Détection de Phytophthora capsici dans l’eau d’irrigation à l’aide de l’amplification isothermique en loop-Mediated

Résumé

Nous avons développé une méthode pour détecter phytophthora capsici zoospores dans les sources d’eau à l’aide d’une méthode d’extraction d’ADN de papier filtre couplée à un test d’amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle qui peut être analysé sur le terrain ou en laboratoire.

Résumé

Phytophthora capsici est un pathogène dévastateur de l’oomycéte qui affecte de nombreuses importantes cultures de solanacée et de cucurbitacées causant des pertes économiques importantes dans la production végétale chaque année. Phytophthora capsici est transmis par le sol et un problème persistant dans les champs de légumes en raison de ses structures de survie à longue durée de vie (oospores et chlamydospores) qui résistent aux intempéries et à la dégradation. La principale méthode de dispersion consiste à produire des zoospores, qui sont des spores à unicellulaire et flagellées qui peuvent nager à travers de minces couches d’eau présentes sur les surfaces ou dans des pores de sol remplis d’eau et qui peuvent s’accumuler dans des flaques d’eau et des étangs. Par conséquent, les étangs d’irrigation peuvent être une source de l’agent pathogène et les premiers points d’éclosion de la maladie. La détection de P. capsici dans l’eau d’irrigation est difficile en utilisant des méthodes traditionnelles basées sur la culture parce que d’autres micro-organismes présents dans l’environnement, tels que Pythium spp., généralement surgrow P. capsici le rendant indétectable. Pour déterminer la présence de spores de P. capsici dans les sources d’eau (eau d’irrigation, ruissellement, etc.), nous avons mis au point une méthode de papier filtre à pompe manuelle (8-10 μm) qui capture les spores de P. capsici. l’agent pathogène (zoospores) et est plus tard utilisée pour amplifier l’ADN de l’agent pathogène par le biais d’une nouvelle amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle. Cette méthode peut amplifier et détecter l’ADN d’une concentration aussi faible que 1,2 x 10² zoospores/mL, qui est 40 fois plus sensible que le PCR conventionnel. Aucune amplification croisée n’a été obtenue lors de l’essai d’espèces étroitement apparentées. LAMP a également été réalisé à l’aide d’un colorant de mélange de maître de lampe colorimétrique, affichant des résultats qui pourraient être lus à l’œil nu pour la détection rapide sur place. Ce protocole pourrait être adapté à d’autres agents pathogènes qui résident, s’accumulent ou sont dispersés par des systèmes d’irrigation contaminés.

Introduction

Le recyclage de l’eau dans les fermes et les pépinières est de plus en plus populaire en raison de l’augmentation des coûts de l’eau et des préoccupations environnementales liées à l’utilisation de l’eau. De nombreuses méthodes d’irrigation ont été mises au point pour permettre aux producteurs de réduire la propagation et l’apparition des maladies végétales. Indépendamment de la source de l’eau (irrigation ou précipitations), le ruissellement est généré, et de nombreux producteurs de légumes et de pépinières ont un étang pour recueillir et recycler le ruissellement¹. Cela crée un réservoir pour l’accumulation possible de pathogènes favorisant la propagation des agents pathogènes lorsque l’eau recyclée est utilisée pour irriguer les cultures^2,3,4. Les agents pathogènes des plantes d’Oomycète bénéficient particulièrement de cette pratique car les zoospores s’accumuleront dans l’eau et la spore dispersive primaire est auto-motile mais nécessite l’eau de surface^5,6,7. Phytophthora capsici est un pathogène oomycéte qui affecte un nombre important de cultures solanacées et cucurbitées de différentes façons⁸. Souvent, les symptômes sont l’amortissement des semis, de la racine et de la pourriture de la couronne; toutefois, dans les cultures telles que le concombre, la courge, le melon, la citrouille, la pastèque, l’aubergine et le poivre, des récoltes entières peuvent être perdues en raison de la pourriture des fruits⁹. Bien qu’il existe des méthodes connues de détection de ce pathogène végétal, la plupart exigent qu’une infection ait déjà eu lieu, ce qui est trop tard pour que les fongicides préventifs aient un effet significatif¹⁰.

La méthode traditionnelle pour tester l’eau d’irrigation pour la détection et le diagnostic de micro-organismes ciblés est une approche désuète lorsque la vitesse et la sensibilité sont cruciales pour le succès et la production agricole rentable^11,12. Les tissus végétaux sensibles à l’agent pathogène ciblé (p. ex., l’aubergine pour P. capsici)sont attachés à un piège modifié qui est suspendu dans un étang d’irrigation pendant une période prolongée avant d’être enlevé et inspecté pour détecter l’infection. Les échantillons prélevés sur le tissu végétal sont ensuite plaqués sur des milieux semi-sélectifs (PARPH) et incubés pour la croissance de la culture, puis l’identification morphologique est effectuée à l’aide d’un microscope composé¹³. Il existe d’autres méthodes de détection similaires pour d’autres agents pathogènes végétaux utilisant des milieux sélectifs et en plaisantant de petites quantités d’eau contaminée avant de sous-cultiver^14,15. Ces méthodes nécessitent entre 2 et 6 semaines, plusieurs cycles de sous-culture pour isoler l’organisme, et l’expérience sur les diagnostics phytophthora pour être en mesure de reconnaître les caractères morphologiques clés de chaque espèce. Ces méthodes traditionnelles ne fonctionnent pas bien pour la détection de l’eau d’irrigation contaminée par P. capsici en raison de facteurs tels que l’interférence par d’autres micro-organismes qui sont également présents dans les sources d’eau. Certains micro-organismes à croissance rapide comme Pythium spp. et les bactéries d’origine hydrique peuvent surgrow sur la plaque rendant P. capsici indétectable^16,17.

Le but de cette étude était de développer une méthode moléculaire sensible et spécifique qui peut être utilisée à la fois dans les milieux de terrain et de laboratoire pour détecter les zoospores P. capsici dans l’eau d’irrigation. Le protocole comprend le développement d’un nouvel ensemble d’amorces isothermiques médiés en boucle (LAMP) capable d’amplifier spécifiquement P. capsici, basé sur un fragment de 1121 paires de base (pb) de P. capsici^18,19. Une amorce LAMP précédemment développée de Dong et coll. (2015) a été utilisée par rapport à l’essai qui a été développé pour cette étude²⁰.

L’essai LAMP est une forme relativement nouvelle de détection moléculaire qui s’est avérée plus rapide, plus sensible et plus spécifique que la réaction en chaîne conventionnelle de polymérase (PCR)²¹. En général, les tests PCR conventionnels ne peuvent pas détecter à moins de 500 copies (1,25 pg/μL); en revanche, des études antérieures ont montré que la sensibilité de LAMP peut être 10 à 1000 fois plus élevée que le PCR conventionnel et peut facilement détecter même 1 fg/μL d’ADN génomique^22,23. En outre, l’essai peut être effectué rapidement (souvent en 30 min) et sur place (sur le terrain) en utilisant un bloc de chauffage portable pour l’amplification et un colorant colorimétrique qui change de couleur pour un échantillon positif (en supprimant le besoin d’électrophorèse). Dans cette étude, nous avons comparé la sensibilité des tests PCR et LAMP à l’aide d’une méthode d’extraction de filtre. La méthode de détection proposée permet aux chercheurs et aux agents d’extension de détecter facilement la présence de spores de P. capsici provenant de différentes sources d’eau en moins de deux heures. L’essai s’est avéré plus sensible que le PCR conventionnel et a été validé in situ en détectant la présence de l’agent pathogène dans l’eau d’irrigation utilisée par un producteur. Cette méthode de détection permettra aux producteurs d’estimer la présence et la densité de population de l’agent pathogène dans diverses sources d’eau qui sont utilisées pour l’irrigation, prévenir les flambées dévastatrices et les pertes économiques.

Protocole

1. Détection sur place de Phytophthora capsici à partir de l’eau d’irrigation à l’aide d’une amplification isothermique à médiation en boucle

1. Configuration de la pompe et du filtre
   1. Attachez une fiole filtrante à un tube qui est relié à une pompe à main de sorte que lorsque la pompe est activée, l’air sera tiré par la bouche de la fiole filtrante.
   2. Placez l’entonnoir Buchner dans le bouchon en caoutchouc à la bouche de la fiole filtrante et placez le morceau de papier filtre de taille appropriée dans l’entonnoir Buchner afin que l’air soit tiré à travers le papier filtre. Le papier filtre doit avoir une taille de rétention de 15 μm.
      REMARQUE : Le papier filtre doit s’adapter aux bords de l’entonnoir Buchner afin qu’un minimum d’eau circule autour du papier filtre.
2. Échantillonnage et filtrage de l’eau
   1. Prenez des échantillons d’eau de la source ciblée. L’eau peut avoir de petites quantités de débris, mais pas des sédiments ou du sol importants.
   2. Verser jusqu’à 1 000 mL (1 litre) d’eau d’essai sur le papier filtre placé à l’intérieur de l’entonnoir Buchner assez lentement pour éviter le débordement, tandis que la pompe à main (ou vide) est utilisée pour créer une aspiration pour tirer l’eau à travers.
      REMARQUE : Il n’y a pas de quantité minimale d’eau qui puisse être testée à l’aide de cette méthode, et bien qu’elle soit suggérée au moins 50 mL, 1000 mL est le maximum pour cette méthode.
   3. À l’aide de forceps, retirer le papier filtre de l’entonnoir Buchner et le couper en petits morceaux avec des ciseaux stériles. Ajouter autant de morceaux (8-12) que possible dans la quantité de tampon d’extraction (400 μL pour l’extraction à base de perles magnétiques) requise par le protocole dans un tube de 1,5 mL. Enregistrez les morceaux restants de papier filtre pour le traitement après l’extraction du premier ensemble.
   4. Vortex ou autrement agiter les morceaux de papier filtre et tampon d’extraction pendant 10 s chaque minute pendant 5 min. Ensuite, à l’aide de forceps, retirez le papier filtre qui perd le moins possible de la mémoire tampon d’extraction. Répétez cette étape avec les morceaux restants de papier filtre jusqu’à ce que toutes les pièces aient été vortexées/agitées et trempées dans le tampon d’extraction.
3. Extraction magnétique d’ADN à base de perles à partir de papier filtre
   1. Pour le tube de 1,5 mL (qui contient maintenant environ 200-300 μL de tampon d’extraction), ajouter 20 μL de protéinase K et 10 μL de 10 ng/μL RNase.
   2. Incuber à température ambiante pendant 15 min, vortex ou secouer le tube toutes les 3 minutes.
   3. Ajouter 500 μL de perles magnétiques avec le tampon de liaison à l’échantillon et bien mélanger en secouant. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
   4. Placez le tube dans la grille du séparateur magnétique pendant 2 min jusqu’à ce que toutes les perles aient été tirées vers l’aimant. Retirer et jeter le supernatant.
   5. Retirez le tube du séparateur magnétique. Ajouter 500 μL de tampon de lavage 1 et re-suspendre les perles en secouant vigoureusement le tube. Attendez 30 s, puis placez le tube dans le séparateur magnétique. Attendez 2 min jusqu’à ce que toutes les perles aient été tirées vers l’aimant avant d’enlever et de jeter le supernatant.
      REMARQUE : Lorsque vous attendez que les perles magnétiques magnétisent au séparateur, nous vous recommandons d’inverser le tube, qui peut déloger les perles magnétiques collées au bouchon et aux côtés du tube et entraîner un plus grand nombre de perles attachées.
   6. Répétez l’étape 1.3.5 avec 500 μL de tampon de lavage 2.
   7. Répétez l’étape 1.3.5 avec 500 μL d’éthanol à 80%.
   8. Aérérechez le granulé de perle magnétique pendant 15 min à température ambiante (18-27 °C) avec le couvercle ouvert. Si les températures ne le permettent pas, incuber dans une main gantée avec le bouchon ouvert pendant 15 min.
   9. Retirez le tube du séparateur magnétique. Ajouter 50 μL de tampon d’élution et re-suspendre les perles en faisant des pipes de haut en bas pendant 1 min.
   10. Remettre le tube dans un séparateur magnétique. Attendez 2 min avant de transférer le supernatant sans déranger les perles dans un tube séparé pour le stockage de l’ADN.
       REMARQUE : Ici, l’expérience peut être interrompue avant de passer à autre chose. L’ADN extrait doit être stocké sur de la glace ou dans un congélateur de -20 °C.
4. Application de l’essai LAMP nouvellement développé
   1. Préparer le mélange d’amorces LAMP à l’aide de 0,2 μM de chaque amorce F3 et B3, de 0,8 μM de chaque amorce Loop-F et Loop-B et de 1,6 μM de chaque amorce FIP et BIP (tableau 2).
   2. Ajoutez la solution LAMP suivante à un seul tube PCR ou à chaque tube individuel de la bande de 8 tubes : 2,5 μL de mélange d’amorces (étape 1.4.1), 12,5 μL de mélange principal lava lamp, 1 μL d’ADN extrait et 9 μL de ddH₂O. Le volume total est de 25 μL.
      REMARQUE : Si vous utilisez l’instrument d’amplification portatif (p. ex., Genie III) avec colorant colorimétrique (p. ex., Warmstart), reportez-vous à la section 2.4.2- 2.4.3.
   3. Désignez deux tubes comme des contrôles positifs et négatifs. Pour le contrôle positif, utilisez soit un contrôle fourni par le kit LAVA LAMP, soit un échantillon d’ADN positif connu. Pour le contrôle négatif, utilisez ddH₂O. Pour les deux, remplacer le 1 μL de l’ADN extrait par 1 μL du contrôle positif ou ddH₂O.
   4. Placez les échantillons dans un bloc thermique (ou instrument d’amplification portatif) réglé à 64 °C pendant 45 min.
      REMARQUE : D’autres méthodes d’extraction peuvent être utilisées ici au lieu de l’extraction magnétique à base de perles. CTAB et un kit d’extraction d’ADN commercial ont tous deux été testés avec succès à l’aide des protocoles standard et en remplaçant les morceaux de papier filtre pour l’échantillon de la plante^24,25. Les résultats ont été comparés au tableau 2. Si la concentration de l’ADN peut être quantifiée, utiliser entre 1-10 ng d’ADN génomique.
5. Visualisation des résultats
   1. S’il est effectué en laboratoire, affichez les produits d’amplification en chargeant 5 μL de chaque échantillon dans un gel agarose de 1 %, en les exécutant dans une machine d’électrophorèse de gel et en les imaginant dans une machine d’imagerie UV.
   2. Si un colorant colorimétrique (p. ex., Warmstart) a été utilisé, affichez le changement de couleur pour déterminer les résultats comme positifs ou négatifs.
   3. Si un instrument d’amplification portatif (p. ex., Genie III) a été utilisé, affichez le graphique d’amplification à l’écran pour déterminer les résultats.
6. Application d’un test PCR déjà développé
   REMARQUE : Si vous utilisez un test PCR classique, les étapes 1 à 3 restent les mêmes et les étapes suivantes doivent être appliquées à la place des étapes 1.4 et 1.5.
   1. Ajouter 1 μL de chaque extraction d’ADN à des tubes individuels contenant les composants suivants : 12,5 μL de mélange principal PCR vert, 9,5 μL de ddH₂O et 1 μL d’amorces avant et inverses (tableau 2).
   2. Faites tourner chaque échantillon à l’aide d’une microcentrifuge et placez les tubes dans un cycleur thermique.
   3. Utiliser les paramètres de cycleur thermique suivants conformément aux publications précédentes : 94 °C pour 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pour 30 s, annealing à 54 °C pour 30 s, extension à 72 °C pendant 1 min, et extension finale à 72 °C pour 10 min.
   4. Exécutez le produit dans un gel agarose de 1%. Observez la présence de bandes sous la lumière UV où les réactions positives auront une taille de bande d’environ 508 pb.
7. Méthode traditionnelle de détection
   REMARQUE : Il existe plusieurs méthodes de placage sélectif pour la détection des agents pathogènes, et voici un protocole général pour P. capsici.
   1. Tout d’abord, obtenir un fruit d’aubergine sain (un hôte sensible pour P. capsici) et la surface stériliser en lavant la surface des fruits avec 70% d’alcool isopropyle.
   2. Placer les aubergines dans des caisses de lait à l’aide d’un dispositif de flottaison (mousse de polyéthylène ou autre) et les déployer dans les bassins d’irrigation. Fixez chaque piège à appâts à un seul point et laissez les pièges dans le réservoir d’eau (eau d’irrigation recyclée) pendant au moins 7 jours ou jusqu’à ce que des symptômes de pourriture des fruits soient observés. Recueillir les fruits et les transporter au laboratoire.
   3. Rincer et sécher les fruits dans une hotte stérile avant d’enlever de petits morceaux de tissus infectés et les placer sur une plaque de parph moyenne modifiée avec 25 mg/L pentachloronitrobenzène, 0,0005% pimaricine, 250 mg/L ampicilline, 10 mg/L rifampicine et 50 mg/L hymexazol. Incuber les plaques à 25 °C pendant 5 jours.
   4. Voir les plaques sous un microscope composé pour l’identification morphologique traditionnelle à 4 jours après l’isolement.

2. Détermination de la limite de détection de la concentration de zoospores

1. Fabrication de la suspension zoospore
   1. Incuber P. capsici sur agar V8 (100 mL de jus V8, 900 mL de ddH₂O, 1 g de plaques CaCO₃) pendant 1 semaine à 26 °C. Plusieurs plaques peuvent être utilisées pour obtenir une plus grande quantité de suspension zoospore.
   2. Incuber les plaques sous la lumière continue à température ambiante pendant 3 jours pour stimuler la sporulation.
   3. Inonder les assiettes en ajoutant 15 mL de ddH₂O à chaque assiette et les placer dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 25 min. Puis revenir à la température ambiante pendant 30 min.
   4. Agiter les plaques pour déloger les zoospores et la pipette de la solution dans un seul tube de 50 ml de toutes les plaques.
   5. Pour obtenir une estimation précise de la concentration de zoospores, ajouter 10 μL de suspension de spores sur un hémocytomètre et observer au microscope pour compter les zoospores et estimer la concentration moyenne.
2. Dilution en série
   1. Ajouter 1 ml de suspension des spores et 9 ml de ddH₂O à un tube séparé. Répétez cette étape pour autant de dilutions 10 fois que souhaité.
   2. Les solutions spores sont ensuite soumises pour l’extraction de l’ADN sur la base du protocole précédent à l’aide de la méthode de filtration.
      REMARQUE : Si un plus grand volume de suspension est souhaité, doublez le volume : 2 mL de suspension de spores et 18 mL de ddH₂O.
3. Détection de la limite de concentration des zoospores
   1. Évaluer la limite de détection des spores en exécutant chaque dilution en série individuellement à travers l’essai jusqu’à ce que des résultats clairement positifs ne soient plus observés. Une fois la dilution finale obtenue, diluer par un facteur de 2 (4,8 à 2,4 dans cet exemple) et exécuter l’essai à nouveau pour obtenir une limite de détection plus précise.
4. Développement et optimisation de la méthode LAMP
   REMARQUE : Les amorces LAMP ont été conçues sur la base d’unfragment de paire de 1121 bases (pb) de P. capsici (Li et al.¹⁹) comme le montre la figure supplémentaire 2 .
   1. Si le colorant colorimétrique (p. ex., Warmstart) est utilisé, utilisez la solution suivante : 2,5 μL de mélange d’amorce, 12,5 μL de colorant colorimétrique, 0,5 μL de colorant fluorescent vert, 1 μL d’ADN extrait et 8,5 μL de ddH₂O. Le volume total est de 25 μL.
   2. Lors de l’utilisation de l’instrument d’amplification portable avec MASTERmix LAVALAMP, avoir une première étape de 95 °C pendant 3 min comme recommandé par le fabricant, mais ce n’est pas nécessaire. Une dernière étape d’anneaux n’est pas nécessaire pour observer le graphique de changement de couleur ou d’amplification. Ne pas exécuter une étape warmstart si le colorant colorimétrique commercial doit être utilisé.
   3. Voir les résultats de l’analyse LAMP dans l’une des méthodes suivantes: exécuter des échantillons sur un gel agarose 1% ou de vue à l’aide d’une machine d’imagerie UV à l’œil nu ou de voir à l’écran d’amplification genie III en temps réel.
   4. Optimisez la température de l’essai LAMP à l’aide de l’instrument d’amplification portable et analysez à l’aide du graphique d’amplification en temps réel pour la vitesse et le niveau de sensibilité. Exécutez des échantillons avec des températures uniques pour déterminer l’amplification la plus rapide avec le plus haut niveau de sensibilité.
   5. Déterminer la limite de détection de l’essai développé par LAMP en effectuant une dilution en série de l’ADN extrait (comme avec la suspension des spores à l’étape 2.2.1) et en maintenant les conditions de réaction comme précédemment décrit pour la réaction de LAMP pour chaque dilution.
5. Détermination et comparaison des limites de détection avec la méthode PCR conventionnelle
   1. Utilisez l’ADN extrait par étapes de la section 1.3 pour comparer le niveau de détection du PCR conventionnel avec celui de l’essai LAMP.
   2. Ajouter 1 μL d’ADN à un tube PCR qui contenait 1 μL d’amorces PCR avant et inverses (tableau 2), 12,5 μL de Green PCR Mastermix et 9,5 μL de ddH₂O pour un total de 25 μL.
   3. Amplifier les échantillons dans un cycleur thermique en utilisant les conditions suivantes : 94 °C pour 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pour 30 s, annealing à 54 °C pour 30 s, extension à 72 °C pendant 1 min, et extension finale à 72 °C pendant 10 min.
   4. Exécutez des échantillons dans une machine d’électrophorèse sur un gel agarose de 1% et affichez-les sur une machine d’imagerie UV. La taille de la bande exceptée était de 508 pb.

Résultats

Optimisation de la méthode LAMP
Dans cette étude, nous avons détecté la présence de Phytophthora capsici dans l’eau d’irrigation à l’aide d’un test d’amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle portable. Tout d’abord, l’essai lamp proposé a été optimisé en testant différentes concentrations d’amorces de LAMP [F3, B3 (0,1–0,5 μM chacune); LF, LB (0,5–1,0 μM chacun) et FIP, BIP (0,8–2,4 μM chacun)], durées (30–70 min) et températures (55–7...

Discussion

L’essai de l’eau d’irrigation pour les phytopathogènes est une étape cruciale pour les producteurs utilisant des étangs d’irrigation et de l’eau recyclée²⁷. Les étangs d’irrigation fournissent un réservoir et un terrain de reproduction pour un certain nombre de phytopathogènes car l’excès d’eau d’irrigation est dirigé du champ à l’étang transportant avec lui tous les agents pathogènes qui peuvent avoir été présents^16,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel powder	Thomas Scientific	C997J85
Buchner funnel	Southern Labware	JBF003
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Centrifuge 5430	Eppendorf	22620509
Chloroform	Fischer Scientific	C298-500
CTAB solution	Biosciences	786-565
Dneasy Extraction Kit	Qiagen	69104
Filter Flask	United	FHFL1000
Filter Paper	United Scientific Supplies	FPR009
Gel Green 10000X	Thomas Scientific	B003B68 (1/EA)
Genie III	OptiGene
Hand pump	Thomas Scientific	1163B06
Iso-amyl Alcohol	Fischer Scientific	BP1150-500
LAVA LAMP master mix	Lucigen	30086-1
Magnetic bead DNA extraction	Genesig	genesigEASY-EK
Magnetic Separator	Genesig	genesigEASY-MR
polyvinylpyrrolidone	Sigma Aldrich	PVP40-500G
Primers	Sigma Aldrich
Prism Mini Centrifuge	Labnet	C1801
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
UV Gel Doc	Analytik Jena	849-00502-2
Warmstart Colorimetric Dye	Lucigen	E1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell	Bio-Rad	1704489EDU
70% isopropanol	Fischer Scientific	A451-1