2D-HELS MS Seq : une méthode générale basée sur LC-MS pour le séquençage direct et de novo de mélanges d’ARN avec différentes modifications nucléotidiques

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une méthode de séquençage basée sur la LC-MS qui peut être utilisée comme méthode directe pour séquencer l’ARN court (<35 nt par exécution) sans intermédiaire d’ADNc, et comme méthode générale pour séquencer différentes modifications nucléotidiques dans une seule étude avec une précision de base unique.

Résumé

Les approches de séquençage basées sur la spectrométrie de masse (MS) se sont révélées utiles pour le séquençage direct de l’ARN sans avoir besoin d’un intermédiaire d’ADN complémentaire (ADNc). Cependant, de telles approches sont rarement appliquées comme méthode de séquençage de novo de l’ARN, mais utilisées principalement comme un outil pouvant aider à l’assurance de la qualité pour confirmer les séquences connues d’échantillons d’ARN simple brin purifiés. Récemment, nous avons développé une méthode de séquençage direct de l’ARN en intégrant une stratégie de marquage hydrophobe à 2 dimensions dans le séquençage basé sur la MS (2D-HELS MS Seq). Cette méthode est capable de séquencer avec précision des séquences d’ARN uniques ainsi que des mélanges contenant jusqu’à 12 séquences d’ARN distinctes. En plus des quatre ribonucléotides canoniques (A, C, G et U), la méthode a la capacité de séquencer des oligonucléotides d’ARN contenant des nucléotides modifiés. Cela est possible parce que la nucléobase modifiée a soit une masse intrinsèquement unique qui peut aider à son identification et à son emplacement dans la séquence d’ARN, soit peut être convertie en un produit avec une masse unique. Dans cette étude, nous avons utilisé l’ARN, incorporant deux nucléotides modifiés représentatifs (pseudouridine (Ψ) et 5-méthylcytosine (m⁵C)), pour illustrer l’application de la méthode pour le séquençage de novo d’un seul oligonucléotide d’ARN ainsi que d’un mélange d’oligonucléotides d’ARN, chacun avec une séquence différente et/ou des nucléotides modifiés. Les procédures et les protocoles décrits ici pour séquencer ces ARN modèles seront applicables à d’autres échantillons d’ARN courts (<35 nt) lors de l’utilisation d’un système LC-MS standard à haute résolution, et peuvent également être utilisés pour la vérification de séquence d’oligonucléotides d’ARN thérapeutiques modifiés. À l’avenir, avec le développement d’algorithmes plus robustes et de meilleurs instruments, cette méthode pourrait permettre le séquençage d’échantillons biologiques plus complexes.

Introduction

Des méthodes de séquençage basées sur la spectrométrie de masse (MS), y compris la MS descendante et la MS^en tandem 1,2,3,4, ont été développées pour le séquençage direct de l’ARN. Cependant, les techniques de fragmentation in situ permettant de générer efficacement des échelles d’ARN de haute qualité dans les spectromètres de masse ne peuvent actuellement pas être appliquées au séquençage de novo ^5,6. De plus, il n’est pas très trivial d’analyser les données MS unidimensionnelles (1D) traditionnelles pour le séquençage de novo d’une seule séquence d’ARN purifié, et ce serait encore plus difficile pour le séquençage MS d’échantillons d’ARN mixtes ^7,8. Par conséquent, une méthode de séquençage de l’ARN bidimensionnelle (2D) basée sur la chromatographie liquide (LC)-MS a été développée, intégrant la production d’échelles de temps de rétention de masse (t_R) 2D pour remplacer les échelles de masse 1D, ce qui facilite grandement l’identification des composants de l’échelle nécessaires au séquençage de novo des ARN⁸. Cependant, la méthode de séquençage de l’ARN basée sur la LC-MS 2D est principalement limitée à l’ARN court synthétique purifié, car elle ne peut pas lire une séquence complète uniquement sur la base d’une seule échelle, mais doit s’appuyer sur deux échelles adjacentes coexistantes (échelles 5' et 3')⁸. Plus précisément, cette approche nécessite des lectures bidirectionnelles à extrémités appariées pour la lecture des nucléobases terminales dans la région de faible masse⁸. La complexité supplémentaire de la lecture des extrémités appariées fait que cette méthode est intenable pour le séquençage des mélanges d’ARN, car la confusion est soulevée quant à savoir quel fragment d’échelle appartient à quelle échelle pour les échantillons inconnus.

Pour surmonter les obstacles mentionnés ci-dessus dans les approches de séquençage de l’ARN basées sur la SEP et pour élargir ces applications au séquençage direct de l’ARN, deux questions doivent être abordées : 1) comment générer une échelle de masse de haute qualité qui peut être utilisée pour lire une séquence complète, du premier nucléotide au dernier dans un brin d’ARN, et 2) comment identifier efficacement chaque échelle ARN/masse dans un ensemble de données MS complexe. Parallèlement à une dégradation acide bien contrôlée, nous avons développé une nouvelle méthode de séquençage en introduisant une stratégie de marquage hydrophobe (HELS) dans la technique de séquençage basée sur la MS, et nous avons résolu avec succès ces deux problèmes en ajoutant un marqueur hydrophobe à l’extrémité 5' et/ou 3' des ARN à séquencer⁹. Cette méthode crée une échelle de séquence « idéale » à partir de l’ARN : chaque fragment d’échelle dérive d’un clivage d’ARN spécifique au site exclusivement au niveau de chaque liaison phosphodiester, et la différence de masse entre deux fragments d’échelle adjacents est la masse exacte du nucléotide ou de la modification du nucléotide à cette position ^8,9,10. Cela est possible parce que nous incluons une étape d’hydrolyse acide hautement contrôlée, qui fragmente l’ARN, en moyenne, une fois par molécule, avant qu’il ne soit injecté dans l’instrument. En conséquence, chaque produit de fragment de dégradation est détecté sur le spectromètre de masse et tous les fragments forment ensemble une échelle de séquençage ^8,9,10. Cette nouvelle stratégie permet une lecture complète d’une séquence d’ARN à partir d’une seule échelle d’un brin d’ARN sans lecture d’extrémité appariée de l’autre échelle de l’ARN, et permet en outre le séquençage par MS de mélanges d’ARN avec plusieurs brins différents contenant des modifications nucléotidiques combinatoires⁹. En ajoutant une étiquette à l’extrémité 5' et/ou 3' de l’ARN, les fragments d’échelle marqués présentent un retard significatif de t_R, ce qui peut aider à distinguer les deux échelles de masse l’une de l’autre et aussi de la région bruyante de faible masse. Le décalage mass-t_R provoqué par l’ajout de l’étiquette hydrophobe facilite l’identification de l’échelle de masse et simplifie l’analyse des données pour la génération de séquences. De plus, l’ajout de l’étiquette hydrophobe peut aider à identifier la base terminale dans le brin en empêchant son fragment d’échelle correspondant d’être dans la région bruyante de faible masse_R en raison de l’augmentation de la masse et de l’hydrophobie causée par l’étiquette, permettant ainsi l’identification de la séquence complète d’un ARN à partir d’une seule échelle ; Aucune lecture d’extrémité appariée n’est requise. En conséquence, nous avons déjà démontré le séquençage réussi d’un mélange complexe de jusqu’à 12 brins d’ARN distincts sans l’utilisation d’un algorithme de séquençage avancé⁹, ce qui ouvre la porte au séquençage MS de novo d’ARN contenant à la fois des nucléotides canoniques et modifiés et rend plus réalisable le séquençage d’échantillons d’ARN mixtes et plus complexes. En fait, en utilisant 2D-HELS MS Seq, nous avons même réussi à séquencer une population mixte d’échantillons d’ARNt¹⁰ et nous étendons activement son application à d’autres échantillons d’ARN complexes.

Pour faciliter le séquençage direct d’un plus large éventail d’échantillons d’ARN par 2D-HELS MS Seq, nous nous concentrerons ici sur les aspects techniques de cette approche de séquençage et couvrirons toutes les étapes essentielles nécessaires lors de l’application de la technique au séquençage direct d’échantillons d’ARN. Des exemples spécifiques seront utilisés pour illustrer la technique de séquençage, y compris des séquences d’ARN uniques synthétiques, des mélanges de plusieurs séquences d’ARN distinctes et des ARN modifiés contenant à la fois des nucléotides canoniques et modifiés tels que la pseudouridine (ψ) et la 5-méthylcytosine (m⁵C). Étant donné que les ARN contiennent tous des liaisons phosphodiester, tout type d’ARN peut être hydrolysé à l’acide pour générer une échelle de séquence idéale pour le séquençage 2D-HELS MS Seq dans des conditions optimales ^8,9. Cependant, la détection de tous les fragments d’échelle d’un ARN donné dépend de l’instrument. Sur un LC-MS haute résolution standard (40K), la quantité de charge minimale pour le séquençage d’un échantillon d’ARN court purifié (<35 nt) est de 100 pmol par passage. Cependant, il faut plus de matériel (jusqu’à 400 pmol par échantillon d’ARN) lorsque des expériences supplémentaires doivent être menées (p. ex., pour distinguer les modifications de bases isomères qui partagent des masses identiques). Le protocole utilisé pour le séquençage du modèle d’ARN modifiés synthétiques sera également applicable au séquençage d’échantillons d’ARN plus larges, y compris des échantillons d’ARN biologiques avec des modifications de base inconnues. Cependant, une quantité d’échantillon encore plus importante, telle que 1000 pmol pour le séquençage de l’ARNt (~76 nt) à l’aide d’un instrument LC-MS standard, est nécessaire pour séquencer l’ARNt complet avec toutes les modifications, et un algorithme avancé doit être développé pour son séquençage de novo ¹⁰.

Protocole

1. Concevoir des oligonucléotides d’ARN

1. Concevoir des oligonucléotides d’ARN synthétiques de différentes longueurs (19 nt, 20 nt et 21 nt), dont un (ARN #6) avec des nucléotides canoniques et modifiés. ψ est utilisé comme modèle pour les modifications non altérant la masse, ce qui est difficile pour le séquençage MS car il a une masse identique à U. m⁵C est choisi comme modèle pour les modifications altérant la masse afin de démontrer la robustesse de l’approche.
   
   ARN #1 : 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCIAAA-OH-3'
   ARN #2 : 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3'
   ARN #3 : 5'-HO-AAACCGUUACCAUACUGAG-OH-3'
   ARN #4 : 5'-HO-GCGUACAUCUUCCCCUUUAU-OH-3'
   ARN #5 : 5'-HO-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3'
   ARN #6 : 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm⁵CUGAG-OH-3'
    
2. Dissoudre chaque ARN synthétique dans de l’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle sans nucléases (exprimée en H₂O traitée au DEPC, sauf indication contraire) pour obtenir une solution mère d’ARN de 100 mM. Les solutions mères sont stockées à long terme à -20 °C.
3. Pour éviter une éventuelle dégradation de l’échantillon d’ARN, utilisez des fournitures expérimentales exemptes de RNase, notamment de l’eau traitée au DEPC, des tubes de microcentrifugation et des pointes de pipette. Essuyez fréquemment les surfaces des fournitures de laboratoire à l’aide de lingettes d’élimination de la RNase.

2. Étiqueter l’extrémité 3' des ARN avec de la biotine

1. Protocole de réaction en deux étapes (adénylation et ligature)
   1. Ajouter 1 μL de tampon de réaction d’adénylation 10x contenant 50 mM d’acétate de sodium, pH 6,0, 10 mM de MgCl₂, 5 mM de dichlorodiphényltrichloroéthane (DTT), 0,1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 1 μL de 1 mM d’ATP, 1 μL de 100 μM de bisphosphate de cytidine biotinylé (pCp-biotine), 1 μL de 50 μM d’ARN ligase et 6 μL de H₂O traité au DEPC (un volume total de 10 μL) dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 mL sans RNase.
      REMARQUE : Stockez les réactifs à -20 °C avant la réaction en deux étapes. Décongelez les réactifs à température ambiante et mélangez bien par vortex et centrifugation avant de les ajouter à la réaction.
   2. Incuber la réaction dans une machine PCR à 65 °C pendant 1 h et inactiver la réaction à 85 °C pendant 5 min.
   3. Effectuer l’étape de ligature dans un tube PCR de 0,2 mL sans RNase, à paroi mince, contenant 10 μL de solution réactionnelle de l’étape précédente en ajoutant 3 μL de tampon de réaction 10x T4 RNA ligase contenant 50 mM de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1,5 μL du stock d’échantillon de 100 mM de l’ARN à séquencer, 3 μL de diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) pour atteindre 10 % (v/v), 1 μL d’ARN ligase T4 (10 unités/μL) et 11,5 μL de H₂O traité au DEPC (pour un volume total de 30 mL). Incuber la réaction pendant une nuit à 16 °C dans un appareil de PCR.
      REMARQUE : Combinez les composants de la réaction à température ambiante en raison du point de congélation élevé du DMSO (18,45 °C).
   4. Incuber la réaction pendant la nuit à 16 °C.
   5. Tremper et purifier la réaction par purification de la colonne pour éliminer les enzymes et la pCp-biotine libre à l’aide d’Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Le tampon de liaison à l’oligo, le tampon de lavage de l’ADN, les colonnes d’essorage et les tubes de collecte sont fournis dans le kit. Ajouter 20 mL de H₂O traité au DEPC à la solution réactionnelle pour atteindre un volume d’échantillon de 50 mL avant d’ajouter le tampon de liaison.
   6. Ajouter 100 mL de tampon de liaison à chaque solution réactionnelle. Ajouter 400 μL d’éthanol, mélanger par pipetage et transférer le mélange dans la colonne. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
   7. Ajoutez 750 μL de tampon de lavage d’ADN dans la colonne. Centrifugeuse à 10 000 x g et vitesse maximale pendant 30 s et 1 minute, respectivement.
   8. Transférez la colonne dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 15 μL de H₂O traité au DEPC dans la colonne et centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s pour éluer le produit ARN.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C à ce stade jusqu’à ce que l’étape suivante soit effectuée.
2. Protocole de réaction en une étape
   1. Effectuer une réaction de marquage en une seule étape en combinant 2 μL d’adénosine-5'-5'-diphosphate-{5'-(cytidine-2'-O-méthyl-3'-phosphate-TEG}C-biotine (AppCp-biotine), 3 μL de tampon de réaction 10x ligase, 1,5 μL du stock d’échantillon de 100 mM de l’ARN à séquencer, 3 μL de DMSO anhydre pour atteindre 10 % (v/v), 1 μL d’ARN ligase T4 (10 unités/μL), et 19,5 μL de H₂O traité au DEPC (pour un volume total de 30 mL) dans un tube de microcentrifugation sans RNase de 1,5 mL.
   2. Incuber la réaction pendant une nuit à 16 °C dans un appareil de PCR.
   3. Effectuez la purification de la colonne comme décrit ci-dessus aux étapes 2.1.5 à 2.1.8.
      REMARQUE : Préparez un tube réactionnel séparé/exclusif pour chaque échantillon d’ARN (échelle de 150 pmol d’ARN). Le marquage de l’extrémité 5' de l’ARN avec de la sulfo-cyanine3 (Cy3) ou du Cy3 peut être nécessaire (par exemple, pour la vérification du séquençage bidirectionnel). La méthode est différente de celle de la 3'-biotinylation et est décrite dans une publication précédente⁹.

3. Capturer un échantillon d’ARN biotinylé sur des billes de streptavidine

1. Activez 200 μL de billes magnétiques de streptavidine C1 en ajoutant 200 μL de 1 tampon N&B (5 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM d’EDTA, 1 M de NaCl) dans un tube de microcentrifugation sans RNase de 1,5 mL. Vartex cette solution et placez-la sur un support magnétique pendant 2 min. Ensuite, jetez le surnageant en pipetant soigneusement la solution.
2. Lavez les billes deux fois avec 200 μL de solution A (NaOH 0,1 M traité au DEPC et 0,05 M NaCl traité au DEPC) et une fois dans 200 μL de solution B (NaCl 0,1 M traité au DEPC). Pour chaque étape de lavage, agitez la solution et placez-la sur un support magnétique pendant 2 min, puis jetez le surnageant. Ajouter ensuite 100 μL de tampon 2x N&B (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM d’EDTA, 2 M de NaCl).
3. Ajouter 1 tampon N&B à l’échantillon d’ARN biotinylé jusqu’à ce que le volume atteigne 100 μL. Ajoutez ensuite cette solution aux billes lavées stockées dans 100 μL de tampon 2x N&B. Incuber pendant 30 min à température ambiante sur une plate-forme basculante, agiter à 100 tr/min. Placez le tube sur un support magnétique pendant 2 min et jetez le surnageant.
4. Laver les billes enrobées 3 fois dans 1x tampon N&B et mesurer la concentration finale de surnageant à chaque étape de lavage par Nanodrop pour l’analyse de récupération, afin de confirmer que les molécules d’ARN cibles restent sur les billes.
5. Incuber les billes dans 10 mM d’EDTA, pH 8,2 avec 95 % de formamide à 65 °C pendant 5 min dans une machine PCR. Maintenez le tube sur le support magnétique pendant 2 min et récupérez le surnageant (contenant les ARN biotinylés libérés par les billes de streptavidine) à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : Cette étape de séparation physique avant la dégradation acide n’est utilisée que pour le séquençage de l’ARN#1 dans la figure 1c, et n’est pas obligatoire pour le 2D-HELS MS Seq car le marquage hydrophobe à la biotine peut faire en sorte que les fragments de l’échelle marqués 3' aient un t_R significativement retardé pendant la mesure LC-MS, ce qui permet de distinguer clairement les fragments de l’échelle 3' marqués des fragments de l’échelle 5' non marqués dans le graphique 2D mass-t_R .

4. Hydrolyse acide de l’ARN pour générer des échelles MS pour le séquençage

1. Divisez chaque échantillon d’ARN en trois aliquotes égales. Par exemple, divisez un échantillon d’ARN d’un volume de 15 μL en trois aliquotes de 5 μL.
2. Ajouter un volume égal d’acide formique pour obtenir 50 % (v/v) d’acide formique dans le mélange réactionnel ^8,9.
3. Incuber la réaction à 40 °C dans un appareil de PCR, avec une réaction pendant 2 min, une pendant 5 min et une pendant 15 min, respectivement.
4. Éteindre la dégradation acide en congelant immédiatement l’échantillon sur de la glace sèche après la fin de chaque réaction.
5. Utilisez un concentrateur centrifuge sous vide pour sécher l’échantillon. L’échantillon est généralement complètement séché en 30 minutes, et l’acide formique est éliminé avec le H₂O pendant le processus de séchage, car l’acide formique a un point d’ébullition (100,8 °C) similaire à celui du H₂O (100 °C).
6. Mettez en suspension et combinez un total de trois échantillons séchés dans 20 μL de H₂O traité au DEPC pour la mesure LC-MS.
   REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C à ce stade en attendant la mesure LC-MS.

5. Convertir ψ en adduction CMC-ψ

1. Ajouter 80 μL de H₂O traité au DEPC dans un tube de microcentrifugation sans RNase de 1,5 mL contenant 0,0141 g de N-cyclohexyl-Nʹ-(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide métho-p-toluènesulfonate (CMC) et 0,07 g d’urée. Ajouter 10 μL de l’échantillon de 100 μM de l’ARN à séquencer, 8 μL de tampon de bicine 1 M (pH 8,3) et 1,28 μL d’EDTA 0,5 M. Ajouter du H₂O traité au DEPC pour atteindre un volume total de 160 μL. Les concentrations finales sont de 0,17 M CMC, 7 M d’urée et 4 mM d’EDTA dans 50 mM de bicine (pH 8,3)¹¹.
   REMARQUE : Ce protocole s’applique soit à une seule séquence d’ARN synthétique, soit à des mélanges d’ARN.
2. Divisez la solution réactionnelle de 160 μL en quatre aliquotes égales dans des tubes PCR de 0,2 mL sans RNase et à paroi mince et incubez à 37 °C pendant 20 min dans un appareil de PCR.
   REMARQUE : 50 μL par tube est le volume de réaction maximal pouvant être utilisé dans une machine PCR.
3. Tremper chaque réaction avec 10 μL d’acétate de sodium 1,5 M et 0,5 mM d’EDTA (pH 5,6).
4. Effectuer la purification de la colonne à l’aide de quatre colonnes de centrifugation parallèles pour éliminer les réactifs en excès conformément à la procédure décrite aux étapes 2.1.5 à 2.1.8. Dissoudre le produit purifié dans 15 μL de H₂O traité au DEPC dans chaque tube de microcentrifugation sans RNase de 1,5 mL.
5. Transférez le produit purifié dans quatre tubes PCR de 0,2 mL sans RNase et à paroi mince. Ajouter 20 μL de tampon CO₃ 0,1 M Na₂(pH 10,4) dans chaque 15 μL de produit purifié et ajouter du H₂O traité au DEPC pour obtenir un volume final de 40 μL pour chaque tube de réaction (au total quatre tubes). Incuber la réaction à 37 °C pendant 2 h dans un appareil de PCR.
6. Tremper et purifier la réaction par purification sur colonne à l’aide de quatre colonnes de centrifugation parallèles, comme décrit à l’étape 2.1.5. Éluer le produit converti CMC-ψ en un tube de microcentrifugation sans RNase de 1,5 mL contenant chacun 15 μL de H₂O traité au DEPC.
7. Combinez l’échantillon converti en CMC-ψ purifié de quatre tubes de collecte en un seul tube. Effectuer la dégradation de l’acide formique à 50 % (v/v) conformément aux procédures décrites aux étapes 4.1 à 4.6 pour générer des échelles MS pour le séquençage.

6. Mesure LC-MS

1. Préparer les phases mobiles pour la mesure LC-MS. La phase mobile A est de 25 mM d’hexafluoro-2-propanol avec 10 mM de diisopropylamine dans de l’eau de qualité LC-MS ; la phase B mobile est le méthanol.
2. Transférez l’échantillon dans un flacon d’échantillon LC-MS pour analyse. Chaque volume d’injection d’échantillon est de 20 μL et contient 100 à 400 pmol d’ARN.
3. Utilisez les conditions LC suivantes : température de la colonne de 35 °C, débit de 0,3 mL/min ; une pente linéaire de 2 à 20 % de phase B mobile sur 15 min, suivie d’une étape de lavage de 2 min avec 90 % de phase B mobile.
   REMARQUE : Pour les étiquettes finales plus hydrophobes telles que Cy3 et sulfo-Cy3, comme mentionné à la section 2, un pourcentage plus élevé de solvant organique peut être nécessaire pour l’élution de l’échantillon (c.-à-d. qu’un gradient similaire peut être utilisé, mais avec une plage de pourcentage accrue de la phase B mobile). Par exemple, 2 à 38 % de phase B mobile sur 30 min avec une étape de lavage de 2 min avec 90 % de phase B mobile.
4. Séparez et analysez les échantillons à l’aide d’un spectromètre de masse Agilent Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) couplé à un système LC équipé d’un passeur d’échantillons et d’un système MS HPLC (High Performance Liquid Chromatography). La colonne LC est une colonne C18 de 50 mm x 2,1 mm avec une taille de particule de 1,7 μm. Utilisez les paramètres MS suivants : mode ions négatifs ; portée, 350 m/z à 3200 m/z ; vitesse de balayage, 2 spectres/s ; débit de gaz de séchage, 17 L/min ; température des gaz de séchage, 250 °C ; pression du nébuliseur, 30 psig ; tension capillaire, 3500 V ; et tension de fragmenteur, 365 V. Veuillez noter que ces paramètres sont spécifiques au type ou au modèle de spectromètre de masse utilisé.
5. Acquérez des données avec le logiciel d’acquisition Agilent MassHunter. Utilisez le flux de travail d’extraction de caractéristiques moléculaires (MFE) d’Agilent pour extraire des informations sur les composés, notamment la masse, le temps de rétention, le volume (l’abondance de MFE pour les espèces d’ions respectives) et le score de qualité, etc. Utilisez les paramètres MFE suivants : « format de données centroïde, petites molécules (chromatographique), pic d’une hauteur ≥ 100, jusqu’à un maximum de 1000, score de qualité ≥ 50 ».
   REMARQUE : Optimisez les paramètres MFE pour extraire autant de composés potentiels que possible, jusqu’à un maximum de 1000, avec des scores de qualité de ≥ 50.

7. Automatiser la génération de séquences d’ARN à l’aide d’un algorithme de calcul

REMARQUE : Cette procédure n’est illustrée que pour l’ARN #1 dans la figure 1c.

1. Trier les composés extraits par MFE par ordre décroissant de volume (intensité maximale) et t_R. Effectuez une présélection des données via 1) le réglage de t_R de 4 à 10 min pour sélectionner les fragments d’ARN marqués par la biotine, puisque les t_Rs des composants de l’échelle de masse marqués à la biotine sont décalés vers cette fenêtre t_R (4 min à 10 min), et 2) en utilisant un ordre de grandeur supérieur des composés d’entrée au nombre de fragments d’échelle pour le calcul de l’algorithme afin de réduire la quantité de données en fonction du volume. Par exemple, pour un ARN de 20 nt, 20 composants de l’échelle mass-t_R marqués seront nécessaires pour le séquençage de l’ARN de 20 nt, et donc, 200 composés du fichier de données MFE seront sélectionnés en fonction du volume. Veuillez noter que la fenêtre t_R peut être différente lorsqu’un type ou un modèle de spectromètre de masse différent est utilisé.
2. Effectuer le traitement des données et la génération de séquences de l’ARN #1 à l’aide d’une version révisée d’un algorithme publié⁸. Les codes sources de l’algorithme révisé sont décrits précédemment (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)⁹.
3. En plus d’automatiser la génération de séquences à l’aide de l’algorithme, calculez manuellement les différences de masse entre deux composants d’échelle adjacents pour l’appel de base. Toutes les bases de l’ARN peuvent être appelées manuellement et appariées aux bases théoriques de la base de données de nucléotides et de modifications de l’ARN⁸ ; ainsi, la séquence complète du brin d’ARN peut être lue manuellement avec précision, ce qui est utilisé pour confirmer la précision de la lecture de séquence rapportée par l’algorithme. D’autres structures de modifications de l’ARN peuvent être trouvées dans les bases de données de modification de l’ARN¹², et leurs masses théoriques correspondantes sont obtenues par ChemBioDraw. Dans les tableaux S1 et S2, la différence de masse en ppm (parties par million) est indiquée en comparant la masse observée à sa masse théorique pour un composant d’échelle spécifique, et une valeur inférieure à 10 ppm est considérée comme une bonne correspondance pour chaque appel de base.

8. Séquençage des mélanges d’ARN

1. Marquez un mélange de cinq brins d’ARN (ARN #1 à #5) à leurs extrémités 3' avec A(5')pp(5')Cp-TEG-biotine en utilisant un protocole en une étape décrit à l’étape 2.2. Dans un volume total de 150 μL de solution réactionnelle, ajouter 15 μL de tampon de réaction 10x T4 RNA ligase, 1,5 μL de chaque brin d’ARN (100 μM de stock d’ARN #1 à #5, respectivement, pour un volume total de 7,5 μL), 10 μL de 150 μM A(5')pp(5')Cp-TEG-biotine, 15 μL de DMSO anhydre, 5 μL d’ARN ligase T4 (10 unités/μL) et 97,5 μL de H₂O traité au DEPC. Répartissez également la solution réactionnelle en cinq aliquotes. Chaque tube de microcentrifugation sans RNase contient 30 μL de solution réactionnelle.
2. Incuber la réaction pendant une nuit à 16 °C dans un appareil de PCR.
3. Effectuez la purification de la colonne conformément à la procédure décrite aux étapes 2.1.5 à 2.1.8 avec cinq colonnes de centrifugation parallèles. Éluer un échantillon de mélange de 5 brins d’ARN biotinylés 3' (mélange d’ARN #1 à #5) dans un tube de microcentrifugation sans RNase de 1,5 mL contenant chacun 15 μL de H₂O traité au DEPC.
4. Combinez les échantillons de mélange purifié des cinq tubes de collecte en un seul tube. Effectuer la dégradation à l’acide formique conformément à la procédure décrite à la section 4.
5. Mesurez les échantillons par LC-MS comme décrit à la section 6 et analysez les données à l’aide du logiciel d’analyse de données avec des paramètres MFE optimisés pour extraire les données contenant la masse, le t_R et le volume, comme décrit à l’étape 6.5. L’algorithme typique de traitement et d’appel de base n’est pas appliqué en raison de la complexité considérablement accrue des données résultant du mélange. Toutes les bases de l’ARN de l’échantillon mixte sont appelées manuellement selon une méthode similaire à la section 7.3 et correspondent bien aux bases théoriques de la base de données⁸ des nucléotides et des modifications de l’ARN, de sorte que les séquences complètes des cinq brins d’ARN de l’échantillon mixte sont lues avec précision. Dans les tableaux S7 à S11, tous les renseignements sont énumérés, y compris la masse observée, t_R, le volume, le score de qualité et la différence de masse en ppm.

Résultats

Introduire une étiquette de biotine à l’extrémité 3' de l’ARN pour produire des échelles de masse-t_R facilement identifiables. Le flux de travail de l’approche 2D-HELS MS Seq est illustré à la figure 1a. Le marquage hydrophobe à la biotine introduit à l’extrémité 3' de l’ARN (voir section 2) augmente les masses et les t_Rs des composants de l’échelle marqués 3' par rapport à ceux de leurs homolo...

Discussion

Contrairement à la fragmentation MS en tandem, l’hydrolyse acide hautement contrôlée est utilisée dans l’approche 2D-HELS MS Seq pour fragmenter l’ARN avant l’analyse avec un spectromètre^{de masse 9,10}. En conséquence, chaque fragment dégradé à l’acide peut être détecté par l’instrument, formant l’équivalent d’une échelle de séquençage. Dans des conditions optimales, cette méthode crée une échell...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5' DNA Adenylation kit	New England Biolabs	E2610S	50uM concentration
6550 Q-TOF mass spectrometer	Agilent Technologies	5991-2116EN	Coupled to a 1290 Infinity LC system
A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotin-3´	ChemGenes	91718	HPLC purified
ATPγS	Sigma-Aldrich	11162306001	Lithium salt
Bicine	Sigma-Aldrich	B8660	BioXtra, ≥99% (titration)
Biotin maleimide	Vector Laboratories	SP-1501	Long arm
C18 column	Waters	186003532	50 mm × 2.1 mm Xbridge C18 column with a particle size of 1.7 μm
Centrifugal Vacuum Concentrator	Labconco	Refrig 115v/60hz 7310022	Labconco CentriVap
ChemBioDraw	PerkinElmer	ChemDraw Prime	Generate a chemical structure and property data of structures & fragments
CMC (N-cyclohexyl-N?-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)	Sigma-Aldrich	2491-17-0	95% Purifiy
Cyanine3 maleimide (Cy3)	Lumiprobe	11080	Water insoluble
DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906	Autoclaved, certified nuclease-free
Diisopropylamine (DIPA)	Thermo Fisher Scientific	108-18-9	99% Alfa Aesar
DMSO	Sigma-Aldrich	276855	Anhydrous dimethyl sulfoxide, 99.9%
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	Anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture
Formic acid	Merck	64-18-6	98-100%, ACS reag, Ph Eur
Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	920-66-1	99% Acros Organics
LC-MS sample vials	Thermo Fisher Scientific	C4000-11	Plastic screw thread vials
LC-MS vial caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-54A	Autosampler vial screw thread caps
Na2CO3 buffer	Sigma-Aldrich	88975	BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4060	Spin column
OriginLab	OriginLab	OriginPro	Data analysis and graphing software
pCp-biotin	TriLink BioTechnologies	NU-1706-BIO	20 ul (1 mM)
RNA #1--#6	Integrated DNA Technologies	Custom RNA oligos	19nt-21nt single-stranded RNAs, used without further purification
Rocking platform shaker	VWR	Orbital Shaker Standard 1000	Speed Range 40 to 300 rpm
Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88816	Binding approx. 55ug biotinylated rabbit lgG per mg of beads
Sulfonated Cyanine3 maleimide	Lumiprobe	11380	Water soluble
T4 DNA ligase 1	New England Biolabs	M0202S	400 units/uL
T4 polynucleotide kinase	Sigma-Aldrich	T4PNK-RO	From phage T4 am N81 pse T1 infected Escherichia coli BB
Tris-HCl buffer	Sigma-Aldrich	T6455	Tris-HCl Buffer, pH 10, 10×, Antigen Retriever
Urea	Sigma-Aldrich	81871	Urea for synthesis. CAS No. 57-13-6, EC Number 200-315-5.