2D-HELS MS Seq: Un método general basado en LC-MS para la secuenciación directa y de novo de mezclas de ARN con diferentes modificaciones de nucleótidos

Resumen

Aquí, describimos un protocolo detallado para un método de secuenciación basado en LC-MS que se puede utilizar como método directo para secuenciar ARN corto (<35 nt por ejecución) sin un intermedio de ADNc, y como método general para secuenciar diferentes modificaciones de nucleótidos en un solo estudio con precisión de una sola base.

Resumen

Se ha demostrado que los enfoques de secuenciación basados en espectrometría de masas (MS) son útiles en la secuenciación directa de ARN sin necesidad de un intermediario de ADN complementario (ADNc). Sin embargo, estos enfoques rara vez se aplican como un método de secuenciación de ARN de novo , sino que se utilizan principalmente como una herramienta que puede ayudar en el aseguramiento de la calidad para confirmar secuencias conocidas de muestras de ARN monocatenario purificadas. Recientemente, desarrollamos un método de secuenciación directa de ARN mediante la integración de una estrategia de etiquetado final hidrofóbico en tiempo de retención de masa en 2 dimensiones en secuenciación basada en MS (2D-HELS MS Seq). Este método es capaz de secuenciar con precisión secuencias individuales de ARN, así como mezclas que contienen hasta 12 secuencias de ARN distintas. Además de los cuatro ribonucleótidos canónicos (A, C, G y U), el método tiene la capacidad de secuenciar oligonucleótidos de ARN que contienen nucleótidos modificados. Esto es posible porque la nucleobase modificada tiene una masa intrínsecamente única que puede ayudar en su identificación y su ubicación en la secuencia de ARN, o se puede convertir en un producto con una masa única. En este estudio, hemos utilizado ARN, incorporando dos nucleótidos modificados representativos (pseudouridina (Ψ) y 5-metilcitosina (m⁵C)), para ilustrar la aplicación del método para la secuenciación de novo de un solo oligonucleótido de ARN, así como una mezcla de oligonucleótidos de ARN, cada uno con una secuencia diferente y/o nucleótidos modificados. Los procedimientos y protocolos descritos aquí para secuenciar estos ARN modelo serán aplicables a otras muestras cortas de ARN (<35 nt) cuando se utilice un sistema LC-MS estándar de alta resolución, y también se pueden utilizar para la verificación de la secuencia de oligonucleótidos de ARN terapéuticos modificados. En el futuro, con el desarrollo de algoritmos más robustos y con mejores instrumentos, este método podría permitir la secuenciación de muestras biológicas más complejas.

Introducción

Se han desarrollado métodos de secuenciación basados en espectrometría de masas (MS), incluida la MS de arriba hacia abajo y la MS en tándem 1,2,3,4, para la secuenciación directa de ARN. Sin embargo, las técnicas de fragmentación in situ para generar eficazmente escaleras de ARN de alta calidad en espectrómetros de masas actualmente no se pueden aplicar a la secuenciación de novo ^5,6. Además, no es muy trivial analizar los datos tradicionales de MS unidimensional (1D) para la secuenciación de novo de incluso una secuencia de ARN purificado, y sería aún más difícil para la secuenciación de MS de muestras de ARN mixto ^7,8. Por lo tanto, se ha desarrollado un método de secuenciación de ARN basado en cromatografía líquida (LC)-MS bidimensional (2D), que incorpora la producción de escaleras de tiempo de retención de masa (t_R) 2D para reemplazar las escaleras de masa 1D, lo que facilita mucho la identificación de los componentes de la escalera necesarios para la secuenciación de novo de ARN⁸. Sin embargo, el método de secuenciación de ARN 2D LC-MS se limita principalmente a ARN corto sintético purificado, ya que no puede leer una secuencia completa basándose únicamente en una sola escalera, sino que debe basarse en dos escaleras adyacentes coexistentes (escaleras de 5' y 3')⁸. Más específicamente, este enfoque requiere lecturas bidireccionales de extremos emparejados para leer nucleobases terminales en la región de baja masa⁸. La complejidad añadida de la lectura de los extremos emparejados hace que este método sea insostenible para la secuenciación de mezclas de ARN porque se genera confusión sobre qué fragmento de escalera pertenece a qué escalera para las muestras desconocidas.

Para superar las barreras mencionadas anteriormente en los enfoques de secuenciación de ARN basados en MS y ampliar dichas aplicaciones en la secuenciación directa de ARN, se deben abordar dos cuestiones: 1) cómo generar una escalera de masa de alta calidad que se pueda utilizar para leer una secuencia completa, desde el primer nucleótido hasta el último en una cadena de ARN, y 2) cómo identificar eficazmente cada escalera de ARN/masa en un conjunto de datos complejos de MS. Junto con la degradación ácida bien controlada, hemos desarrollado un nuevo método de secuenciación mediante la introducción de una estrategia de etiquetado final hidrofóbico (HELS) en la técnica de secuenciación basada en MS, y abordamos con éxito estos dos problemas mediante la adición de una etiqueta hidrofóbica en el extremo 5' y/o 3' de los ARN que se van a secuenciar⁹. Este método crea una escalera de secuencia "ideal" a partir de ARN: cada fragmento de escalera deriva de la escisión de ARN específica del sitio exclusivamente en cada enlace fosfodiéster, y la diferencia de masa entre dos fragmentos de escalera adyacentes es la masa exacta del nucleótido o la modificación del nucleótido en esa posición ^8,9,10. Esto es posible porque incluimos una etapa de hidrólisis ácida altamente controlada, que fragmenta el ARN, en promedio, una vez por molécula, antes de que se inyecte en el instrumento. Como resultado, cada producto de fragmento de degradación se detecta en el espectrómetro de masas y todos los fragmentos juntos forman una escalera de secuenciación ^8,9,10. Esta nueva estrategia permite la lectura completa de una secuencia de ARN de una sola escalera de una cadena de ARN sin la lectura de extremos emparejados de la otra escalera del ARN y, además, permite la secuenciación de MS de mezclas de ARN con múltiples hebras diferentes que contienen modificaciones combinatorias de nucleótidos⁹. Al agregar una etiqueta en el extremo 5' y/o 3' del ARN, los fragmentos de escalera marcados muestran un retraso significativo de t_R, lo que puede ayudar a distinguir las dos escaleras de masa entre sí y también de la región ruidosa de baja masa. El desplazamiento de masa-t_R causado por la adición de la etiqueta hidrofóbica facilita la identificación de la escalera de masa y simplifica el análisis de datos para la generación de secuencias. Además, la adición de la etiqueta hidrofóbica puede ayudar a identificar la base terminal en la hebra al evitar que su fragmento de escalera correspondiente esté en la región_R de baja masa y baja ruido debido al aumento de masa e hidrofobicidad causado por la etiqueta, lo que permite la identificación de la secuencia completa de un ARN a partir de una sola escalera; No se requieren lecturas de extremo emparejado. Como resultado, hemos demostrado previamente la secuenciación exitosa de una mezcla compleja de hasta 12 hebras distintas de ARN sin el uso de ningún algoritmo de secuenciación avanzado⁹, lo que abre la puerta a la secuenciación MS de novo de ARN que contiene nucleótidos canónicos y modificados y lo hace más factible para la secuenciación de muestras de ARN mixtas y más complejas. De hecho, utilizando 2D-HELS MS Seq, incluso hemos secuenciado con éxito una población mixta de muestras de ARNt¹⁰ y estamos ampliando activamente su aplicación a otras muestras de ARN complejas.

Para facilitar que 2D-HELS MS Seq secuencie directamente una gama más amplia de muestras de ARN, aquí nos centraremos en los aspectos técnicos de este enfoque de secuenciación y cubriremos todos los pasos esenciales necesarios al aplicar la técnica hacia la secuenciación directa de muestras de ARN. Se utilizarán ejemplos específicos para ilustrar la técnica de secuenciación, incluidas secuencias sintéticas de ARN único, mezclas de múltiples secuencias de ARN distintas y ARN modificados que contienen nucleótidos canónicos y modificados, como pseudouridina (ψ) y 5-metilcitosina (m⁵C). Dado que todos los ARN contienen enlaces fosfodiéster, cualquier tipo de ARN puede ser hidrolizado con ácido para generar una escalera de secuencia ideal para 2D-HELS MS Seq en condiciones óptimas ^8,9. Sin embargo, la detección de todos los fragmentos de escalera de un ARN dado depende del instrumento. En una LC-MS estándar de alta resolución (40K), la cantidad mínima de carga para secuenciar una muestra de ARN corto purificada (<35 nt) es de 100 pmol por ejecución. Sin embargo, se requiere más material (hasta 400 pmol por muestra de ARN) cuando se deben realizar experimentos adicionales (por ejemplo, para distinguir modificaciones de bases isoméricas que comparten masas idénticas). El protocolo utilizado en la secuenciación del modelo de ARN sintético modificado también será aplicable a la secuenciación de muestras de ARN más amplias, incluidas las muestras de ARN biológico con modificaciones de bases desconocidas. Sin embargo, se requiere una cantidad de muestra aún mayor, como 1000 pmol para secuenciar el ARNt (~76 nt) utilizando un instrumento LC-MS estándar, para secuenciar el ARNt completo con todas las modificaciones, y se debe desarrollar un algoritmo avanzado para su secuenciación de novo ¹⁰.

Protocolo

1. Diseño de oligonucleótidos de ARN

1. Diseñar oligonucleótidos de ARN sintéticos con diferentes longitudes (19 nt, 20 nt y 21 nt), incluyendo uno (ARN #6) con nucleótidos canónicos y modificados. ψ se emplea como modelo para modificaciones que no alteran la masa, lo cual es un desafío para la secuenciación de MS porque tiene una masa idéntica a la de U. m⁵C se elige como modelo para las modificaciones que alteran la masa para demostrar la solidez del enfoque.
   
   ARN #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3'
   ARN #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3'
   ARN #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3'
   ARN #4: 5'-HO-GCGUACAUCUUCCCCUUUAU-OH-3'
   ARN #5: 5'-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3'
   ARN #6: 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm⁵CUGAG-OH-3'
    
2. Disuelva cada ARN sintético en agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) libre de nucleasas (expresada como_H2O tratada con DEPC, a menos que se indique lo contrario) para obtener una solución madre de ARN de 100 mM. Las soluciones madre se almacenan a largo plazo a -20 °C.
3. Para evitar la posible degradación de la muestra de ARN, utilice suministros experimentales sin ARNasa, como agua tratada con DEPC, tubos de microcentrífuga y puntas de pipeta. Limpie con frecuencia las superficies de los suministros de laboratorio con toallitas de eliminación de RNasa.

2. Etiquete el extremo 3' de los ARN con biotina

1. Protocolo de reacción en dos pasos (adenilación y ligadura)
   1. Agregue 1 μL de tampón de reacción de adenilación 10x que contiene 50 mM de acetato de sodio, pH 6.0, 10 mM MgCl₂, 5 mM de diclorodifeniltricloroetano (DTT), 0.1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1 μL de 1 mM de ATP, 1 μL de 100 μM de bisfosfato de citidina biotinilado (pCp-biotina), 1 μL de 50 μM Mth ARN ligasa y 6 μL de H₂O tratado con DEPC (un volumen total de 10 μL) en un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 mL libre de ARNasa.
      NOTA: Almacene los reactivos a -20 °C antes de la reacción en dos pasos. Descongele los reactivos a temperatura ambiente y mezcle bien mediante vórtice y centrifugado antes de agregarlos a la reacción.
   2. Incubar la reacción en una máquina de PCR a 65 °C durante 1 h e inactivar la reacción a 85 °C durante 5 min.
   3. Llevar a cabo la etapa de ligadura en un tubo de PCR de 0,2 mL de pared delgada libre de ARNasa que contenga 10 μL de solución de reacción del paso anterior añadiendo 3 μL de tampón de reacción de ARN ligasa T4 10x que contenga 50 mM de tris(hidroximetil)aminometano (Tris)-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1,5 μL del stock de muestra de 100 mM del ARN que se va a secuenciar. 3 μL de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) para alcanzar el 10% (v/v), 1 μL de ARN ligasa T4 (10 unidades/μL) y 11,5 μL de_H2O tratado con DEPC (para un volumen total de 30 mL). Incubar la reacción durante la noche a 16 °C en una máquina de PCR.
      NOTA: Combine los componentes de la reacción a temperatura ambiente debido al alto punto de congelación del DMSO (18,45 °C).
   4. Incubar la reacción durante la noche a 16 °C.
   5. Apague y purifique la reacción mediante la purificación en columna para eliminar las enzimas y liberar pCp-biotina utilizando Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.). El kit incluye tampón de unión de oligonucleótidos, tampón de lavado de ADN, columnas de centrifugación y tubos de recolección. Agregue 20 mL de H₂O tratado con DEPC a la solución de reacción para alcanzar un volumen de muestra de 50 mL antes de agregar el tampón de unión.
   6. Agregue 100 mL de tampón aglutinante a cada solución de reacción. Agregue 400 μL de etanol, mezcle por pipeteo y transfiera la mezcla a la columna. Centrífuga a 10.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.
   7. Añada 750 μL de tampón de lavado de ADN a la columna. Centrífuga a 10.000 x g y velocidad máxima durante 30 s y 1 minuto, respectivamente.
   8. Transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 15 μL de_H2Otratado con DEPC a la columna y centrifugar a 10.000 x g durante 30 s para eluir el producto de ARN.
      NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -20 °C en esta etapa hasta que se realice el siguiente paso.
2. Protocolo de reacción en un solo paso
   1. Realice una reacción de etiquetado en un solo paso combinando 2 μL de 150 μM de adenosina-5'-5'-difosfato-{5'-(citidina-2'-O-metil-3'-fosfato-TEG}C-biotina (AppCp-biotina), 3 μL de tampón de reacción de ligasa 10x, 1,5 μL del stock de muestra de 100 mM del ARN que se va a secuenciar, 3 μL de DMSO anhidro para alcanzar el 10% (v/v), 1 μL de ARN ligasa T4 (10 unidades/μL), y 19,5 μL de_H2Otratado con DEPC (para un volumen total de 30 mL) en un tubo de microcentrífuga libre de ARNasa de 1,5 mL.
   2. Incubar la reacción durante la noche a 16 °C en una máquina de PCR.
   3. Realice la purificación de la columna como se describe anteriormente en los pasos 2.1.5-2.1.8.
      NOTA: Prepare un tubo de reacción separado/exclusivo para cada muestra de ARN (escala de 150 pmol de ARN). Puede ser necesario marcar el extremo 5' del ARN con sulfo-cianina 3 (Cy3) o Cy3 (por ejemplo, para la verificación de la secuenciación bidireccional). El método es diferente al de la biotinilación 3' y se describe en una publicación anterior⁹.

3. Captura de una muestra de ARN biotinilado en perlas de estreptavidina

1. Active 200 μL de perlas magnéticas de estreptavidina C1 añadiendo 200 μL de 1x tampón B&W (5 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) en un tubo de microcentrífuga sin RNasa de 1,5 mL. Agite esta solución y colóquela en un soporte magnético durante 2 minutos. A continuación, deseche el sobrenadante pipeteando cuidadosamente la solución.
2. Lave las perlas dos veces con 200 μL de solución A (0,1 M de NaOH tratado con DEPC y 0,05 M de NaCl con DEPC) y una vez con 200 μL de solución B (0,1 M de NaCl con DEPC). Para cada paso de lavado, agite la solución en vórtice y colóquela en un soporte magnético durante 2 minutos, seguido de desechar el sobrenadante. A continuación, añada 100 μL de tampón 2x B&W (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM de EDTA, 2 M de NaCl).
3. Agregue 1x tampón en blanco y negro a la muestra de ARN biotinilado hasta que el volumen sea de 100 μL. A continuación, añada esta solución a las perlas lavadas almacenadas en 100 μL de tampón B&W 2x. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de plataforma oscilante a 100 rpm. Coloque el tubo en un soporte magnético durante 2 minutos y deseche el sobrenadante.
4. Lave las perlas recubiertas 3 veces en 1x tampón B&W y mida la concentración final de sobrenadante en cada paso de lavado con Nanodrop para el análisis de recuperación, para confirmar que las moléculas de ARN objetivo permanecen en las perlas.
5. Incubar las perlas en 10 mM de EDTA, pH 8,2 con formamida al 95% a 65 °C durante 5 min en una máquina de PCR. Mantenga el tubo en el soporte magnético durante 2 minutos y recoja el sobrenadante (que contiene los ARN biotinilados liberados por las perlas de estreptavidina) mediante una pipeta.
   NOTA: Este paso de separación física antes de la degradación del ácido solo se usa para la secuenciación del ARN # 1 en la Figura 1c, y no es obligatorio para el 2D-HELS MS Seq ya que la etiqueta de biotina hidrofóbica puede hacer que los fragmentos de escalera marcados con 3' tengan un t_R significativamente retrasado durante la medición de LC-MS, lo que puede distinguir claramente los fragmentos de escalera de 3' marcados de los fragmentos de escalera de 5' no marcados en el gráfico_R de masa-t 2D.

4. Hidrólisis ácida de ARN para generar escaleras de MS para la secuenciación

1. Divida cada muestra de ARN en tres alícuotas iguales. Por ejemplo, divida una muestra de ARN con un volumen de 15 μL de muestra de ARN en tres alícuotas de 5 μL.
2. Añadir un volumen igual de ácido fórmico para obtener un 50% (v/v) de ácido fórmico en la mezcla de reacción ^8,9.
3. Incubar la reacción a 40 °C en una máquina de PCR, con una reacción durante 2 minutos, otra durante 5 minutos y otra durante 15 minutos, respectivamente.
4. Enfríe la degradación del ácido congelando inmediatamente la muestra en hielo seco después de que finalice cada reacción.
5. Utilice un concentrador de vacío centrífugo para secar la muestra. Por lo general, la muestra se seca por completo en 30 minutos, y el ácido fórmico se elimina junto con el_H2Odurante el proceso de secado porque el ácido fórmico tiene un punto de ebullición (100,8 °C) similar al del_H2O(100 °C).
6. Suspender y combinar un total de tres muestras secas en 20 μL de H₂O tratado con DEPC para la medición de LC-MS.
   NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -20 °C en esta etapa mientras se espera la medición de LC-MS.

5. Convertir ψ a aducto CMC-ψ

1. Añadir 80 μL de H₂O tratado con DEPC en un tubo de microcentrífuga libre de RNasa de 1,5 mL que contenga 0,0141 g de N-ciclohexil-Nʹ-(2-morfolinoetil)-carbodiimida meto-p-toluenosulfonato (CMC) y 0,07 g de urea. Añadir 10 μL de los 100 μM de muestra del ARN a secuenciar, 8 μL de tampón bicina 1 M (pH 8,3) y 1,28 μL de EDTA 0,5 M. Agregue H₂O tratado con DEPC para alcanzar un volumen total de 160 μL. Las concentraciones finales son 0,17 M CMC, 7 M urea y 4 mM EDTA en bicina 50 mM (pH 8,3)¹¹.
   NOTA: Este protocolo es aplicable a una sola secuencia de ARN sintético o a mezclas de ARN.
2. Divida la solución de reacción de 160 μL en cuatro alícuotas iguales en tubos de PCR de 0,2 mL de pared delgada y sin RNasa e incube a 37 °C durante 20 min en una máquina de PCR.
   NOTA: 50 μL por tubo es el volumen máximo de reacción que se puede utilizar en una máquina de PCR.
3. Apague cada reacción con 10 μL de acetato de sodio 1,5 M y EDTA 0,5 mM (pH 5,6).
4. Realice la purificación de la columna con cuatro columnas de espín paralelas para eliminar el exceso de reactivos de acuerdo con el procedimiento descrito en los pasos 2.1.5-2.1.8. Disuelva el producto purificado en 15 μL de H₂O tratado con DEPC en cada tubo de microcentrífuga libre de ARNasa de 1,5 mL.
5. Transfiera el producto purificado a cuatro tubos de PCR de 0,2 mL de pared delgada y libres de RNasa. Añadir 20 μL de tampón 0,1 M de Na₂CO₃ (pH 10,4) en cada 15 μL de producto purificado y añadir H₂O tratado con DEPC para obtener un volumen final de 40 μL para cada tubo de reacción (en total cuatro tubos). Incubar la reacción a 37 °C durante 2 h en una máquina de PCR.
6. Apagar y purificar la reacción mediante la purificación en columna con cuatro columnas de espín paralelas como se describe en el paso 2.1.5. Eluir el producto convertido en CMC-ψ en un tubo de microcentrífuga libre de ARNasa de 1,5 mL, cada uno con 15 μL de H₂O tratado con DEPC.
7. Combine la muestra convertida CMC-ψ purificada de cuatro tubos de recolección en un solo tubo. Realice la degradación del ácido fórmico al 50% (v/v) de acuerdo con los procedimientos descritos en los pasos 4.1-4.6 para generar escaleras de MS para la secuenciación.

6. Medición LC-MS

1. Prepare las fases móviles para la medición de LC-MS. La fase móvil A es 25 mM de hexafluoro-2-propanol con 10 mM de diisopropilamina en agua de grado LC-MS; La fase móvil B es el metanol.
2. Transfiera la muestra al vial de muestra LC-MS para su análisis. El volumen de inyección de cada muestra es de 20 μL y contiene 100-400 pmol de ARN.
3. Utilice las siguientes condiciones de LC: temperatura de la columna de 35 °C, caudal de 0,3 mL/min; un gradiente lineal del 2 al 20 % de la fase B móvil durante 15 minutos, seguido de una etapa de lavado de 2 minutos con una fase B móvil del 90 %.
   NOTA: En el caso de las etiquetas finales más hidrofóbicas, como Cy3 y sulfo-Cy3, como se menciona en la Sección 2, puede ser necesario un mayor porcentaje de disolvente orgánico para la elución de la muestra (es decir, se puede utilizar un gradiente similar pero con un mayor rango porcentual de fase móvil B). Por ejemplo, 2-38% fase B móvil durante 30 min con un paso de lavado de 2 min con 90% fase B móvil.
4. Separe y analice muestras en un espectrómetro de masas Agilent Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) acoplado a un sistema LC equipado con un muestreador automático y un sistema MS HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento). La columna LC es una columna C18 de 50 mm x 2,1 mm con un tamaño de partícula de 1,7 μm. Utilice los siguientes ajustes de MS: modo de iones negativos; rango, de 350 m/z a 3200 m/z; velocidad de exploración, 2 espectros/s; caudal de gas de secado, 17 L/min; temperatura del gas de secado, 250 °C; presión del nebulizador, 30 psig; voltaje capilar, 3500 V; y voltaje del fragmentador, 365 V. Tenga en cuenta que estos parámetros son específicos del tipo o modelo de espectrómetro de masas que se utiliza.
5. Adquiera datos con el software de adquisición Agilent MassHunter. Utilice el flujo de trabajo de extracción de características moleculares (MFE) de Agilent para extraer información de compuestos, incluida la masa, el tiempo de retención, el volumen (la abundancia de MFE para las especies de iones respectivas) y la puntuación de calidad, etc. Utilice los siguientes ajustes de MFE: "formato de datos de centroide, moléculas pequeñas (cromatográficas), pico con altura ≥ 100, hasta un máximo de 1000, puntuación de calidad ≥ 50".
   NOTA: Optimice la configuración de MFE para extraer tantos compuestos potenciales como sea posible, hasta un máximo de 1000, con puntuaciones de calidad de ≥ 50.

7. Automatizar la generación de secuencias de ARN mediante un algoritmo computacional

NOTA: Este procedimiento se muestra solo para el ARN #1 en la Figura 1c.

1. Clasifique los compuestos extraídos con MFE en orden decreciente de volumen (intensidad máxima) y t_R. Realice la preselección de datos a través de 1) configurando t_R de 4 a 10 min para seleccionar los fragmentos de ARN marcados por la biotina, ya que los t_Rs de los componentes de la escalera de masa marcados con biotina se desplazan a esta ventana t_R (4 min a 10 min), y 2) utilizando un orden de magnitud mayor de compuestos de entrada que el número de fragmentos de escalera para que el cálculo del algoritmo reduzca la cantidad de datos en función del volumen. Por ejemplo, para un ARN de 20 nt, se requerirán 20 componentes de escalera_R de masa-t marcados para la secuenciación del ARN de 20 nt y, por lo tanto, se seleccionarán 200 compuestos del archivo de datos MFE en función del volumen. Tenga en cuenta que la ventana t_R puede ser diferente cuando se utiliza un tipo o modelo diferente de espectrómetro de masas.
2. Realizar el procesamiento de datos y la generación de secuencias de ARN #1 utilizando una versión revisada de un algoritmo publicado⁸. Los códigos fuente del algoritmo revisado se describen anteriormente (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)⁹.
3. Además de automatizar la generación de secuencias mediante el algoritmo, calcule manualmente las diferencias de masa entre dos componentes de escalera adyacentes para la llamada base. Todas las bases del ARN pueden llamarse manualmente y cotejarse con las teóricas de la base de datos de nucleótidos y modificaciones de ARN⁸; por lo tanto, la secuencia completa de la cadena de ARN se puede leer con precisión manualmente, lo que se utiliza para confirmar la precisión de la lectura de la secuencia informada por el algoritmo. Se pueden encontrar más estructuras de modificaciones de ARN en las bases de datos de modificaciones de ARN¹², y sus masas teóricas correspondientes se obtienen mediante ChemBioDraw. En las Tablas S1-S2, la diferencia de masa en ppm (partes por millón) se muestra al comparar la masa observada con su masa teórica para un componente específico de la escalera, y un valor inferior a 10 ppm se considera una buena coincidencia para cada llamada base.

8. Secuenciación de mezclas de ARN

1. Etiquete una mezcla de cinco cadenas de ARN (ARN #1 a #5) en sus extremos 3' con A(5')pp(5')Cp-TEG-biotina utilizando un protocolo de un solo paso descrito en el paso 2.2. En un volumen total de 150 μL de solución de reacción, agregue 15 μL de 10x tampón de reacción de ARN ligasa T4, 1,5 μL de cada hebra de ARN (100 μM de ARN #1 a #5, respectivamente, para un volumen total de 7,5 μL), 10 μL de 150 μM A(5')pp(5')Cp-TEG-biotina, 15 μL de DMSO anhidro, 5 μL de ARN ligasa T4 (10 unidades/μL) y 97,5 μL de H₂O tratado con DEPC. Distribuya uniformemente la solución de reacción en cinco alícuotas. Cada tubo de microcentrífuga libre de RNasa contiene 30 μL de solución de reacción.
2. Incubar la reacción durante la noche a 16 °C en una máquina de PCR.
3. Realice la purificación de la columna de acuerdo con el procedimiento descrito en los pasos 2.1.5-2.1.8 con cinco columnas de centrifugación paralelas. Eluir una muestra de mezcla de 5 hebras de ARN 3' biotiniladas (mezcla de ARN #1 a #5) en un tubo de microcentrífuga libre de ARNasa de 1,5 mL, cada uno con 15 μL de_H2O, tratado con DEPC.
4. Combine las muestras de mezcla purificada de los cinco tubos de recolección en un solo tubo. Realizar la degradación del ácido fórmico de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección 4.
5. Mida las muestras mediante LC-MS como se describe en la Sección 6 y analice los datos utilizando el software de análisis de datos con configuraciones MFE optimizadas para extraer datos que contengan masa, t_R y volumen como se describe en el paso 6.5. El algoritmo típico de procesamiento y llamada a bases no se aplica debido al aumento significativo de la complejidad de los datos resultante de la mezcla. Todas las bases en el ARN de la muestra mezclada se llaman manualmente en un método similar a la Sección 7.3 y coinciden bien con las teóricas en la base de datos de nucleótidos y modificaciones de ARN⁸, por lo que las secuencias completas de las cinco hebras de ARN en la muestra mezclada se leen con precisión. En las Tablas S7-S11, se enumera toda la información, incluida la masa observada, t_R, el volumen, la puntuación de calidad y la diferencia de masa en ppm.

Resultados

Introducción de una etiqueta de biotina en el extremo 3' del ARN para producir escaleras de masa-t_R fácilmente identificables. En la Figura 1a se muestra el flujo de trabajo del enfoque MS Seq 2D-HELS. La marca hidrofóbica de biotina introducida en el extremo 3' del ARN (ver Sección 2) aumenta las masas y t_Rs de los componentes de la escalera marcados con 3' en comparación con los de sus contrapartes no marcadas. P...

Discusión

A diferencia de la fragmentación de MS basada en tándem, la hidrólisis ácida altamente controlada se utiliza en el enfoque 2D-HELS MS Seq para fragmentar el ARN antes del análisis con un espectrómetro de masas ^9,10. Como resultado, el instrumento puede detectar cada fragmento degradado en ácido, formando el equivalente a una escalera de secuenciación. En condiciones óptimas, este método crea una escalera de secuencia "i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5' DNA Adenylation kit	New England Biolabs	E2610S	50uM concentration
6550 Q-TOF mass spectrometer	Agilent Technologies	5991-2116EN	Coupled to a 1290 Infinity LC system
A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotin-3´	ChemGenes	91718	HPLC purified
ATPγS	Sigma-Aldrich	11162306001	Lithium salt
Bicine	Sigma-Aldrich	B8660	BioXtra, ≥99% (titration)
Biotin maleimide	Vector Laboratories	SP-1501	Long arm
C18 column	Waters	186003532	50 mm × 2.1 mm Xbridge C18 column with a particle size of 1.7 μm
Centrifugal Vacuum Concentrator	Labconco	Refrig 115v/60hz 7310022	Labconco CentriVap
ChemBioDraw	PerkinElmer	ChemDraw Prime	Generate a chemical structure and property data of structures & fragments
CMC (N-cyclohexyl-N?-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)	Sigma-Aldrich	2491-17-0	95% Purifiy
Cyanine3 maleimide (Cy3)	Lumiprobe	11080	Water insoluble
DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906	Autoclaved, certified nuclease-free
Diisopropylamine (DIPA)	Thermo Fisher Scientific	108-18-9	99% Alfa Aesar
DMSO	Sigma-Aldrich	276855	Anhydrous dimethyl sulfoxide, 99.9%
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	Anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture
Formic acid	Merck	64-18-6	98-100%, ACS reag, Ph Eur
Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	920-66-1	99% Acros Organics
LC-MS sample vials	Thermo Fisher Scientific	C4000-11	Plastic screw thread vials
LC-MS vial caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-54A	Autosampler vial screw thread caps
Na2CO3 buffer	Sigma-Aldrich	88975	BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4060	Spin column
OriginLab	OriginLab	OriginPro	Data analysis and graphing software
pCp-biotin	TriLink BioTechnologies	NU-1706-BIO	20 ul (1 mM)
RNA #1--#6	Integrated DNA Technologies	Custom RNA oligos	19nt-21nt single-stranded RNAs, used without further purification
Rocking platform shaker	VWR	Orbital Shaker Standard 1000	Speed Range 40 to 300 rpm
Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88816	Binding approx. 55ug biotinylated rabbit lgG per mg of beads
Sulfonated Cyanine3 maleimide	Lumiprobe	11380	Water soluble
T4 DNA ligase 1	New England Biolabs	M0202S	400 units/uL
T4 polynucleotide kinase	Sigma-Aldrich	T4PNK-RO	From phage T4 am N81 pse T1 infected Escherichia coli BB
Tris-HCl buffer	Sigma-Aldrich	T6455	Tris-HCl Buffer, pH 10, 10×, Antigen Retriever
Urea	Sigma-Aldrich	81871	Urea for synthesis. CAS No. 57-13-6, EC Number 200-315-5.