루프 매개 이소르말 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시 검출

요약

현장이나 실험실에서 분석할 수 있는 루프 매개 이더스말 증폭(LAMP) 분석과 결합된 필터 종이 DNA 추출 방법을 사용하여 수원에서 피토프토라 캡시 동물원을 검출하는 방법을 개발했습니다.

초록

Phytophthora capsici는 매년 야채 생산에 상당한 경제적 손실을 일으키는 많은 중요 한 솔 라 와 cucurbit 작물에 영향을 미치는 파괴적인 oomycete 병원 체 병원 체. 식물성 캡시치는 풍화와 저하에 저항하는 오랜 생존 구조 (oospores 및 클라미도스포레스)로 인해 토양 매개 및 식물 분야에서 지속적인 문제입니다. 분산의 주요 방법은 표면이나 물로 채워진 토양 모공에서 존재하는 얇은 필름을 통해 수영할 수 있고 웅덩이와 연못에 축적 될 수있는 단일 세포, 기화 포자의 생산을 통해입니다. 따라서 관개 연못은 병원체및 질병 발생의 초기 지점의 원천이 될 수 있다. 피티움 스PP와 같은 환경에 존재하는 다른 미생물이 일반적으로 P. capsici를 과도하게 성장시켜 검출할 수 없기 때문에 관개 물에서 P. capsici를 검출하는 것은 전통적인 배양 기반 방법을 사용하기 어렵다. P의 존재를 결정합니다. 수원(관개물, 유출 등)의 캡시 포자는 병원체 의 포자(zoospores)를 포착하는 핸드 펌프 기반 필터 용지(8-10 μm) 방법을 개발했으며, 나중에 는 새로운 루프 매개 액티어를 통해 병원체의 DNA를 증폭시키는 데 사용됩니다. P. capsici. 이 방법은 기존 PCR보다 40배 더 민감한 1.2 x 10² 동물원/mL농도로부터 DNA를 증폭하고 검출할 수 있다. 밀접하게 관련된 종을 테스트 할 때 교차 증폭을 얻을 수 없습니다. LAMP는 또한 착색 램프 마스터 믹스 염료를 사용하여 수행되었으며, 현장의 빠른 감지를 위해 육안으로 읽을 수 있는 결과를 표시했습니다. 이 프로토콜은 오염된 관개 시스템을 통해 거주하거나 축적되거나 분산되는 다른 병원균에 적응할 수 있습니다.

서문

물 비용의 증가와 물 사용 의 환경 문제로 인해 농장과 보육원의 재활용 물이 점점 더 인기를 끌고 있습니다. 식물 질환의 확산과 발생을 줄이기 위해 재배자를 위해 많은 관개 방법이 개발되었습니다. 물의 근원(관개 또는 강수량)에 관계없이 유출이 발생하고, 많은 채소와 보육 재배자가^유출1을수집하고 재활용할 수 있는 연못이 있다. 이는 재활용물이 작물^2,3,34를관개하는 데 사용될 때 병원균의 확산을 선호하는 병원균 축적 가능성을 위한^저수지를만든다. Oomycete 식물 병원체는 특히 동물원포어가 물에 축적되고 1 차 분산 포자는 자기 motile하지만 표면 물^5,,6,,7이필요하기 때문에이 관행에서 특히 이점을 누릴 수 있습니다. Phytophthora capsici는 다른 방법으로 solanaceous cucurbit 작물의 상당수에 영향을 미치는 oomycete 병원체^8. 종종 증상은 모종, 뿌리 및 크라운 부패의 감쇠입니다. 그러나 오이, 스쿼시, 멜론, 호박, 수박, 가지 및 후추와 같은 작물에서는 과일 부패^9로인해 전체 수확량이 손실될 수 있습니다. 이 식물 병원균을 검출하는 알려진 방법이 있지만, 대부분은 이미 어떤 예방 살균제에 대한 너무 늦은 일이 발생 감염을 필요로^10.

표적 미생물의 검출 및 진단을 위해 관개수를 테스트하는 전통적인 방법은 속도와 감도가 성공과 수익성 있는 작물^{생산(11,,12)에}결정적인 시기에 구식 접근법이다. 표적 병원체(예를 들어, P. capsici용가지)에 취약한 식물 조직은 감염을 제거하고 검사하기 전에 장시간 관개 연못에 매달린 수정된 트랩에 부착된다. 식물 조직으로부터의 샘플은 반선택적 미디어(PARPH)에 도금되고 배양 성장을 위해 배양한 다음, 복합^{현미경(13)을}이용하여 형태학적 식별이 수행된다. 선택적 매체를 이용하여 소량의 오염된 물을 소량도금하여^14,,15를하위 배양하기 전에 다른 식물 병원균에 대한 다른 유사한 검출 방법이 있다. 이러한 방법은 유기체를 분리하기 위해 2 주에서 6 주, 여러 차례의 하위 배양이 필요하며, 각 종의 주요 형태학적 문자를 인식할 수 있도록 Phytophthora 진단에 대한 경험이 필요합니다. 이러한 전통적인 방법은 수원에 존재하는 다른 미생물에 의한 간섭과 같은 요인으로 인해 P. capsici에 의해 오염된 관개 수를 검출하는 데 잘 작동하지 않습니다. 파이티움 스프와 수인성 박테리아와 같은 일부 빠르게 성장하는 미생물은 접시에 과도하게 자랄 수 있어 P. capsici를 탐지할 수 없는^16,,17.

이 연구의 목적은 관개 물에서 P. capsici 동물원포자를 검출하기 위해 현장 및 실험실 설정 모두에서 사용할 수있는 민감하고 구체적인 분자 방법을 개발하는 것이었습니다. 이 프로토콜은 P. capsici^,18,19의1121베이스 쌍(bp) 단편을 기반으로 P. capsici를구체적으로 증폭시킬 수 있는 새로운 루프 매개 이스테어 증폭(LAMP) 프라이머 세트의 개발을 포함한다. 동외에서 이전에 개발된 LAMP 프라이머(2015)는 이 연구를 위해 개발된^{분석서(20)에}비해 사용되었다.

LAMP 분석체는 종래의 중합효소 연쇄^{반응(PCR)(21)보다}더 빠르고 민감하며 특이적임을 입증된 비교적 새로운 형태의 분자 검출이다. 일반적으로, 기존의 PCR 어설션은 500부(1.25 pg/μL) 미만을 감지할 수 없다. 대조적으로, 이전 연구는 LAMP의 감도가 종래의 PCR보다 10 ~ 1,000 배 높을 수 있으며 게놈 DNA^22,,23의1 fg /μL조차도 쉽게 감지 할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 분석체는 증폭을 위한 휴대용 가열 블록을 사용하여 현장에서(종종 30분) 및 현장(현장에서) 신속하게 수행될 수 있으며, 양성 시료에 대한 색을 변화시키는 색염염(전기포혈의 필요성 제거). 이 연구에서는 필터 추출 방법을 사용하여 PCR 및 LAMP 분석의 감도를 비교했습니다. 제안된 검출 방법을 통해 연구자와 확장 에이전트는 2시간 이내에 다른 수원에서 P. capsici 포자의 존재를 쉽게 감지할 수 있습니다. 분석은 종래의 PCR보다 더 민감하다는 것이 입증되었으며 재배자가 사용하는 관개물에서 병원균의 존재를 검출함으로써 시상에서 검증되었다. 이 검출 방법은 재배자가 관개에 사용되는 다양한 수원에서 병원균의 존재와 인구 밀도를 추정할 수 있게 하여 파괴적인 발병과 경제적 손실을 방지할 수 있습니다.

프로토콜

1. 휴대용 루프 매개 이더피 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시의 현장 감지

1. 펌프 및 필터 설정
   1. 펌프가 활성화되면 여과 플라스크의 입을 통해 공기가 당겨지도록 핸드 펌프에 연결된 튜브에 여과 플라스크를 부착합니다.
   2. Buchner 깔때기를 필터 플라스크의 입에 고무 스토퍼에 넣고 적절하게 크기의 필터 용지를 Buchner 깔때기에 넣어 공기가 필터 용지를 통해 당겨지도록 합니다. 필터 용지의 고정 크기는 15 μm이어야 합니다.
      참고: 필터 용지는 Buchner 깔때기의 가장자리에 맞아야 최소한의 물이 필터 용지 주위에 흐르도록 합니다.
2. 물 샘플링 및 필터링
   1. 대상 소스에서 물 샘플을 채취하십시오. 물은 소량의 파편을 가질 수 있지만 상당한 퇴적물이나 토양은 없을 수 있습니다.
   2. 부흐너 깔때기 내부에 배치된 필터 용지 위에 최대 1,000mL(1리터)의 테스트 워터를 붓고, 핸드 펌프(또는 진공)는 물을 통해 끌어당기는 흡입을 생성하는 데 사용되고 있다.
      참고: 이 방법을 사용하여 테스트할 수 있는 최소 물량은 없으며, 최소 50mL가 제안되지만 이 방법의 최대값은 1000mL입니다.
   3. 집게를 사용하여 Buchner 깔때기에서 필터 용지를 제거하고 멸균 가위로 작은 조각으로 자른다. 프로토콜에 필요한 추출 버퍼(자기 비드 기반 추출용 400 μL)의 양에 침수될 수 있는 만큼 의약(8-12)을 1.5mL 튜브로 추가합니다. 첫 번째 세트를 추출한 후 처리를 위해 남은 필터 용지를 저장합니다.
   4. 소용돌이 또는 그렇지 않으면 5 분 동안 10 분마다 10 초 동안 필터 용지 및 추출 버퍼 조각을 동요. 그런 다음, 집게를 사용하여, 가능한 한 추출 버퍼의 작은 잃고 필터 용지를 제거합니다. 모든 조각이 소용돌이/교반되고 추출 버퍼에 담글 때까지 나머지 필터 용지와 함께 이 단계를 반복합니다.
3. 필터 용지에서 DNA의 자기 비드 기반 추출
   1. 1.5 mL 튜브 (현재 추출 버퍼의 약 200-300 μL을 포함)에, 단백질 제 K의 20 μL과 10 ng / μL RNase의 10 μL을 추가합니다.
   2. 실온에서 15분 동안 배양하거나, 소용돌이를 치거나, 3분마다 튜브를 흔들어 주세요.
   3. 500 μL의 마그네틱 비드를 결합 버퍼와 함께 샘플에 넣고 흔들어 잘 섞습니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
   4. 모든 구슬이 자석으로 당겨질 때까지 튜브를 자기 분리기 랙에 2분 간 놓습니다. 상체를 제거하고 폐기합니다.
   5. 자기 분리기에서 튜브를 제거합니다. 워시 버퍼 1의 500 μL을 추가하고 튜브를 적극적으로 흔들어 구슬을 다시 일시 중단합니다. 30s를 기다린 다음 튜브를 자기 분리기에 다시 놓습니다. 모든 구슬이 자석쪽으로 당겨질 때까지 2분 동안 기다렸다가 상퍼를 제거하고 폐기하십시오.
      참고: 마그네틱 비즈가 분리기에게 자화되기를 기다리는 경우, 튜브의 모자와 측면에 붙어 있는 자기 구슬을 빼내고 더 많은 수의 구슬이 부착될 수 있는 튜브를 반전시키는 것이 좋습니다.
   6. 워시 버퍼 2의 500 μL로 1.3.5 단계를 반복하십시오.
   7. 80% 에탄올의 500 μL로 1.3.5단계를 반복합니다.
   8. 실온(18-27°C)에서 15분 동안 자석 비드 펠릿을 에어드라이로 드시고 뚜껑을 열어 놓습니다. 온도가 허용하지 않는 경우, 15 분 동안 열려 모자와 장갑 손에 인큐베이션.
   9. 자기 분리기에서 튜브를 제거합니다. 용출 버퍼 50 μL을 추가하고 1 분 동안 위아래로 파이프하여 구슬을 다시 일시 중단합니다.
   10. 튜브를 다시 자기 분리기에 놓습니다. DNA 저장을 위해 구슬을 별도의 튜브로 옮기지 않고 상퍼를 옮기기 전에 2 분 기다립니다.
       참고: 이동하기 전에 실험을 일시 중지할 수 있습니다. 추출된 DNA는 얼음이나 -20°C 냉동고에 저장되어야 합니다.
4. 새로 개발 된 램프 분석의 응용 프로그램
   1. 각 F3 및 B3 프라이머의 0.2 μM, 각 루프-F 및 루프-B 프라이머의 0.8 μM, 각 FIP 및 BIP 프라이머의 1.6 μM(표2)을사용하여 LAMP 프라이머 믹스를 준비합니다.
   2. 다음 LAMP 용액을 단일 PCR 튜브 또는 8 튜브 스트립의 각 개별 튜브에 추가합니다: 프라이머 믹스의 2.5 μL(단계 1.4.1), LAVA LAMP 마스터 믹스의 12.5 μL, 추출된 DNA 1μL, ddH_2O의9 μL. 총 부피는 25 μL입니다.
      참고: 컬러메트릭 염료(예: 웜스타트)가 있는 휴대용 증폭 기기(예: 지니 III)를 사용하는 경우 섹션 2.4.2- 2.4.3을 참조하십시오.
   3. 두 개의 튜브를 긍정적이고 부정적인 컨트롤로 지정합니다. 양성 제어를 위해, LAVA LAMP 키트또는 알려진 양성 DNA 샘플에서 제공하는 컨트롤을 사용하십시오. 음수 제어의 경우 ddH₂O를 사용합니다. 둘 다, 양성 대조군 또는 ddH₂O의 1 μL에 대해 추출된 DNA의 1 μL을 대체한다.
   4. 샘플을 45분 동안 64°C로 설정된 열 블록(또는 휴대용 증폭 기기)으로 설정합니다.
      참고: 다른 추출 방법은 마그네틱 비드 기반 추출 대신 여기에서 사용할 수 있습니다. CTAB 및 상용 DNA 추출 키트는 모두 표준 프로토콜을 사용하여 성공적으로 테스트되었으며 식물 샘플^24,,25에대한 필터 용지 조각을 대체하였다. 결과는 표 2에서비교되었습니다. DNA의 농도가 정량화 될 수 있는 경우, 1-10 ng 게놈 DNA 사이 사용.
5. 결과 시각화
   1. 실험실 환경에서 수행되는 경우 각 샘플의 5 μL을 1% 아가로즈 젤로 적재하고 젤 전기 전광 기계에서 실행하고 UV 이미징 기계에서 이미징하여 증폭 제품을 볼 수 있습니다.
   2. 색염료(예: Warmstart)를 사용한 경우 색상 변화를 확인하여 결과를 양수 또는 음수로 결정합니다.
   3. 휴대용 증폭 기기(예: 지니 III)를 사용한 경우 화면의 증폭 그래프를 보고 결과를 확인합니다.
6. 이전에 개발된 PCR 분석기의 적용
   참고: 기존의 PCR 분석서를 사용하는 경우 1-3단계는 동일하게 유지되며 1.4 단계 및 1.5 단계 대신 다음 단계를 적용해야 합니다.
   1. 다음 구성 요소를 포함하는 개별 튜브에 각 DNA 추출의 1 μL을 추가: 녹색 PCR 마스터 믹스의 12.5 μL, ddH₂O의 9.5 μL, 그리고 전방 및 역 프라이머의 1 μL(표 2).
   2. 마이크로센티르슈어를 사용하여 각 샘플을 회전시키고 튜브를 열 사이클러에 넣습니다.
   3. 이전 간행물에 따라 다음과 같은 열 사이클러 설정을 사용하십시오: 5분 동안 94°C, 30초 동안 94°C에서 30사이클, 54°C에서 30초, 72°C에서 10분 동안 연장, 최종 연장은 10분 동안 72°C로 한다.
   4. 1% 아가로즈 젤로 제품을 실행합니다. 긍정적 인 반응이 ~ 508 bp의 밴드 크기를 가질 UV 빛 아래 밴드의 존재를 관찰하십시오.
7. 기존의 탐지 방법
   참고: 병원균 검출을 위한 선택적 도금의 여러 방법이 있으며, 다음은 P. capsici에대한 일반적인 프로토콜이다.
   1. 먼저 건강한 가지 과일(P. capsici의경우 취약한 숙주)을 얻고 과일 표면을 70% 이소프로필 알코올로 세척하여 표면 살균을 얻습니다.
   2. 부양 장치 (폴리에틸렌 폼 또는 기타)와 우유 상자에 가지 과일을 배치하고 관개 연못에 배포합니다. 각 미끼 트랩을 한 지점으로 고정하고 트랩을 저수지(재활용 관개수)에 적어도 7일 동안 또는 과일 부패 증상이 관찰될 때까지 방치한다. 과일을 수집하고 실험실로 운반하십시오.
   3. 감염된 조직의 작은 조각을 제거하기 전에 멸균 후드에 과일을 헹구고 건조하고 25 mg / L 펜타 클로로 오니트로 벤젠, 0.0005 % 피마리신, 250 mg / L 암피실린, 10 mg / L+lmex로 개정 PARPH 매체의 접시에 배치합니다. 5 일 동안 25 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
   4. 격리 후 4일 후에 전통적인 형태학적 식별을 위한 복합 현미경으로 플레이트를 볼 수 있습니다.

2. 동물원 포어 농도의 검출 한계 결정

1. 동물원 스포어 서스펜션 만들기
   1. V8 P. capsici 한천(V8 주스 100mL, ddH_2O900mL, CaCO₃1g) 플레이트에 26°C에서 1주일 동안 배양했습니다. 여러 접시를 사용하여 더 많은 양의 동물원 스포어 서스펜션을 얻을 수 있습니다.
   2. 포자를 자극하기 위해 3 일 동안 실온에서 연속 조명 아래 플레이트를 배양하십시오.
   3. 각 접시에 ddH₂O15 mL을 추가하여 접시를 범람하고 25 분 동안 4 ° C 냉장고에 놓습니다. 그런 다음 30 분 동안 실온으로 돌아갑니다.
   4. 접시를 교반하여 동물원포지와 파이펫을 모든 플레이트에서 50mL 튜브 한 개에 넣습니다.
   5. 동물원 의 정확한 추정을 얻으려면, 발면 계에 포자 현탁액의 10 μL을 추가하고 동물원포자를 계산하고 평균 농도를 추정하기 위해 현미경으로 관찰한다.
2. 직렬 희석
   1. 포자 서스펜션 1mL, ddH₂O 9mL을 별도의 튜브에 추가합니다. 원하는 만큼 많은 10배 희석을 위해 이 단계를 반복합니다.
   2. 포자 용액은 여과 방법을 사용하여 이전 프로토콜에 기초하여 DNA 추출을 위해 제출된다.
      참고: 더 큰 양의 서스펜션이 원하는 경우, 포자 서스펜션 2mL, ddH₂O의 18mL의 볼륨을 두 배로 늘라.
3. 동물원 포어 농도 제한 감지
   1. 명확하게 긍정적 인 결과가 더 이상 관찰되지 때까지 분석법을 통해 각 직렬 희석을 개별적으로 실행하여 포자 검출 제한을 평가합니다. 최종 희석이 얻어지면 2(이 예에서 4.8 ~ 2.4)의 계수로 희석하고 분석법을 다시 실행하여 보다 정확한 검출 한계를 얻습니다.
4. LAMP 방법의 개발 및 최적화
   참고: LAMP 프라이머는 보충도 2에도시된 바와 같이 P. capsici(Li et al.^19)의1121베이스 쌍(bp) 단편을 기반으로 설계되었다.
   1. 착색염염(예를 들어 Warmstart)이 사용되는 경우 프라이머 믹스 2.5 μL, 색염료 12.5 μL, 녹색 형광염의 0.5 μL, 추출된 DNA 1μL, ddH_2O의8.5 μL 등의 솔루션을 사용한다. 총 부피는 25 μL입니다.
   2. LAVALAMP 마스터믹스와 휴대용 증폭 기기를 사용하는 경우, 제조 업체에 의해 권장되는 대로 3 분 동안 95 °C의 초기 단계를 가지고 있지만, 이것은 필요하지 않습니다. 색상 변화 또는 증폭 그래프를 관찰하기 위해 최종 어닐링 단계가 필요하지 않습니다. 상용 색염료를 사용할 경우 웜스타트 단계를 실행하지 마십시오.
   3. VIEW LAMP 분석결과 다음 방법 중 하나는 1% 아가로즈 젤에서 샘플을 실행하거나 지니 III 실시간 증폭 화면에서 육안으로 자외선 이미징 기계를 사용하여 보거나 볼 수 있습니다.
   4. 휴대용 증폭 계기기를 사용하여 램프 분석의 온도를 최적화하고 속도와 감도 의 수준을 위해 실시간 증폭 그래프를 사용하여 분석합니다. 고유한 온도가 있는 샘플을 실행하여 최고 수준의 감도로 가장 빠른 증폭을 결정합니다.
   5. 추출된 DNA의 직렬 희석(단계 2.2.1의 포자 현탁액과 마찬가지로)을 만들고 각 희석에 대해 이전에 설명된 바와 같이 반응 조건을 유지함으로써 개발된 LAMP의 검출 한계를 결정한다.
5. 기존의 PCR 방법과의 검출 제한 측정 및 비교
   1. 섹션 1.3의 단계에서 추출된 DNA를 사용하여 기존의 PCR의 검출 수준을 LAMP 분석기와 비교합니다.
   2. 전방 및 역 PCR 프라이머(표2),그린 PCR 마스터믹스의 12.5 μL, 총 25μL에 ddH₂O의 9.5 μL이 포함된 PCR 튜브에 DNA 1μL을 추가합니다.
   3. 다음 조건을 사용하여 열 사이클러에서 시료를 증폭: 5분 동안 94°C, 30초 동안 94°C에서 30사이클, 54°C에서 30초, 연장은 72°C에서 10분 동안 72°C로 연장한다.
   4. 1% 아가로즈 젤에서 전기전도 기계에서 샘플을 실행하고 UV 이미징 기계에서 볼 수 있습니다. 제외 된 밴드 크기는 508 bp였습니다.

결과

LAMP 방법의 최적화
이 연구에서는 휴대용 루프 매개 이더스말 증폭(LAMP) 분석기를 사용하여 관개물에 피토프토라 캡시의 존재를 검출했습니다. 먼저, 제안된 LAMP 분석은 상이한 LAMP 프라이머 농도를 테스트하여 최적화되었다[F3, B3 (각각 0.1-0.5 μM); LF, LB(각각 0.5-1.0 μM) 및 FIP, BIP(각각 0.8~2.4μM)], 지속시간(30~70분), 온도(55-70°C). 본 연구에서 사용된 최종 LAMP 프라이머 믹스는 각 F3 ...

토론

식물병원균에 대한 관개물의 시험은 관개 연못과 재활용 된 물^(27)을사용하는 재배자에게 중요한 단계입니다. 관개 연못은 과잉 관개물이^16,,27로존재했을 수 있는 병원균을 운반하는 연못으로 전달되기 때문에 다수의 식물병원균에 대한 저수지 및 번식지를 제공한다. 큰 수원에서 식물 병원균의 검출을 위한 전통적인 방법은 연못에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel powder	Thomas Scientific	C997J85
Buchner funnel	Southern Labware	JBF003
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Centrifuge 5430	Eppendorf	22620509
Chloroform	Fischer Scientific	C298-500
CTAB solution	Biosciences	786-565
Dneasy Extraction Kit	Qiagen	69104
Filter Flask	United	FHFL1000
Filter Paper	United Scientific Supplies	FPR009
Gel Green 10000X	Thomas Scientific	B003B68 (1/EA)
Genie III	OptiGene
Hand pump	Thomas Scientific	1163B06
Iso-amyl Alcohol	Fischer Scientific	BP1150-500
LAVA LAMP master mix	Lucigen	30086-1
Magnetic bead DNA extraction	Genesig	genesigEASY-EK
Magnetic Separator	Genesig	genesigEASY-MR
polyvinylpyrrolidone	Sigma Aldrich	PVP40-500G
Primers	Sigma Aldrich
Prism Mini Centrifuge	Labnet	C1801
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
UV Gel Doc	Analytik Jena	849-00502-2
Warmstart Colorimetric Dye	Lucigen	E1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell	Bio-Rad	1704489EDU
70% isopropanol	Fischer Scientific	A451-1