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Resumo

Desenvolvemos um método para detectar zoospores Phytophthora capsici em fontes de água usando um método de extração de DNA de papel filtro juntamente com um ensaio de amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) que pode ser analisado no campo ou no laboratório.

Resumo

Phytophthora capsici é um patógeno oomycete devastador que afeta muitas culturas solanáceas e cucurbits importantes, causando perdas econômicas significativas na produção de vegetais anualmente. Phytophthora capsici é transmitida pelo solo e um problema persistente nos campos vegetais devido às suas estruturas de sobrevivência de longa duração (oosporos e clamídias) que resistem ao intemperamento e degradação. O principal método de dispersão é através da produção de zoosporos, que são esporos sinalizados de célula única que podem nadar através de filmes finos de água presentes em superfícies ou em poros de solo cheios de água e podem se acumular em poças e lagoas. Portanto, as lagoas de irrigação podem ser uma fonte do patógeno e dos pontos iniciais de surtos da doença. A detecção de P. capsici na água de irrigação é difícil usando métodos tradicionais baseados em cultura porque outros microrganismos presentes no ambiente, como pythium spp., geralmente superreceu P. capsici tornando-o indetectável. Para determinar a presença de esporos de P. capsici em fontes de água (água de irrigação, escoamento, etc.), desenvolvemos um método de filtro à base de bomba manual (8-10 μm) que captura os esporos do patógeno (zoospores) e é posteriormente usado para amplificar o DNA do patógeno através de um novo ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) projetado para a amplificação específica de P. Este método pode amplificar e detectar DNA a partir de uma concentração tão baixa quanto 1,2 x 102 zoospores/mL, que é 40 vezes mais sensível do que o PCR convencional. Não foi obtida amplificação cruzada ao testar espécies intimamente relacionadas. A LÂMPADA também foi realizada utilizando um corante de mistura mestre lampimétrica, exibindo resultados que poderiam ser lidos a olho nu para detecção rápida no local. Este protocolo pode ser adaptado a outros patógenos que residem, acumulam ou são dispersos através de sistemas de irrigação contaminados.

Introdução

A reciclagem de água em fazendas e viveiros está se tornando cada vez mais popular devido ao aumento dos custos de água e preocupações ambientais por trás do uso da água. Muitos métodos de irrigação foram desenvolvidos para os produtores reduzirem a propagação e a ocorrência de doenças vegetais. Independentemente da fonte da água (irrigação ou precipitação), o escoamento é gerado, e muitos produtores de hortaliças e berçários têm uma lagoa para coletar e reciclar o escoamento1. Isso cria um reservatório para possível acúmulo de patógenos favorecendo a disseminação de patógenos quando a água reciclada é usada para irrigar as culturas2,,3,4. Os patógenos vegetais oomycete se beneficiam particularmente dessa prática, pois os zoosporos se acumularão na água e o esporo dispersivo primário é auto-motil, mas requer água superficial5,,6,,7. Phytophthora capsici é um patógeno oomycete que afeta um número significativo de culturas solanáceas e cucurbitas de diferentes maneiras8. Muitas vezes, os sintomas são amortecimento de mudas, raízes e podridão da coroa; no entanto, em culturas como pepino, abóbora, melão, abóbora, melancia, berinjela e pimenta, colheitas inteiras podem ser perdidas devido à podridão de frutas9. Embora existam métodos conhecidos de detecção desse patógeno vegetal, a maioria requer uma infecção que já tenha ocorrido, o que é tarde demais para que quaisquer fungicidas preventivos tenham um efeito significativo10.

O método tradicional de teste da água de irrigação para a detecção e diagnóstico de microrganismos direcionados é uma abordagem antiquada quando a velocidade e a sensibilidade são cruciais para o sucesso e a produção rentável da cultura11,12. O tecido vegetal suscetível ao patógeno-alvo (por exemplo, berinjela para P. capsici) é anexado a uma armadilha modificada que é suspensa em uma lagoa de irrigação por um período prolongado antes de ser removida e inspecionada para infecção. As amostras do tecido vegetal são então banhadas em mídia semi-seletiva (PARPH) e incubadas para o crescimento da cultura, em seguida, a identificação morfológica é realizada usando um microscópio composto13. Existem outros métodos de detecção semelhantes para outros patógenos vegetais usando mídia seletiva e emplacando pequenas quantidades de água contaminada antes de sub-cultivo14,15. Esses métodos requerem entre 2 e 6 semanas, várias rodadas de subcultura para isolar o organismo, e experimentam em diagnósticos de Phytophthora para serem capazes de reconhecer os principais caracteres morfológicos de cada espécie. Esses métodos tradicionais não funcionam bem para detecção de água de irrigação contaminada por P. capsici devido a fatores como a interferência de outros microrganismos que também estão presentes nas fontes de água. Alguns microrganismos de rápido crescimento, como pythium spp. e bactérias transmitidas pela água podem crescer demais na placa tornando P. capsici indetectável16,17.

O objetivo deste estudo foi desenvolver um método molecular sensível e específico que possa ser utilizado tanto em ambientes de campo quanto em laboratório para detectar zoospores P. capsici na água de irrigação. O protocolo inclui o desenvolvimento de um novo primer de amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) capaz de amplificar especificamente P. capsici, baseado em um fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici18,19. Um primer LAMP previamente desenvolvido de Dong et al. (2015) foi utilizado em comparação com o ensaio que foi desenvolvido para este estudo20.

O ensaio LAMP é uma forma relativamente nova de detecção molecular que tem sido demonstrada ser mais rápida, sensível e específica do que a reação convencional de cadeia de polimerase (PCR)21. Em geral, os ensaios convencionais de PCR não podem detectar menos de 500 cópias (1,25 pg/μL); em contraste, estudos anteriores mostraram que a sensibilidade da LÂMPADA pode ser 10 a 1.000 vezes maior que a pcr convencional e pode facilmente detectar até mesmo 1 fg/μL de DNA genômico22,23. Além disso, o ensaio pode ser realizado rapidamente (muitas vezes em 30 minutos) e no local (no campo) usando um bloco de aquecimento portátil para amplificação e um corante colorimétrico que muda de cor para uma amostra positiva (removendo a necessidade de eletroforese). Neste estudo, comparamos a sensibilidade dos ensaios PCR e LAMP utilizando um método de extração de filtro. O método de detecção proposto permite que pesquisadores e agentes de extensão detectem facilmente a presença de esporos de P. capsici de diferentes fontes de água em menos de duas horas. O ensaio é provado ser mais sensível do que o PCR convencional e foi validado in situ detectando a presença do patógeno na água de irrigação usada por um produtor. Este método de detecção permitirá que os produtores estimem a presença e a densidade populacional do patógeno em várias fontes de água que estão sendo utilizadas para irrigação, prevenindo surtos devastadores e perdas econômicas.

Protocolo

1. Detecção no local de Phytophthora capsici da água de irrigação usando amplificação isotérmica mediada por loop portátil

  1. Configuração da bomba e do filtro
    1. Conecte um frasco de filtragem a um tubo conectado a uma bomba de mão para que, quando a bomba for ativada, o ar seja puxado pela boca do frasco filtrante.
    2. Coloque o funil Buchner na rolha de borracha na boca do frasco filtrante e coloque o pedaço de papel filtro de tamanho apropriado no funil Buchner para que o ar seja puxado através do papel filtro. O papel filtro deve ter um tamanho de retenção de 15 μm.
      NOTA: O papel filtro deve caber nas bordas do funil Buchner para que a água mínima flua ao redor do papel do filtro.
  2. Amostragem e filtragem de água
    1. Pegue amostras de água da fonte alvo. A água pode ter pequenas quantidades de detritos, mas não sedimentos ou solo significativos.
    2. Despeje até 1.000 mL (1 Litro) de água de teste sobre o papel filtro colocado dentro do funil Buchner lentamente o suficiente para evitar o transbordamento, enquanto a bomba de mão (ou vácuo) está sendo usada para criar uma sucção para puxar a água.
      NOTA: Não há quantidade mínima de água que possa ser testada usando este método, e embora seja sugerido pelo menos 50 mL, 1000 mL é o máximo para este método.
    3. Usando fórceps, remova o papel filtro do funil Buchner e corte-o em pequenos pedaços com uma tesoura estéril. Adicione o máximo de peças (8-12) que podem ser submersas na quantidade de tampão de extração (400 μL para extração magnética à base de contas) exigida pelo protocolo em um tubo de 1,5 mL. Guarde pedaços restantes de papel filtro para processamento após a extração do primeiro conjunto.
    4. Vórtice ou agitar os pedaços de papel filtro e tampão de extração por 10 s a cada minuto por 5 minutos. Em seguida, usando fórceps, remova o papel filtro perdendo o mínimo possível do tampão de extração. Repita esta etapa com as peças restantes de papel filtro até que todas as peças tenham sido vórtices/agitadas e encharcadas no tampão de extração.
  3. Extração magnética baseada em contas de DNA a partir de papel filtro
    1. Ao tubo de 1,5 mL (que agora contém aproximadamente 200-300 μL de tampão de extração), adicione 20 μL de proteinase K e 10 μL de 10 ng/μL RNase.
    2. Incubar em temperatura ambiente por 15 minutos, vórtice ou agitar o tubo a cada 3 minutos.
    3. Adicione 500 μL de contas magnéticas com o tampão de ligação à amostra e misture bem tremendo. Em seguida, incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
    4. Coloque o tubo no rack separador magnético por 2 minutos até que todas as contas tenham sido puxadas para o ímã. Remova e descarte o supernaspe.
    5. Remova o tubo do separador magnético. Adicione 500 μL de Wash Buffer 1 e suspenda as contas agitando vigorosamente o tubo. Espere por 30 s e, em seguida, coloque o tubo de volta no separador magnético. Aguarde 2 minutos até que todas as contas tenham sido puxadas para o ímã antes de remover e descartar o supernante.
      NOTA: Ao esperar que as contas magnéticas magnetizem para o separador, recomendamos inverter o tubo, que pode desalojar contas magnéticas presas à tampa e às laterais do tubo e resultar em um maior número de contas sendo anexadas.
    6. Repita o passo 1.3.5 com 500 μL de Wash Buffer 2.
    7. Repetição passo 1.3.5 com 500 μL de 80% de etanol.
    8. Doer a pelota magnética por 15 minutos à temperatura ambiente (18-27 °C) com a tampa aberta. Se as temperaturas não permitirem, incubar em uma mão enluvada com a tampa aberta por 15 minutos.
    9. Remova o tubo do separador magnético. Adicione 50 μL de tampão de elução e suspenda as contas por tubulação para cima e para baixo por 1 min.
    10. Coloque o tubo de volta em um separador magnético. Espere 2 minutos antes de transferir o supernatante sem perturbar as contas para um tubo separado para armazenamento de DNA.
      NOTA: Aqui o experimento pode ser pausado antes de seguir em frente. O DNA extraído deve ser armazenado no gelo ou em um congelador de -20 °C.
  4. Aplicação do ensaio LÂMPADA recém-desenvolvido
    1. Prepare o primer LAMP usando 0,2 μM de cada primer F3 e B3, 0,8 μM de cada primer Loop-F e Loop-B e 1,6 μM de cada primer FIP e BIP(Tabela 2).
    2. Adicione a seguinte solução LAMP a um único tubo PCR, ou a cada tubo individual na tira de tubo de 8: 2,5 μL de mix de primer (passo 1.4.1), 12,5 μL de mistura mestre lava lâmpada, 1 μL de DNA extraído e 9 μL de ddH2O. O volume total é de 25 μL.
      NOTA: Se utilizar o instrumento de amplificação portátil (por exemplo, Genie III) com corante colorimétrico (por exemplo, Warmstart), consulte a seção 2.4.2- 2.4.3.
    3. Designe dois tubos como controles positivos e negativos. Para o controle positivo, use um controle fornecido pelo kit LAVA LAMP, ou uma amostra de DNA positiva conhecida. Para o controle negativo, use ddH2O. Para ambos, substitua o 1 μL de DNA extraído por 1 μL do controle positivo ou ddH2O.
    4. Coloque as amostras em um bloco de calor (ou instrumento de amplificação portátil) definido para 64 °C por 45 min.
      NOTA: Outros métodos de extração podem ser usados aqui em vez de extração baseada em contas magnéticas. CTAB e um kit comercial de extração de DNA foram testados com sucesso usando os protocolos padrão e substituindo os pedaços de papel filtro para a amostra da planta24,25. Os resultados foram comparados na Tabela 2. Se a concentração de DNA pode ser quantificada, use entre 1-10 ng DNA genômico.
  5. Visualização de resultados
    1. Se realizado em um ambiente de laboratório, visualize os produtos de amplificação carregando 5 μL de cada amostra em um gel de 1% de agarose, executando-os em uma máquina de eletroforese de gel e exibindo-os em uma máquina de imagem UV.
    2. Se for utilizado um corante colorimétrico (por exemplo, Warmstart), veja a mudança de cor para determinar os resultados como positivos ou negativos.
    3. Se um instrumento de amplificação portátil (por exemplo, Genie III) foi usado, visualize o gráfico de amplificação na tela para determinar os resultados.
  6. Aplicação de ensaio PCR previamente desenvolvido
    NOTA: Se usar um ensaio PCR convencional, as etapas 1-3 permanecem as mesmas, e as seguintes etapas devem ser aplicadas no lugar das etapas 1.4 e 1.5.
    1. Adicione 1 μL de cada extração de DNA a tubos individuais contendo os seguintes componentes: 12,5 μL de mix mestre PCR verde, 9,5 μL de ddH2O e 1 μL de primers dianteiros e invertidos(Tabela 2).
    2. Gire cada amostra usando um microcentrifuuge e coloque tubos em um cicloviário térmico.
    3. Use as seguintes configurações de cicloviário térmico de acordo com as publicações anteriores: 94 °C para 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 °C para 30 s, ressarnamento a 54 °C para 30 s, extensão a 72 °C por 1 min, e extensão final a 72 °C para 10 min.
    4. Execute o produto em um gel de 1% de agarose. Observe a presença de bandas sob luz UV onde reações positivas terão um tamanho de banda de ~508 bp.
  7. Método tradicional de detecção
    NOTA: Existem vários métodos de revestimento seletivo para detecção de patógenos, e o seguinte é um protocolo geral para P. capsici.
    1. Primeiro, obtenha uma fruta de berinjela saudável (um hospedeiro suscetível para P. capsici) e esterilizar a superfície da fruta com 70% de álcool isopropílico.
    2. Coloque a fruta de berinjela em caixas de leite com um dispositivo de flutuação (espuma de polietileno ou outra) e implante em lagoas de irrigação. Fixar cada armadilha de isca em um único ponto e deixar as armadilhas no reservatório de água (água de irrigação reciclada) por pelo menos 7 dias ou até que os sintomas da podridão das frutas sejam observados. Pegue a fruta e transporte para o laboratório.
    3. Enxágüe e seque a fruta em uma coifa estéril antes de remover pequenos pedaços de tecidos infectados e coloque-os em uma placa de meio PARPH emendada com 25 mg/L pentachloronitrobenzene, 0,0005% pimaricina, 250 mg/L ampicillin, 10 mg/L rifampicina e 50 mg/L de hímolazol. Incubar placas a 25 °C durante 5 dias.
    4. Veja as placas sob um microscópio composto para identificação morfológica tradicional em 4 dias após o isolamento.

2. Determinando o limite de detecção da concentração de zoosporos

  1. Tornando a suspensão do zoospore
    1. Incubar P. capsici no ágar V8 (100 mL de suco V8, 900 mL de ddH2O, 1 g de CaCO3) pratos por 1 semana a 26 °C. Várias placas podem ser usadas para obter uma maior quantidade de suspensão zoospora.
    2. Incubar as placas sob luz contínua à temperatura ambiente por 3 dias para estimular a esporulação.
    3. Dilua as placas adicionando 15 mL de ddH2O a cada prato e coloque-as em uma geladeira de 4 °C por 25 min. Em seguida, volte à temperatura ambiente por 30 minutos.
    4. Agitar placas para desalojar zoospores e pipetar a solução em um único tubo de 50 mL de todas as placas.
    5. Para obter uma estimativa precisa da concentração de zoospore, adicione 10 μL da suspensão do esporo em um hemótmetro e observe sob um microscópio para contar zoosporos e estimar a concentração média.
  2. Diluição serial
    1. Adicione 1 mL da suspensão do esporo e 9 mL de ddH2O a um tubo separado. Repita esta etapa para quantas diluições de 10 vezes desejarem.
    2. As soluções de esporos são então submetidas à extração de DNA com base no protocolo anterior usando o método de filtragem.
      NOTA: Se for desejado um volume maior de suspensão, dobre o volume: 2 mL de suspensão de esporos e 18 mL de ddH2O.
  3. Detecção do limite de concentração de zoospore
    1. Avalie o limite de detecção de esporos executando cada diluição serial individualmente através do ensaio até que resultados claramente positivos não sejam mais observados. Uma vez obtida a diluição final, dilui por um fator de 2 (4,8 a 2,4 neste exemplo) e execute o ensaio novamente para obter um limite de detecção mais preciso.
  4. Desenvolvimento e otimização do método LAMP
    NOTA: Os primers lamp foram projetados com base em um fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici (Li et al.19) conforme mostrado na Figura Suplementar 2.
    1. Se for utilizado corante colorimétrico (por exemplo, Warmstart), utilize a seguinte solução: 2,5 μL de mix de primer, 12,5 μL de corante colorimétrico, 0,5 μL de corante fluorescente verde, 1 μL de DNA extraído e 8,5 μL de ddH2O. O volume total é de 25 μL.
    2. Ao utilizar o instrumento de amplificação portátil com mastermix LAVALAMP, tenha uma etapa inicial de 95 °C para 3 min conforme recomendado pelo fabricante, mas isso não é necessário. Uma etapa final de ressaramento não é necessária para observar a mudança de cor ou o gráfico de amplificação. Não execute uma etapa de partida quente se o corante colorimétrico comercial for usado.
    3. Ver o ensaio LAMP resulta em um dos seguintes métodos: executar amostras em um gel de 1% de agarose ou ver usando uma máquina de imagem UV a olho nu ou vista na tela de amplificação em tempo real do Genie III.
    4. Otimize a temperatura do ensaio LAMP usando o instrumento de amplificação portátil e analise usando o gráfico de amplificação em tempo real para velocidade e nível de sensibilidade. Execute amostras com temperaturas únicas para determinar a amplificação mais rápida com o maior nível de sensibilidade.
    5. Determine o limite de detecção da LÂMPADA desenvolvida por meio da diluição serial do DNA extraído (como com a suspensão do esporo na etapa 2.2.1) e mantendo condições de reação como descrito anteriormente para a reação LAMP para cada diluição.
  5. Determinação e comparação do limite de detecção com o método PCR convencional
    1. Use DNA extraído em etapas na seção 1.3 para comparar o nível de detecção do PCR convencional com o do ensaio LAMP.
    2. Adicione 1 μL de DNA a um tubo PCR que continha 1 μL de primers PCR dianteiros e invertidos(Tabela 2),12,5 μL de Green PCR Mastermix e 9,5 μL de ddH2O para um total de 25 μL.
    3. Amplie as amostras em um cicloviário térmico utilizando as seguintes condições: 94 °C para 5 min, 30 ciclos de desinaturação a 94 °C para 30 s, ressarem a 54 °C para 30 s, extensão a 72 °C por 1 min e extensão final a 72 °C por 10 min.
    4. Execute amostras em uma máquina de eletroforese em um gel de 1% de agarose e veja em uma máquina de imagem UV. O tamanho da banda com exceção foi de 508 bp.

Resultados

Otimização do método LAMP
Neste estudo, detectamos a presença de Phytophthora capsici na água de irrigação usando um ensaio portátil de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP). Primeiro, o ensaio lampião proposto foi otimizado testando diferentes concentrações de primer lamp [F3, B3 (0,1-0,5 μM cada); LF, LB (0,5-1,0 μM cada) e FIP, BIP (0,8-2,4 μM cada)], durações (30-70 min) e temperaturas (55-70 °C). O mix final de primer LAMP utilizado neste estudo foi: 0,2 μM...

Discussão

O teste da água de irrigação para fitopatógenos é um passo crucial para os produtores que utilizam lagoas de irrigação e água reciclada27. As lagoas de irrigação fornecem um reservatório e um terreno fértil para uma série de fitopatógenos, uma vez que o excesso de água de irrigação é direcionado do campo para a lagoa carregando consigo quaisquer patógenos que possam ter estado presentes16,,27. O método tradicional de de...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar ou conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho recebeu o apoio financeiro da Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID# FP000016659. Os autores agradecem ao Dr. Pingsheng Ji, universidade da Geórgia e à Phytophthora sppDra. Agradecemos também li Wang e Deloris Veney por sua assistência técnica durante todo o estudo.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose gel powderThomas ScientificC997J85
Buchner funnelSouthern LabwareJBF003
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Centrifuge 5430Eppendorf22620509
ChloroformFischer ScientificC298-500
CTAB solutionBiosciences786-565
Dneasy Extraction KitQiagen69104
Filter FlaskUnitedFHFL1000
Filter PaperUnited Scientific SuppliesFPR009
Gel Green 10000XThomas ScientificB003B68 (1/EA)
Genie IIIOptiGene
Hand pumpThomas Scientific1163B06
Iso-amyl AlcoholFischer ScientificBP1150-500
LAVA LAMP master mixLucigen30086-1
Magnetic bead DNA extractionGenesiggenesigEASY-EK
Magnetic SeparatorGenesiggenesigEASY-MR
polyvinylpyrrolidoneSigma AldrichPVP40-500G
PrimersSigma Aldrich
Prism Mini CentrifugeLabnetC1801
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
UV Gel DocAnalytik Jena849-00502-2
Warmstart Colorimetric DyeLucigenE1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT CellBio-Rad1704489EDU
70% isopropanolFischer ScientificA451-1

Referências

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