modifica nucleotidica in quella posizione ^8,9,10. Questo è possibile perché includiamo una fase di idrolisi acida altamente controllata, che frammenta l'RNA, in media, una volta per molecola, prima di essere iniettato nello strumento. Di conseguenza, ogni prodotto del frammento di degradazione viene rilevato sullo spettrometro di massa e tutti i frammenti insieme formano una scala di sequenziamento ^8,9,10. Questa nuova strategia consente la lettura completa di una sequenza di RNA da una singola scala di un filamento di RNA senza la lettura di estremità accoppiate dall'altra scala dell'RNA e consente inoltre il sequenziamento MS di miscele di RNA con più filamenti diversi che contengono modificazioni nucleotidiche combinatorie⁹. Aggiungendo un tag all'estremità 5' e/o 3' dell'RNA, i frammenti di scala marcati mostrano un ritardo significativo di t_R, che può aiutare a distinguere le due scale di massa l'una dall'altra e anche dalla regione rumorosa di bassa massa. Lo spostamento di massa-t_R causato dall'aggiunta del tag idrofobico facilita l'identificazione della scala di massa e semplifica l'analisi dei dati per la generazione della sequenza. Inoltre, l'aggiunta del tag idrofobico può aiutare a identificare la base terminale nel filamento impedendo che il suo corrispondente frammento di scala si trovi nella rumorosa regione_R a bassa massa-t a causa dell'aumento di massa e idrofobicità causato dal tag, consentendo così l'identificazione della sequenza completa di un RNA da una singola scala; Non sono necessarie letture paired-end. Di conseguenza, abbiamo precedentemente dimostrato il successo del sequenziamento di una miscela complessa di un massimo di 12 filamenti distinti di RNA senza l'uso di alcun algoritmo di sequenziamento avanzato⁹, che apre la porta al sequenziamento de novo MS di RNA contenente sia nucleotidi canonici che modificati e lo rende più fattibile per il sequenziamento di campioni di RNA misti e più complessi. Infatti, utilizzando 2D-HELS MS Seq, abbiamo persino sequenziato con successo una popolazione mista di campioni di tRNA¹⁰ e stiamo espandendo attivamente la sua applicazione ad altri campioni di RNA complessi.

Per facilitare il sequenziamento diretto di una gamma più ampia di campioni di RNA da parte di 2D-HELS MS, qui ci concentreremo sugli aspetti tecnici di questo approccio di sequenziamento e tratteremo tutti i passaggi essenziali necessari per l'applicazione della tecnica verso il sequenziamento diretto di campioni di RNA. Esempi specifici saranno utilizzati per illustrare la tecnica di sequenziamento, tra cui sequenze sintetiche di RNA singole, miscele di più sequenze di RNA distinte e RNA modificati contenenti sia nucleotidi canonici che modificati come la pseudouridina (ψ) e la 5-metilcitosina (m⁵C). Poiché tutti gli RNA contengono legami fosfodiestere, qualsiasi tipo di RNA può essere idrolizzato in acido per generare una scala di sequenza ideale per 2D-HELS MS Seq in condizioni ottimali ^8,9. Tuttavia, il rilevamento di tutti i frammenti ladder di un dato RNA dipende dallo strumento. Su una LC-MS standard ad alta risoluzione (40K), la quantità minima di carico per il sequenziamento di un campione di RNA corto purificato (<35 nt) è di 100 pmol per corsa. Tuttavia, è necessario più materiale (fino a 400 pmol per campione di RNA) quando devono essere condotti ulteriori esperimenti (ad esempio, per distinguere le modifiche delle basi isomeriche che condividono masse identiche). Il protocollo utilizzato nel sequenziamento del modello di RNA modificato sintetico sarà applicabile anche al sequenziamento di campioni di RNA più ampi, compresi i campioni di RNA biologici con modifiche di base sconosciute. Tuttavia, è necessaria una quantità di campione ancora maggiore, come 1000 pmol per il sequenziamento del tRNA (~76 nt) utilizzando uno strumento LC-MS standard, per sequenziare il tRNA completo con tutte le modifiche, e deve essere sviluppato un algoritmo avanzato per il suo sequenziamento de novo ¹⁰.

Protocollo

1. Progettazione di oligonucleotidi di RNA

1. Progettare oligonucleotidi di RNA sintetici con lunghezze diverse (19 nt, 20 nt e 21 nt), incluso uno (RNA #6) con nucleotidi sia canonici che modificati. ψ viene utilizzato come modello per modifiche che non alterano la massa, il che è impegnativo per il sequenziamento MS perché ha una massa identica a U. m⁵C viene scelto come modello per le modifiche che alterano la massa per dimostrare la robustezza dell'approccio.
   
   RNA #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3'
   RNA #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3'
   RNA #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3'
   RNA #4: 5'-HO-GCGUACAUCUUCCCCUUUAU-OH-3'
   RNA #5: 5'-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3'
   RNA #6: 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm⁵CUGAG-OH-3'
    
2. Sciogliere ciascun RNA sintetico in acqua trattata con dietil pirocarbonato (DEPC) esente da nucleasi (espressa come H₂O trattata con DEPC, salvo diversa indicazione) per ottenere una soluzione madre di RNA 100 mM. Le soluzioni madre vengono conservate a lungo termine a -20 °C.
3. Per evitare la possibile degradazione del campione di RNA, utilizzare materiali sperimentali privi di RNasi, tra cui acqua trattata con DEPC, provette per microcentrifuga e puntali per pipette. Pulire frequentemente le superfici delle forniture di laboratorio utilizzando salviette per l'eliminazione della RNasi.

2. Marcare l'estremità 3' degli RNA con la biotina

1. Protocollo di reazione in due fasi (adenilazione e legatura)
   1. Aggiungere 1 μL di tampone di reazione di adenilazione 10x contenente 50 mM di acetato di sodio, pH 6,0, 10 mM di MgCl₂, 5 mM di diclorodifeniltricloroetano (DTT), 0,1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1 μL di 1 mM di ATP, 1 μL di 100 μM di citidina bisfosfato biotinilato (pCp-biotina), 1 μL di 50 μM di Mth RNA ligasi e 6 μL di H₂O trattato con DEPC (un volume totale di 10 μL) in una provetta PCR da 0,2 mL priva di RNasi.
      NOTA: Conservare i reagenti a -20 °C prima della reazione in due fasi. Scongelare i reagenti a temperatura ambiente e mescolare bene agitando e centrifugando prima di aggiungerli alla reazione.
   2. Incubare la reazione in una macchina per PCR a 65 °C per 1 ora e inattivare la reazione a 85 °C per 5 minuti.
   3. Condurre la fase di legatura in una provetta PCR da 0,2 mL priva di RNasi, a parete sottile, contenente 10 μL di soluzione di reazione della fase precedente, aggiungendo 3 μL di tampone di reazione 10x T4 RNA ligasi contenente 50 mM di tris(idrossimetil)amminometano (Tris)-HCl, pH 7,8, 10 mM di MgCl₂, 1 mM DTT, 1,5 μL del campione di 100 mM dell'RNA da sequenziare, 3 μL di dimetilsolfossido anidro (DMSO) per raggiungere il 10% (v/v), 1 μL di Rna ligasi T4 (10 unità/μL) e 11,5 μL di H₂O trattato con DEPC (per un volume totale di 30 mL). Incubare la reazione per una notte a 16 °C in una macchina per PCR.
      NOTA: Combinare i componenti di reazione a temperatura ambiente a causa dell'alto punto di congelamento del DMSO (18,45 °C).
   4. Incubare la reazione per una notte a 16 °C.
   5. Estinguere e purificare la reazione mediante purificazione su colonna per rimuovere gli enzimi e la pCp-biotina libera utilizzando Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Nel kit sono forniti il tampone di legame Oligo, il tampone di lavaggio del DNA, le colonne di centrifuga e le provette di raccolta. Aggiungere 20 mL di H₂O trattato con DEPC alla soluzione di reazione per raggiungere un volume di campione di 50 mL prima di aggiungere il tampone legante.
   6. Aggiungere 100 mL di tampone legante a ciascuna soluzione di reazione. Aggiungere 400 μl di etanolo, miscelare pipettando e trasferire la miscela nella colonna. Centrifugare a 10.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
   7. Aggiungere 750 μl di tampone di lavaggio DNA alla colonna. Centrifugare a 10.000 x g e alla massima velocità rispettivamente per 30 s e 1 minuto.
   8. Trasferire la colonna in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 15 μl di H₂O trattato con DEPC alla colonna e centrifugare a 10.000 x g per 30 s per eluire il prodotto dell'RNA.
      NOTA: I campioni possono essere conservati a -20 °C in questa fase fino all'esecuzione della fase successiva.
2. Protocollo di reazione in un'unica fase
   1. Eseguire una reazione di marcatura in un'unica fase combinando 2 μL di 150 μM di adenosina-5'-5'-difosfato-{5'-(citidina-2'-O-metil-3'-fosfato-TEG}C-biotina (AppCp-biotina), 3 μL di tampone di reazione ligasi 10x, 1,5 μL del campione 100 mM dell'RNA da sequenziare, 3 μL di DMSO anidro per raggiungere il 10% (v/v), 1 μL di Rna ligasi T4 (10 unità/μL), e 19,5 μL di H₂O trattato con DEPC (per un volume totale di 30 mL) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL priva di RNasi.
   2. Incubare la reazione per una notte a 16 °C in una macchina per PCR.
   3. Eseguire la purificazione della colonna come descritto sopra nei passaggi 2.1.5-2.1.8.
      NOTA: Preparare una provetta di reazione separata/esclusiva per ogni campione di RNA (scala di RNA a 150 pmol). Potrebbe essere necessaria la marcatura dell'estremità 5' dell'RNA (o degli RNA) con sulfo-cianine3 (Cy3) o Cy3 (ad esempio, per la verifica del sequenziamento bidirezionale). Il metodo è diverso da quello della 3'-biotinilazione ed è descritto in una precedente pubblicazione⁹.

3. Cattura il campione di RNA biotinilato su perle di streptavidina

1. Attivare 200 μL di perle magnetiche di streptavidina C1 aggiungendo 200 μL di 1 tampone B&W (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL priva di RNasi. Agitare questa soluzione e posizionarla su un supporto magnetico per 2 minuti. Quindi scartare il surnatante pipettando accuratamente la soluzione.
2. Lavare le perle due volte con 200 μL di soluzione A (NaOH 0,1 M trattato con DEPC e NaCl 0,05 M trattato con DEPC) e una volta ogni 200 μL di soluzione B (NaCl 0,1 M trattato con DEPC). Per ogni fase di lavaggio, agitare la soluzione e posizionarla su un supporto magnetico per 2 minuti, quindi scartare il surnatante. Quindi aggiungere 100 μl di tampone 2x B&W (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl).
3. Aggiungere 1 tampone B&W al campione di RNA biotinilato fino a quando il volume non raggiunge 100 μL. Quindi aggiungere questa soluzione alle perle lavate conservate in 100 μL di tampone 2x B&N. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore a piattaforma oscillante a 100 giri/min. Posizionare il tubo su un supporto magnetico per 2 minuti ed eliminare il surnatante.
4. Lavare le perle rivestite 3 volte in 1 tampone B&N e misurare la concentrazione finale di surnatante in ogni fase di lavaggio con Nanodrop per l'analisi di recupero, per confermare che le molecole di RNA bersaglio rimangano sulle perline.
5. Incubare le perle in 10 mM di EDTA, pH 8,2 con formammide al 95% a 65 °C per 5 minuti in una macchina per PCR. Tenere la provetta sul supporto magnetico per 2 minuti e raccogliere il surnatante (contenente gli RNA biotinilati rilasciati dalle perle di streptavidina) mediante pipetta.
   NOTA: Questa fase di separazione fisica prima della degradazione dell'acido viene utilizzata solo per il sequenziamento dell'RNA#1 nella Figura 1c e non è obbligatoria per il 2D-HELS MS Seq poiché l'etichetta idrofoba della biotina può causare un t_R significativamente ritardato nei frammenti della scala marcati con 3' durante la misurazione LC-MS, il che può distinguere chiaramente i frammenti della scala 3' marcati dai frammenti della scala 5' non marcati nel grafico 2D massa-t_R .

4. Idrolisi acida dell'RNA per generare scale di SM per il sequenziamento

1. Dividi ogni campione di RNA in tre aliquote uguali. Ad esempio, dividere un campione di RNA con un volume di 15 μL di campione di RNA in tre aliquote da 5 μL.
2. Aggiungere un volume uguale di acido formico per ottenere il 50% (v/v) di acido formico nella miscela di reazione ^8,9.
3. Incubare la reazione a 40 °C in una macchina per PCR, con una reazione in esecuzione rispettivamente per 2 minuti, una per 5 minuti e una per 15 minuti.
4. Estinguere la degradazione acida congelando immediatamente il campione su ghiaccio secco al termine di ogni reazione.
5. Utilizzare un concentratore centrifugo sottovuoto per asciugare il campione. Il campione viene in genere completamente essiccato entro 30 minuti e l'acido formico viene rimosso insieme a H₂O durante il processo di essiccazione perché l'acido formico ha un punto di ebollizione (100,8 °C) simile a quello di H₂O (100 °C).
6. Sospendere e combinare un totale di tre campioni essiccati in 20 μL di H₂O trattato con DEPC per la misura LC-MS.
   NOTA: I campioni possono essere conservati a -20 °C in questa fase in attesa della misurazione LC-MS.

5. Converti ψ in addotto CMC-ψ

1. Aggiungere 80 μL di H₂O trattato con DEPC in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL priva di RNasi contenente 0,0141 g di N-cicloesil-Nʹ-(2-morfolinoetil)-carbodiimmide metho-p-toluenesulfonato (CMC) e 0,07 g di urea. Aggiungere 10 μl del campione stock di 100 μM dell'RNA da sequenziare, 8 μl di tampone bicina 1 M (pH 8,3) e 1,28 μl di EDTA 0,5 M. Aggiungere H₂O trattato con DEPC per raggiungere un volume totale di 160 μL. Le concentrazioni finali sono 0,17 M CMC, 7 M urea e 4 mM EDTA in 50 mM di bicina (pH 8,3)¹¹.
   NOTA: Questo protocollo è applicabile sia a una singola sequenza di RNA sintetica che a miscele di RNA.
2. Dividere la soluzione di reazione da 160 μL in quattro aliquote uguali in provette PCR da 0,2 mL prive di RNasi e a parete sottile e incubare a 37 °C per 20 minuti in una macchina per PCR.
   NOTA: 50 μl per provetta è il volume massimo di reazione che può essere utilizzato in una macchina per PCR.
3. Estinguere ogni reazione con 10 μl di acetato di sodio 1,5 M e EDTA 0,5 mM (pH 5,6).
4. Eseguire la purificazione della colonna con quattro colonne di centrifuga parallele per rimuovere i reagenti in eccesso secondo la procedura descritta nei passaggi 2.1.5-2.1.8. Sciogliere il prodotto purificato in 15 μl di H₂O trattato con DEPC in ciascuna provetta per microcentrifuga da 1,5 mL priva di RNasi.
5. Trasferire il prodotto purificato in quattro provette PCR da 0,2 mL prive di RNasi e a parete sottile. Aggiungere 20 μl di tampone 0,1 M Na₂CO₃ (pH 10,4) in ogni 15 μl di prodotto purificato e aggiungere H₂O trattato con DEPC per ottenere un volume finale di 40 μl per ciascuna provetta di reazione (in totale quattro provette). Incubare la reazione a 37 °C per 2 ore in una macchina per PCR.
6. Estinguere e purificare la reazione mediante purificazione su colonna con quattro colonne di spin parallele, come descritto al punto 2.1.5. Eluire il prodotto convertito in CMC-ψ in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL priva di RNasi con 15 μL di H₂O trattato con DEPC.
7. Combinare il campione convertito CMC-ψ purificato da quattro provette di raccolta in un'unica provetta. Eseguire la degradazione dell'acido formico al 50% (v/v) secondo le procedure descritte nei passaggi 4.1-4.6 per generare scale MS per il sequenziamento.

6. Misurazione LC-MS

1. Prepara le fasi mobili per la misurazione LC-MS. La fase mobile A è costituita da 25 mM di esafluoro-2-propanolo con 10 mM di diisopropilammina in acqua di grado LC-MS; la fase mobile B è il metanolo.
2. Trasferire il campione nella fiala LC-MS per l'analisi. Ogni volume di iniezione del campione è di 20 μl contenente 100-400 pmol di RNA.
3. Utilizzare le seguenti condizioni LC: temperatura della colonna di 35 °C, portata di 0,3 mL/min; un gradiente lineare dal 2 al 20% della fase mobile B in 15 minuti, seguito da una fase di lavaggio di 2 minuti con il 90% della fase B mobile.
   NOTA: Per le etichette terminali più idrofobiche come Cy3 e sulfo-Cy3 come menzionato nella Sezione 2, potrebbe essere necessaria una percentuale più elevata di solvente organico per l'eluizione del campione (ad esempio, è possibile utilizzare un gradiente simile ma con un intervallo percentuale maggiore della fase B mobile). Ad esempio, 2-38% di fase B mobile in 30 minuti con una fase di lavaggio di 2 minuti con 90% di fase B mobile.
4. Separa e analizza i campioni su uno spettrometro di massa Agilent Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) accoppiato a un sistema LC dotato di un autocampionatore e di un sistema MS HPLC (High Performance Liquid Chromatography). La colonna LC è una colonna C18 di 50 mm x 2,1 mm con una dimensione delle particelle di 1,7 μm. Utilizzare le seguenti impostazioni MS: modalità ioni negativi; portata, da 350 m/z a 3200 m/z; velocità di scansione, 2 spettri/s; flusso di gas di essiccazione, 17 L/min; temperatura del gas di essiccazione, 250 °C; pressione del nebulizzatore, 30 psig; tensione capillare, 3500 V; e tensione di frammentazione, 365 V. Si prega di notare che questi parametri sono specifici per il tipo o il modello di spettrometro di massa utilizzato.
5. Acquisisci dati con il software di acquisizione Agilent MassHunter. Utilizza il flusso di lavoro di estrazione delle caratteristiche molecolari (MFE) Agilent per estrarre informazioni sui composti, tra cui massa, tempo di ritenzione, volume (l'abbondanza MFE per le rispettive specie ioniche) e punteggio di qualità, ecc. Utilizzare le seguenti impostazioni MFE: "formato dati centroide, piccole molecole (cromatografiche), picco con altezza ≥ 100, fino a un massimo di 1000, punteggio di qualità ≥ 50".
   NOTA: Ottimizza le impostazioni MFE per estrarre il maggior numero possibile di composti potenziali, fino a un massimo di 1000, con punteggi di qualità di ≥ 50.

7. Automatizzare la generazione di sequenze di RNA mediante un algoritmo computazionale

NOTA: Questa procedura è mostrata solo per l'RNA #1 nella Figura 1c.

1. Ordina i composti estratti MFE in ordine decrescente di volume (intensità di picco) e t_R. Eseguire la preselezione dei dati tramite 1) impostando t_R da 4 a 10 minuti per selezionare i frammenti di RNA marcati dalla biotina, poiché i t_Rs dei componenti della scala di massa marcati con biotina vengono spostati in questa finestra t_R (da 4 minuti a 10 minuti) e 2) utilizzando un ordine di grandezza superiore ai composti di input rispetto al numero di frammenti della scala per il calcolo dell'algoritmo per ridurre la quantità di dati in base al volume. Ad esempio, per un RNA di 20 nt, saranno necessari 20 componenti della scala_R di massa-t marcati per il sequenziamento dell'RNA di 20 nt e, quindi, 200 composti dal file di dati MFE saranno selezionati in base al volume. Si prega di notare che la finestra t_R può essere diversa quando viene utilizzato un tipo o un modello diverso di spettrometro di massa.
2. Eseguire l'elaborazione dei dati e la generazione di sequenze di RNA #1 utilizzando una versione rivista di un algoritmo pubblicato⁸. I codici sorgente dell'algoritmo rivisto sono descritti in precedenza (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)⁹.
3. Oltre ad automatizzare la generazione di sequenze utilizzando l'algoritmo, calcola manualmente le differenze di massa tra due componenti ladder adiacenti per la chiamata delle basi. Tutte le basi dell'RNA possono essere chiamate manualmente e abbinate a quelle teoriche nel database dei nucleotidi e delle modificazioni dell'RNA⁸; pertanto, la sequenza completa del filamento di RNA può essere letta con precisione manualmente, il che viene utilizzato per confermare l'accuratezza della sequenza riportata dall'algoritmo letta. Altre strutture di modificazioni dell'RNA possono essere trovate nei database di modificazione dell'RNA¹² e le loro masse teoriche corrispondenti sono ottenute da ChemBioDraw. Nelle tabelle S1-S2, la differenza di massa ppm (parti per milione) è mostrata quando si confronta la massa osservata con la sua massa teorica per uno specifico componente della ladder, e un valore inferiore a 10 ppm è considerato una buona corrispondenza per ogni chiamata di base.

8. Sequenziamento di miscele di RNA

1. Etichettare una miscela di cinque filamenti di RNA (RNA da #1 a #5) alle loro estremità 3' con A(5')pp(5')Cp-TEG-biotina utilizzando un protocollo in un solo passaggio descritto nel passaggio 2.2. In un volume totale di 150 μL di soluzione di reazione, aggiungere 15 μL di 10x tampone di reazione T4 RNA ligasi, 1,5 μL di ciascun filamento di RNA (100 μM di RNA da #1 a #5, rispettivamente, per un volume totale di 7,5 μL), 10 μL di 150 μM A(5')pp(5')Cp-TEG-biotina, 15 μL di DMSO anidro, 5 μL di Rna ligasi T4 (10 unità/μL) e 97,5 μL di H₂O trattato con DEPC. Distribuire equamente la soluzione di reazione in cinque aliquote. Ogni provetta per microcentrifuga priva di RNasi contiene 30 μL di soluzione di reazione.
2. Incubare la reazione per una notte a 16 °C in una macchina per PCR.
3. Eseguire la purificazione della colonna secondo la procedura descritta nei passaggi 2.1.5-2.1.8 con cinque colonne di centrifuga parallele. Eluire un campione di miscela di 5 filamenti di RNA 3'-biotinilati (miscela di RNA da #1 a #5) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL priva di RNasi ciascuna con 15 μL di H₂O trattato con DEPC.
4. Combinare i campioni di miscela purificata delle cinque provette di raccolta in un'unica provetta. Eseguire la degradazione dell'acido formico secondo la procedura descritta nella Sezione 4.
5. Misurare i campioni mediante LC-MS come descritto nella Sezione 6 e analizzare i dati utilizzando il software di analisi dei dati con impostazioni MFE ottimizzate per estrarre i dati contenenti massa, t_R e volume come descritto al punto 6.5. L'algoritmo di elaborazione e di chiamata di base tipico non viene applicato a causa della complessità dei dati notevolmente aumentata risultante dalla miscela. Tutte le basi nell'RNA del campione misto sono chiamate manualmente con un metodo simile alla Sezione 7.3 e corrispondono bene con quelle teoriche nel database dei nucleotidi e delle modificazioni^{dell'RNA 8}, quindi le sequenze complete di tutti e cinque i filamenti di RNA nel campione misto vengono lette accuratamente. Nelle tabelle S7-S11, tutte le informazioni sono elencate, tra cui la massa osservata, t_R, volume, punteggio di qualità e differenza di massa in ppm.

Risultati

Introduzione di un tag di biotina all'estremità 3' dell'RNA per produrre scale_R di massa-t facilmente identificabili. Il flusso di lavoro dell'approccio 2D-HELS MS Seq è illustrato nella Figura 1a. L'etichetta idrofoba della biotina introdotta all'estremità 3' dell'RNA (vedi Sezione 2) aumenta le masse e i t_Rs dei componenti ladder marcati con 3' rispetto a quelli delle loro controparti non marcate. Pertanto, la curv...

Discussione

A differenza della frammentazione MS basata sul tandem, l'idrolisi acida altamente controllata viene utilizzata nell'approccio 2D-HELS MS Seq per frammentare l'RNA prima dell'analisi con uno spettrometro di massa ^9,10. Di conseguenza, ogni frammento degradato con acido può essere rilevato dallo strumento, formando l'equivalente di una scala di sequenziamento. In condizioni ottimali, questo metodo crea una scala di sequenza "idea...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5' DNA Adenylation kit	New England Biolabs	E2610S	50uM concentration
6550 Q-TOF mass spectrometer	Agilent Technologies	5991-2116EN	Coupled to a 1290 Infinity LC system
A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotin-3´	ChemGenes	91718	HPLC purified
ATPγS	Sigma-Aldrich	11162306001	Lithium salt
Bicine	Sigma-Aldrich	B8660	BioXtra, ≥99% (titration)
Biotin maleimide	Vector Laboratories	SP-1501	Long arm
C18 column	Waters	186003532	50 mm × 2.1 mm Xbridge C18 column with a particle size of 1.7 μm
Centrifugal Vacuum Concentrator	Labconco	Refrig 115v/60hz 7310022	Labconco CentriVap
ChemBioDraw	PerkinElmer	ChemDraw Prime	Generate a chemical structure and property data of structures & fragments
CMC (N-cyclohexyl-N?-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)	Sigma-Aldrich	2491-17-0	95% Purifiy
Cyanine3 maleimide (Cy3)	Lumiprobe	11080	Water insoluble
DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906	Autoclaved, certified nuclease-free
Diisopropylamine (DIPA)	Thermo Fisher Scientific	108-18-9	99% Alfa Aesar
DMSO	Sigma-Aldrich	276855	Anhydrous dimethyl sulfoxide, 99.9%
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	Anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture
Formic acid	Merck	64-18-6	98-100%, ACS reag, Ph Eur
Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	920-66-1	99% Acros Organics
LC-MS sample vials	Thermo Fisher Scientific	C4000-11	Plastic screw thread vials
LC-MS vial caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-54A	Autosampler vial screw thread caps
Na2CO3 buffer	Sigma-Aldrich	88975	BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4060	Spin column
OriginLab	OriginLab	OriginPro	Data analysis and graphing software
pCp-biotin	TriLink BioTechnologies	NU-1706-BIO	20 ul (1 mM)
RNA #1--#6	Integrated DNA Technologies	Custom RNA oligos	19nt-21nt single-stranded RNAs, used without further purification
Rocking platform shaker	VWR	Orbital Shaker Standard 1000	Speed Range 40 to 300 rpm
Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88816	Binding approx. 55ug biotinylated rabbit lgG per mg of beads
Sulfonated Cyanine3 maleimide	Lumiprobe	11380	Water soluble
T4 DNA ligase 1	New England Biolabs	M0202S	400 units/uL
T4 polynucleotide kinase	Sigma-Aldrich	T4PNK-RO	From phage T4 am N81 pse T1 infected Escherichia coli BB
Tris-HCl buffer	Sigma-Aldrich	T6455	Tris-HCl Buffer, pH 10, 10×, Antigen Retriever
Urea	Sigma-Aldrich	81871	Urea for synthesis. CAS No. 57-13-6, EC Number 200-315-5.