Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

قمنا بتطوير طريقة للكشف عن Phytophthora capsici zoospores في مصادر المياه باستخدام طريقة استخراج الحمض النووي ورقة مرشح إلى جانب تضخيم متساوي الحراري حلقة بوساطة (مصباح) التي يمكن تحليلها في الميدان أو في المختبر.

Abstract

فيتفدورا capsici هو مسبب الأمراض oomycete المدمرة التي تؤثر على العديد من المحاصيل سولاناسيس و cucurbit الهامة مما تسبب خسائر اقتصادية كبيرة في إنتاج الخضروات سنويا. فيتفدورا capsici هو التربة التي تنقلها ومشكلة مستمرة في حقول الخضروات بسبب هياكلها البقاء على قيد الحياة طويلة (oospores وchlamydospores) التي تقاوم التجوية والتدهور. الطريقة الرئيسية للتشتت هي من خلال إنتاج جراثيم حدائق الحيوان ، وهي جراثيم ذات خلية واحدة ، ذات اسلافية يمكن أن تسبح من خلال أفلام رقيقة من الماء الموجود على الأسطح أو في مسام التربة المليئة بالماء ويمكن أن تتراكم في البرك والبرك. ولذلك، يمكن أن تكون أحواض الري مصدرا للأمراض والنقاط الأولية لتفشي الأمراض. الكشف عن P. capsici في مياه الري من الصعب استخدام الأساليب التقليدية القائمة على الثقافة لأن الكائنات الحية الدقيقة الأخرى الموجودة في البيئة، مثل Pythium spp.، وعادة ما تكون مفرطة P. capsici مما يجعلها غير قابلة للكشف. لتحديد وجود جراثيم P. capsici في مصادر المياه (مياه الري ، الجريان السطحي ، وما إلى ذلك) ، قمنا بتطوير ورقة تصفية يدوية تعتمد على المضخة (8-10 ميكرومتر) تلتقط جراثيم العامل الممرض (جراثيم حدائق الحيوان) وتستخدم لاحقًا لتضخيم الحمض النووي للممرض من خلال مكبرات ايزومترية (مصباح) جديدة بوساطة حلقة مصممة لتضخيم P. capsici محددة. يمكن لهذه الطريقة تضخيم وكشف الحمض النووي من تركيز منخفض يصل إلى 1.2 × 102 zoospores /mL ، وهو أكثر حساسية 40 مرة من PCR التقليدية. ولم يتم الحصول على أي تضخيم عبري عند اختبار الأنواع ذات الصلة الوثيقة. كما تم تنفيذ مصباح باستخدام صبغة المزيج الرئيسي مصباح colorimetric، وعرض النتائج التي يمكن قراءتها بالعين المجردة للكشف السريع في الموقع. ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع مسببات الأمراض الأخرى التي تقيم أو تتراكم أو تتوزع عبر شبكات الري الملوثة.

Introduction

أصبحت إعادة تدوير المياه في المزارع والحضانات شعبية متزايدة بسبب زيادة تكاليف المياه والمخاوف البيئية وراء استخدام المياه. وقد تم تطوير العديد من طرق الري للمزارعين للحد من انتشار وانتشار الأمراض النباتية. بغض النظر عن مصدر المياه (الري أو هطول الأمطار)، يتم توليد الجريان السطحي، والعديد من مزارعي الخضروات والحضانة لديها بركة لجمع وإعادة تدوير الجريانالسطحي 1. وهذا يخلق خزانا لتراكم مسببات الأمراض المحتملة لصالح انتشار مسببات الأمراض عند استخدام المياه المعاد تدويرها لري المحاصيل2,3,4. Oomycete النباتات المسببة للأمراض تستفيد بشكل خاص من هذه الممارسة كما سوف تتراكم جراثيم حدائق الحيوان في الماء وspore تشتت الأولية هو الذاتي motile ولكن يتطلب المياه السطحية5،6،7. Phytophthora capsici هو مسببات الأمراض oomycete التي تؤثر على عدد كبير من المحاصيل سولاناسيس و cucurbit بطرق مختلفة8. في كثير من الأحيان، والأعراض هي التخميد قبالة الشتلات، الجذر وتعفن التاج. ومع ذلك، في المحاصيل مثل الخيار، الاسكواش، البطيخ، اليقطين، البطيخ والباذنجان والفلفل، قد تضيع المحاصيل بأكملها بسبب تعفن الفاكهة9. على الرغم من أن هناك طرق معروفة للكشف عن هذا النبات الممرض، ومعظم تتطلب العدوى قد وقعت بالفعل الذي تأخر جدا بالنسبة لأي فطريات وقائية أن يكون لها تأثير كبير10.

الطريقة التقليدية لاختبار مياه الري للكشف عن وتشخيص الكائنات الدقيقة المستهدفة هو نهج عتيق عندما السرعة والحساسية حاسمة للنجاح وإنتاج المحاصيل مربحة11,12. النسيج النباتي المعرض لمسببات الأمراض المستهدفة (على سبيل المثال، الباذنجان لP. capsici)تعلق على فخ المعدلة التي يتم تعليقها في بركة الري لفترة طويلة قبل إزالتها وتفتيشها للعدوى. ثم يتم وضع عينات من الأنسجة النباتية على وسائط شبه انتقائية (PARPH) ومحتضنة لنمو الثقافة ، ثم يتم تنفيذ تحديد المورفولوجية باستخدام مجهر مركب13. هناك طرق أخرى مماثلة للكشف عن مسببات الأمراض النباتية الأخرى باستخدام وسائل الإعلام انتقائية والطلاء كميات صغيرة من المياه الملوثة قبل زراعة الفرعية14،15. هذه الأساليب تتطلب في أي مكان من 2 إلى 6 أسابيع، عدة جولات من الزرع الفرعي لعزل الكائن الحي، والخبرة في تشخيص Phytophthora لتكون قادرة على التعرف على الشخصيات المورفولوجية الرئيسية لكل نوع. هذه الطرق التقليدية لا تعمل بشكل جيد للكشف عن مياه الري الملوثة بp. capsici بسبب عوامل مثل التدخل من قبل الكائنات الحية الدقيقة الأخرى الموجودة أيضا في مصادر المياه. بعض الكائنات الحية الدقيقة سريعة النمو مثل Pythium SPP. والبكتيريا التي تنقلها المياه يمكن أن تتزايد على لوحة مما يجعل P. capsici غير قابل للكشف16,17.

وكان الغرض من هذه الدراسة هو تطوير طريقة جزيئية حساسة ومحددة يمكن استخدامها في كل من البيئات الميدانية والمختبرية للكشف عن جراثيم حدائق الحيوان P. capsici في مياه الري. ويتضمن البروتوكول تطوير رواية حلقة بوساطة التضخيم متساوي الحراري (مصباح) التمهيدي مجموعة قادرة على تضخيم على وجه التحديد P. capsici, استنادا إلى 1121 قاعدة زوج (bp) جزء من P. capsici18,19. تم استخدام التمهيدي مصباح وضعت سابقا من دونغ وآخرون (2015) بالمقارنة مع الفحص الذي تم تطويره لهذه الدراسة20.

إن مقايسة المصباح هي شكل جديد نسبيًا من أشكال الكشف الجزيئي الذي ثبت أنه أكثر سرعة وحساسية وتحديداً من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR)21. وبصفة عامة، لا يمكن لم مقايسات PCR التقليدية الكشف عن أقل من 500 نسخة (1.25 pg/μL)؛ في المقابل، وقد أظهرت الدراسات السابقة أن حساسية مصباح يمكن أن يكون 10 إلى 1000 مرة أعلى من PCR التقليدية ويمكن بسهولة الكشف عن 1 fg/μL من الحمض النوويالجينومي 22،23. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء الفحص بسرعة (غالباً في 30 دقيقة) وفي الموقع (في الحقل) باستخدام كتلة التدفئة المحمولة للتضخيم وصبغة colorimetric التي تغير لون لعينة إيجابية (إزالة الحاجة إلى الكهرباء). في هذه الدراسة، قارنا حساسية المقايسات PCR و LAMP باستخدام طريقة استخراج المرشح. طريقة الكشف المقترحة تسمح للباحثين وعوامل الإرشاد للكشف بسهولة عن وجود جراثيم P. capsici من مصادر المياه المختلفة في أقل من ساعتين. وقد ثبت أن الفحص أكثر حساسية من PCR التقليدية وتم التحقق من صحتها في الموقع عن طريق الكشف عن وجود العامل الممرض في مياه الري المستخدمة من قبل المزارع. وستتيح طريقة الكشف هذه للمزارعين تقدير وجود العامل الممرض وكثافته السكانية في مختلف مصادر المياه المستخدمة في الري، مما يمنع حدوث فاشيات مدمرة وخسائر اقتصادية.

Protocol

1- الكشف في الموقع عن فيتفدورا capsici من مياه الري باستخدام التضخيم الأيزوحرارية المحمول بوساطة حلقة

  1. إعداد المضخة والتصفية
    1. إرفاق قارورة تصفية إلى أنبوب متصل بمضخة يدوية بحيث عندما يتم تنشيط المضخة، سيتم سحب الهواء من خلال فم قارورة التصفية.
    2. تناسب قمع Buchner في سدادة المطاط إلى فم قارورة الترشيح وتناسب قطعة الحجم المناسب من ورقة التصفية في قمع Buchner بحيث يتم سحب الهواء من خلال ورقة التصفية. يجب أن يكون حجم ورقة التصفية 15 ميكرومتر.
      ملاحظة: يجب أن يتناسب ورق التصفية مع حواف مسار القمع Buchner بحيث تتدفق المياه الدنيا حول ورق التصفية.
  2. أخذ عينات المياه وتصفية
    1. أخذ عينات المياه من المصدر المستهدف. وقد تكون المياه تحتوي على كميات صغيرة من الحطام ولكنها لا تحتوي على رواسب أو تربة كبيرة.
    2. صب ما يصل إلى 1000 مل (1 لتر) من الماء اختبار على ورقة مرشح وضعت داخل قمع Buchner ببطء بما فيه الكفاية لمنع تجاوز، في حين يتم استخدام مضخة اليد (أو فراغ) لخلق شفط لسحب المياه من خلال.
      ملاحظة: لا يوجد حد أدنى لمقدار المياه التي يمكن اختبارها باستخدام هذه الطريقة، وعلى الرغم من أنه يقترح ما لا يقل عن 50 مل، 1000 مل هو الحد الأقصى لهذه الطريقة.
    3. باستخدام ملقط، وإزالة ورقة تصفية من قمع Buchner وقطع إلى قطع صغيرة مع مقص معقمة. إضافة العديد من القطع (8-12) كما يمكن أن تكون مغمورة في كمية من التخزين المؤقت (400 ميكرولتر لاستخراج المغناطيسي القائم على الخرز) المطلوبة من قبل البروتوكول إلى أنبوب 1.5 مل. حفظ القطع المتبقية من ورقة التصفية للمعالجة بعد أن تم استخراج المجموعة الأولى.
    4. دوامة أو خلاف ذلك تهيج قطعة من ورقة تصفية واستخراج العازلة لمدة 10 ق كل دقيقة لمدة 5 دقائق. ثم، باستخدام ملقط، وإزالة ورقة مرشح فقدان أقل قدر ممكن من المخزن المؤقت الاستخراج. كرر هذه الخطوة مع القطع المتبقية من ورقة التصفية حتى تم دوامة جميع القطع / هياج وغارقة في المخزن المؤقت الاستخراج.
  3. المغناطيسي على أساس الخرز استخراج الحمض النووي من ورقة مرشح
    1. إلى أنبوب 1.5 مل (الذي يحتوي الآن على ما يقرب من 200-300 ميكرولتر من العازلة استخراج)، إضافة 20 ميكرولتر من البروتينات K و 10 ميكرولتر من 10 نانوغرام/ميكرولتر RNase.
    2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، دوامة أو يهز أنبوب كل 3 دقائق.
    3. إضافة 500 μL من الخرز المغناطيسي مع العازلة ملزمة للعينة ومزيج جيد عن طريق هز. ثم احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. ضع الأنبوب في رف الفاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة حتى يتم سحب جميع الخرز إلى المغناطيس. إزالة وتجاهل ناظر.
    5. إزالة أنبوب من الفاصل المغناطيسي. إضافة 500 μL من غسل العازلة 1 وإعادة تعليق الخرز عن طريق هز أنبوب بقوة. انتظر 30 s ثم ضع الأنبوب مرة أخرى في الفاصل المغناطيسي. انتظر لمدة 2 دقيقة حتى تم سحب جميع الخرز نحو المغناطيس قبل إزالة وتجاهل supernatant.
      ملاحظة: عند انتظار الخرز المغناطيسي لمغنطيسة إلى الفاصل، نوصي عكس الأنبوب، والتي يمكن أن تطرد الخرز المغناطيسي عالقة إلى الغطاء والجانبين من الأنبوب ويؤدي إلى عدد أكبر من الخرز التي تعلق.
    6. كرر الخطوة 1.3.5 مع 500 ميكرولتر من الغسيل العازل 2.
    7. كرر الخطوة 1.3.5 مع 500 ميكرولتر من 80٪ الإيثانول.
    8. Airdry بيليه حبة المغناطيسي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (18-27 درجة مئوية) مع غطاء مفتوح. إذا لم تسمح درجات الحرارة، احتضان في يد قفاز مع الغطاء مفتوحة لمدة 15 دقيقة.
    9. إزالة أنبوب من الفاصل المغناطيسي. إضافة 50 μL من عازلة elution وإعادة تعليق الخرز عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا لمدة 1 دقيقة.
    10. ضع أنبوب مرة أخرى في فاصل مغناطيسي. انتظر 2 دقيقة قبل نقل المناط دون إزعاج الخرز إلى أنبوب منفصل لتخزين الحمض النووي.
      ملاحظة: هنا يمكن إيقاف التجربة مؤقتاً قبل الانتقال. يجب تخزين الحمض النووي المستخرج على الثلج أو في ثلاجة -20 درجة مئوية.
  4. تطبيق مقايسة مصباح المطورة حديثا
    1. إعداد مصباح التمهيدي المزيج باستخدام 0.2 μM من كل التمهيدي F3 و B3، 0.8 μM من كل حلقة-F و Loop-B التمهيدي، و 1.6 μM من كل FIP و BIP التمهيدي(الجدول 2).
    2. إضافة حل مصباح التالية إلى أنبوب PCR واحد، أو إلى كل أنبوب الفردية في قطاع أنبوب 8: 2.5 μL من مزيج التمهيدي (الخطوة 1.4.1)، 12.5 μL من المزيج الرئيسي مصباح LAVA، 1 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج، و 9 ميكرولتر من ddH2O. الحجم الإجمالي هو 25 ميكرولتر.
      ملاحظة: إذا كان استخدام أداة التضخيم المحمولة (على سبيل المثال، الجني الثالث) مع صبغة قياس الألوان (على سبيل المثال، Warmstart)، راجع القسم 2.4.2-2.4.3.
    3. تعيين أنبوبين كضوابط إيجابية وسلبية. للتحكم الإيجابي، استخدم إما عنصر تحكم يوفره مجموعة LAVA LAMP، أو عينة حمض نووي إيجابية معروفة. للتحكم السلبي، استخدم ddH2O. لكليهما، استبدل 1 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج بـ 1 ميكرولتر من التحكم الإيجابي أو ddH2O.
    4. تعيين العينات في كتلة الحرارة (أو أداة تضخيم المحمولة) تعيين إلى 64 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن استخدام طرق الاستخراج الأخرى هنا بدلاً من استخراج الخرز المغناطيسي القائم. تم اختبار كل من CTAB ومجموعة استخراج الحمض النووي التجارية بنجاح باستخدام البروتوكولات القياسية واستبدال القطع الورقية المرشح لعينة النبات24،25. وقد قورنت النتائج في الجدول 2. إذا كان من الممكن تحديد كمية تركيز الحمض النووي، استخدم ما بين 1-10 نانوغرام الحمض النووي الجينومي.
  5. التصور النتائج
    1. إذا أجريت في إعداد المختبر، عرض منتجات التضخيم عن طريق تحميل 5 ميكرولتر من كل عينة في هلام agarose 1٪، وتشغيلها في آلة جل الكهرباء، وتصويرها في آلة التصوير بالأشعة فوق البنفسجية.
    2. إذا تم استخدام صبغة ملونة (على سبيل المثال، Warmstart) ، عرض تغيير اللون لتحديد النتائج على أنها إيجابية أو سلبية.
    3. إذا تم استخدام أداة تضخيم محمولة (مثل الجني الثالث)، اعرض الرسم البياني للتضخيم على الشاشة لتحديد النتائج.
  6. تطبيق فحص PCR التي تم تطويرها سابقًا
    ملاحظة: إذا كان استخدام إجراء PCR الاصطلاحي، تبقى الخطوات 1-3 كما يجب تطبيق الخطوات التالية بدلاً من الخطوتين 1.4 و 1.5.
    1. إضافة 1 ميكرولتر من كل استخراج الحمض النووي إلى أنابيب الفردية التي تحتوي على المكونات التالية: 12.5 μL من الأخضر PCR مزيج الماجستير، 9.5 μL من ddH2O، و 1 ميكرولتر من التمهيديات إلى الأمام وعكس(الجدول 2).
    2. تدور أسفل كل عينة باستخدام microcentrifuge ووضع أنابيب في دورة حرارية.
    3. استخدم إعدادات الدورة الحرارية التالية وفقًا للمنشورات السابقة: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 30 دورة من الdenaturation عند 94 درجة مئوية لـ 30 s ، الحنع عند 54 درجة مئوية لمدة 30 s ، تمديد 72 درجة مئوية لمدة دقيقة ، وتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. تشغيل المنتج في هلام agarose 1٪ . مراقبة وجود العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية حيث ردود الفعل الإيجابية سيكون حجم الفرقة من ~ 508 bp.
  7. الطريقة التقليدية للكشف
    ملاحظة: هناك طرق متعددة من الطلاء الانتقائي للكشف عن مسببات الأمراض، وفيما يلي هو بروتوكول عام لp. capsici.
    1. أولا، الحصول على فاكهة الباذنجان صحية (مضيف عرضة لP. capsici)وتعقيم السطح عن طريق غسل سطح الفاكهة مع 70٪ من الكحول isopropyl.
    2. ضع فاكهة الباذنجان في صناديق الحليب مع جهاز تعويم (رغوة البولي إيثيلين أو غيرها) والانتشار في برك الري. تأمين كل فخ الطعم إلى نقطة واحدة وترك الفخاخ في خزان المياه (مياه الري المعاد تدويرها) لمدة 7 أيام على الأقل أو حتى يتم ملاحظة أعراض تعفن الفاكهة. جمع الفاكهة ونقلها إلى المختبر.
    3. شطف وتجفيف الفاكهة في غطاء معقمة قبل إزالة قطع صغيرة من الأنسجة المصابة ووضعها على لوحة من PARPH المتوسطة المعدلة مع 25 ملغ / لتر خماسي كلورونياترو البنزين، 0.0005٪ بيماريسين، 250 ملغم / لتر أمبريسلين، 10 ملغ / Lrifampicin و 50 ملغ / L hymexazol. احتضنت لوحات في 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
    4. عرض لوحات تحت المجهر المركب لتحديد المورفولوجية التقليدية في 4 أيام بعد العزل.

2. تحديد الحد الكشف عن تركيز zoospore

  1. جعل تعليق zoospore
    1. احتضان P. capsici على V8 أجار (100 مل من عصير V8، 900 مل من ddH2O، 1 غرام من كاكو3)لوحات لمدة 1 أسبوع في 26 درجة مئوية. يمكن استخدام لوحات متعددة للحصول على كمية أكبر من تعليق zoospore.
    2. احتضان لوحات تحت ضوء مستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 أيام لتحفيز sporulation.
    3. الفيضانات لوحات بإضافة 15 مل من ddH2O إلى كل لوحة ووضعها في ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. ثم العودة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. لوحات تهيج لإزاحة حدائق الحيوان و الجراثيم والميصة الحل في أنبوب واحد 50 مل من جميع لوحات.
    5. للحصول على تقدير دقيق لتركيز zoospore، إضافة 10 ميكرولتر من تعليق البوغ على قياس الهيموسيتة ومراقبة تحت المجهر لحساب جراثيم حدائق الحيوان وتقدير متوسط التركيز.
  2. تخفيف المسلسل
    1. إضافة 1 مل من تعليق بوغ و 9 مل من ddH2O إلى أنبوب منفصل. كرر هذه الخطوة للعديد من التخفيفات 10 أضعاف حسب الرغبة.
    2. ثم يتم تقديم حلول البوغ لاستخراج الحمض النووي على أساس البروتوكول السابق باستخدام طريقة الترشيح.
      ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى حجم أكبر من التعليق، مضاعفة حجم: 2 مل من تعليق بوغ و 18 مل من ddH2O.
  3. الكشف عن الحد الأقصى لتركيزات زوزسبور
    1. تقييم حد الكشف عن بوغ عن طريق تشغيل كل تخفيف المسلسل بشكل فردي من خلال الفحص حتى نتائج إيجابية واضحة لم تعد تلاحظ. بمجرد الحصول على التخفيف النهائي ، يتم تخفيفه بعامل 2 (4.8 إلى 2.4 في هذا المثال) وتشغيل الفحص مرة أخرى للحصول على حد كشف أكثر دقة.
  4. تطوير وتحسين أسلوب LAMP
    ملاحظة: تم تصميم الأحرف التمهيدية مصباح على أساس 1121 قاعدة زوج (bp) جزء من P. capsici (لي وآخرون19)كما هو مبين في الشكل التكميلي 2.
    1. إذا تم استخدام صبغة قياس الألوان (على سبيل المثال، والدفء) ، استخدم الحل التالي: 2.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي ، 12.5 ميكرولتر من الصبغة الملونة ، 0.5 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت الخضراء ، 1 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج ، و 8.5 ميكرولتر من ddH2O. الحجم الإجمالي هو 25 ميكرولتر.
    2. عند استخدام أداة التضخيم المحمولة مع ماجمس LAVALAMP، يكون خطوة أولية من 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة، ولكن هذا غير مطلوب. لا يلزم وجود خطوة التلاهم النهائية لمراقبة تغير اللون أو رسم التضخيم. لا تقم بتشغيل خطوة warmstart إذا كان صبغة colorimetric التجارية لاستخدامها.
    3. عرض نتائج اختبار مصباح في واحدة من الطرق التالية: تشغيل عينات على هلام agarose 1٪ أو عرض باستخدام آلة التصوير بالأشعة فوق البنفسجية مع العين المجردة أو عرض في الجني الثالث في الوقت الحقيقي شاشة التضخيم.
    4. تحسين درجة حرارة اختبار المصباح باستخدام أداة التضخيم المحمولة وتحليلها باستخدام الرسم البياني للتضخيم في الوقت الحقيقي للسرعة ومستوى الحساسية. تشغيل العينات مع درجات حرارة فريدة من نوعها لتحديد أسرع تضخيم مع أعلى مستوى من الحساسية.
    5. تحديد حد الكشف عن اختبار المصباح المتقدمة من خلال جعل تخفيف المسلسل من الحمض النووي المستخرج (كما هو الحال مع تعليق بوغ في الخطوة 2.2.1) والحفاظ على حالات رد الفعل كما وصف سابقا لتفاعل مصباح لكل تخفيف.
  5. تحديد حد الكشف ومقارنتها بطريقة PCR التقليدية
    1. استخدم الحمض النووي المستخرج في الخطوات الواردة في القسم 1.3 لمقارنة مستوى الكشف عن PCR التقليدية مع ذلك من اختبار مصباح.
    2. إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي إلى أنبوب PCR التي تحتوي على 1 ميكرولتر من كل من التمهيديات PCR الأمامية والالعكسية(الجدول 2)،12.5 μL من ماسترميكس PCR الأخضر، و 9.5 ميكرولتر من ddH2O لمجموع 25 ميكرولتر.
    3. تضخيم العينات في دورة حرارية باستخدام الظروف التالية: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 30 دورة من الdenaturation في 94 °C ل 30 s، الحنيع عند 54 درجة مئوية لمدة 30 s، تمديد عند 72 °C لمدة 1 دقيقة، و تمديد النهائي عند 72 °C لمدة 10 دقائق.
    4. تشغيل العينات في آلة الكهرباء على هلام agarose 1٪ وعرض على آلة التصوير بالأشعة فوق البنفسجية. وكان حجم الفرقة المستثناة 508 bp.

النتائج

تحسين أسلوب المصباح
في هذه الدراسة، اكتشفنا وجود فيتفتورا capsici في مياه الري باستخدام التضخيم الأيزوحرارية المحمولة التي تتوسطها حلقة (مصباح) المقايسة. أولاً، تم تحسين مقايسة المصباح المقترحة من خلال اختبار تركيزات مختلفة من التمهيديات للمصباح [F3، B3 (0.1-0.5 ميكرومتر لكل منهم?...

Discussion

اختبار مياه الري لل phytopathogens هو خطوة حاسمة للمزارعين باستخدام أحواض الري والمياه المعاد تدويرها27. توفر أحواض الري خزاناً وأرضاً خصبة لعدد من الباتات النباتية حيث يتم توجيه مياه الري الزائدة من الحقل إلى البركة التي تحمل معها أي مسببات الأمراض التي قد تكون موجودة16

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه أو أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد تلقى هذا العمل الدعم المالي من لجنة جورجيا للسلع للخضروات المشروع ID # FP00016659. يشكر المؤلفون الدكتور بينغشينغ جي، جامعة جورجيا والدكتورة آن دورانس، جامعة ولاية أوهايو لتقديمها ثقافات نقية من فيتوفاهورا SPP. كما نشكر لي وانغ وديلوريس فيني على مساعدتهما التقنية طوال فترة الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose gel powderThomas ScientificC997J85
Buchner funnelSouthern LabwareJBF003
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Centrifuge 5430Eppendorf22620509
ChloroformFischer ScientificC298-500
CTAB solutionBiosciences786-565
Dneasy Extraction KitQiagen69104
Filter FlaskUnitedFHFL1000
Filter PaperUnited Scientific SuppliesFPR009
Gel Green 10000XThomas ScientificB003B68 (1/EA)
Genie IIIOptiGene
Hand pumpThomas Scientific1163B06
Iso-amyl AlcoholFischer ScientificBP1150-500
LAVA LAMP master mixLucigen30086-1
Magnetic bead DNA extractionGenesiggenesigEASY-EK
Magnetic SeparatorGenesiggenesigEASY-MR
polyvinylpyrrolidoneSigma AldrichPVP40-500G
PrimersSigma Aldrich
Prism Mini CentrifugeLabnetC1801
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
UV Gel DocAnalytik Jena849-00502-2
Warmstart Colorimetric DyeLucigenE1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT CellBio-Rad1704489EDU
70% isopropanolFischer ScientificA451-1

References

  1. Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
  2. Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
  3. Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
  4. Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
  5. Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
  6. Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
  7. Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
  8. Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
  9. Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
  10. Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
  11. Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
  12. Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
  13. Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
  14. Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
  15. Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
  16. Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
  17. Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
  18. Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
  19. Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
  20. Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
  21. Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
  22. Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
  23. Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
  24. Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
  25. Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
  26. Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
  27. Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
  28. Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
  29. Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
  30. Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 160 Phytophthora capsici Zoospore

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved