JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول النهج التقني لعزل المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية الدهنية والالتهابية الليفية من مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء داخل البطن (WAT) عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة أو فصل الخرزة المغناطيسية المناعية.

Abstract

الجزء اللحمي الوعائي (SVF) للأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) غير متجانس بشكل ملحوظ ويتكون من العديد من أنواع الخلايا التي تساهم وظيفيا في توسيع وإعادة تشكيل WAT في مرحلة البلوغ. يتمثل أحد العوائق الهائلة أمام دراسة الآثار المترتبة على عدم التجانس الخلوي هذا في عدم القدرة على عزل مجموعات فرعية متميزة وظيفيا بسهولة من WAT SVF للتحليلات في المختبر وفي الجسم الحي. حددت تقنية تسلسل الخلية الواحدة مؤخرا مجموعات فرعية متميزة وظيفيا من الخلايا الالتهابية الليفية و PDGFRβ + حول الأوعية الدموية في مستودعات WAT داخل البطن للفئران البالغة. السلف الليفي الالتهابي (يسمى "FIPs") هي خلايا منتجة للكولاجين غير دهنية المنشأ يمكنها ممارسة نمط ظاهري مؤيد للالتهابات. خلايا سلائف الخلايا الشحمية PDGFRβ + (APCs) عالية التسبب في الإدمان في المختبر وفي الجسم الحي عند زرع الخلايا. هنا ، نصف طرقا متعددة لعزل هذه المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية من مستودعات WAT داخل البطن. يمكن عزل FIPs و APCs عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) أو عن طريق الاستفادة من تقنية حبة الخرز المغناطيسي المناعي القائمة على الأجسام المضادة الحيوية. يمكن استخدام الخلايا المعزولة للتحليل الجزيئي والوظيفي. إن دراسة الخصائص الوظيفية للخلايا اللحمية الفرعية بمعزل عن غيرها ستوسع معرفتنا الحالية بإعادة تشكيل الأنسجة الدهنية في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية على المستوى الخلوي.

Introduction

تمثل الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) الموقع الرئيسي لتخزين الطاقة في الثدييات. داخل هذا النسيج ، تخزن الخلايا الشحمية ، أو "الخلايا الدهنية" ، السعرات الحرارية الزائدة في شكل دهون ثلاثية ، معبأة في قطرات دهنية كبيرة أحادية العين. علاوة على ذلك ، تفرز الخلايا الشحمية العديد من العوامل التي تنظم الجوانب المختلفة لتوازن الطاقة1،2،3. تشكل الخلايا الشحمية الجزء الأكبر من حجم WAT. ومع ذلك ، لا تمثل الخلايا الشحمية سوى أقل من 50٪ من إجمالي الخلايا الموجودة في WAT 4,5. المقصورة غير الشحمية في WAT ، أو الجزء اللحمي الوعائي (SVF) ، غير متجانسة تماما وتحتوي على خلايا بطانية وعائية وعائية ، وخلايا مناعية مقيمة في الأنسجة ، وخلايا ليفية ، ومجموعات خلايا سلائف الخلايا الشحمية (APC).

تعتبر WAT استثنائية في قدرتها الرائعة على التوسع في الحجم مع زيادة الطلب على تخزين الطاقة. يعد الحفاظ على مرونة الأنسجة أمرا ضروريا لأن التخزين الكافي للدهون في WAT يحمي من ترسب الدهون خارج الرحم الضارة في الأنسجة غير الدهنية6. الطريقة التي تخضع بها مستودعات WAT الفردية لهذا التوسع استجابة لزيادة السعرات الحرارية هي محدد حاسم لحساسية الأنسولين في إعداد السمنة7. يتميز توسع WAT المرضي ، الذي لوحظ في الأفراد الذين يعانون من السمنة المفرطة والذين يعانون من متلازمة التمثيل الغذائي ، بالتوسع التفضيلي لمستودعات WAT الحشوية على حساب الأنسجة الدهنية تحت الجلد المواتية الأيضية. علاوة على ذلك ، ترتبط مقاومة الأنسولين في السمنة بإعادة التشكيل المرضي ل WAT. يتميز هذا بالنمو الضخامي للخلايا الشحمية الموجودة (زيادة في الحجم) ، وعدم كفاية تكوين الأوعية الدموية ، والتهاب التمثيل الغذائي المزمن ، وتراكم مكونات المصفوفة خارج الخلية (التليف) ، ونقص الأكسجة في الأنسجة 8,9. ترتبط هذه الأنماط الظاهرية للسمنة WAT بالتنكس الدهني الكبدي ومقاومة الأنسولين ، على غرار ما لوحظ في حالة الحثل الشحمي (غياب وات وظيفي). في المقابل ، لوحظ توسع WAT الصحي في السكان الذين يعانون من السمنة المفرطة الأصحاء الأيضية ويتميز بالتوسع التفضيلي ل WAT الوقائي تحت الجلد وتوسيع المستودع من خلال تضخم الخلايا الشحمية10. يتم التوسط في تجنيد الخلايا الشحمية الجديدة عن طريق تمايز الخلايا الشحمية من خلايا السلائف الشحمية (APCs) (تسمى "تكوين الدهون"). يتزامن تضخم الخلايا الشحمية مع درجات أقل نسبيا من تليف WAT والتهاب التمثيل الغذائي 6,11. تؤثر العديد من أنواع الخلايا داخل البيئة الدقيقة WAT بشكل مباشر على صحة وقابلية توسع WAT في السمنة12. على هذا النحو ، يظل تحديد وظيفة أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في WAT أولوية عالية لهذا المجال.

على مدار العقد الماضي ، تم استخدام العديد من الاستراتيجيات لتحديد وعزل ناقلات الجنود المدرعة الأصلية عن الإنسان والفأر WAT SVF13. تعزل هذه الاستراتيجيات APCs بناء على تعبير سطح الخلية لعلامات الخلايا الجذعية / السلفية الشائعة باستخدام تقنيات فصل الخلايا القائمة على الأجسام المضادة. تشمل هذه الأساليب فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور ، أو فصل الحبيبات المغناطيسية المناعية (أي الأجسام المضادة المعدلة كيميائيا). تشمل بروتينات سطح الخلية المستهدفة لعزل APCs PDGFRα و PDGFRβ و CD34 و SCA-1. وقد ساعدت هذه النهج على إثراء هذه النظم؛ ومع ذلك ، فإن مجموعات الخلايا المعزولة بناء على هذه العلامات غير متجانسة تماما. سلطت الدراسات الحديثة جدا لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الضوء على عدم التجانس الجزيئي والوظيفي للخلايا اللحمية داخل الجزء اللحمي الوعائي المعزول (SVF) من الفئران WAT14،15،16،17. من خلال تحليلاتنا الوظيفية وتحليلاتنا الوظيفية ، حددنا وميزنا مجموعات فرعية من الخلايا حول الأوعية الدموية المتميزة وظيفيا والمعدلة للدهون PDGFRβ + في المقصورة اللحمية ل WAT داخل البطن في الفئرانالبالغة 15. تمثل السلائف الالتهابية الليفية ، أو FIPs ، مجموعة فرعية بارزة من خلايا PDGFRβ + ويمكن عزلها بناء على تعبير LY6C (خلايا LY6C + PDGFRβ +) 15. تفتقر FIPs إلى القدرة المحفزة للدهون ، وتمارس استجابة قوية مؤيدة للالتهابات لمختلف المحفزات ، وتنتج الكولاجين ، وتفرز العوامل المضادة للدهون15. يزداد النشاط المؤيد للالتهابات والليفي لهذه الخلايا بالاقتران مع السمنة لدى الفئران ، مما يورط هذه الخلايا كمنظمات لإعادة تشكيل WAT. تمثل المجموعة الفرعية LY6C- CD9- PDGFRβ + خلايا سلائف الخلايا الشحمية (APCs). يتم إثراء هذه APCs في التعبير عن Pparg والجينات الأخرى المؤيدة للدهون ، وتتمايز بسهولة إلى خلايا دهنية ناضجة في المختبر وفي الجسم الحي15. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل مجموعات الخلايا المتميزة هذه من مستودعات WAT داخل البطن للفئران البالغة باستخدام FACS ، وفصل الحبيبات المغناطيسية المناعية بالأجسام المضادة للبيوتينيل. يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل المجموعات الفرعية السلفية الدهنية المتميزة وظيفيا من مستودعات WAT المتعددة داخل البطن للفئران الذكور والإناثالبالغة 15. قد تساهم دراسة مجموعات الخلايا المتميزة وظيفيا هذه في عزلة بشكل كبير في فهمنا الحالي للآليات الجزيئية التي تنظم تكوين الدهون وإعادة تشكيل الأنسجة الدهنية داخل البطن في الصحة والمرض.

يفصل البروتوكول أدناه عزل الأسلاف الدهنية من الفئران البربخية WAT. ومع ذلك ، يمكن استخدام نفس الإجراء لعزل الخلايا المقابلة من مستودعات WAT المساريقية وخلف الصفاق لكل من الفئران الذكور والإناث15. يمكن العثور على بروتوكول مفصل حول كيفية تحديد وعزل هذه المستودعات في الفئران في Bagchi et al.18. تم تحسين هذا البروتوكول لاستخدام الفئران 6-8 أسابيع من العمر. وقد ينخفض تواتر وقدرة ناقلات الجنود المدرعة وقدرتها على التمايز بالاقتران مع الشيخوخة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات والإجراءات الحيوانية من قبل لجنة استخدام ورعاية المؤسسية التابعة للمركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس.

1. عزل الكسر الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية البيضاء للغدد التناسلية

  1. تشريح الأنسجة الدهنية البيضاء الغدد التناسلية من الفئران البالغة من العمر 6-8 أسابيع ووضع منصات الدهون في محلول 1x PBS.
  2. اجمع ما يصل إلى 4 مستودعات للدهون (يوصى باستخدام 2-4 مستودعات من 1-2 فئران) وفرم الأنسجة في دورق سعة 10 مل يحتوي على 200 ميكرولتر من محلول الهضم (1x HBSS و 1.5٪ BSA و 1 مجم / مل كولاجيناز D).
  3. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من محلول الهضم.
  4. احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 1 ساعة أثناء الرج.
  5. قم بتصفية الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر لإزالة الأنسجة غير المهضومة.
  6. تمييع العينة المفلترة إلى 30 مل مع PBS يحتوي على 2٪ FBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح طاف ، الذي يحتوي على الخلايا الشحمية الناضجة.
  7. انتقل فورا إلى طريقة عزل الخلايا المفضلة.

2. عزل ناقلات الجنود المدرعة وFIPs باستخدام FACS

  1. قم بإذابة الحبيبات في 1 مل من 1x RBC lysis buffer عن طريق هز الأنبوب برفق.
  2. احتضان في RT لمدة 1-2 دقيقة.
  3. أضف 10 مل من 2٪ FBS / PBS وقم بالمرور عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 مل.
  4. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. نضح الوسائط وأعد تعليق الحبيبات في 400-800 ميكرولتر من 2٪ FBS / PBS تحتوي على كتلة Fc (1: 200).
  6. احتضان على حرارة 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  7. نقل 400 μL-800 μL من معلقات الخلايا التي تحتوي على ≤106 خلايا لكل مل إلى أنابيب 1.5 مل وإضافة الأجسام المضادة. يتم سرد تركيزات الأجسام المضادة في قسم جدول المواد .
    1. قم بإعداد أنابيب تحكم منفصلة ل 1) الخلايا غير الملوثة ، 2) عناصر التحكم أحادية اللون ، و 3) ضوابط FMO (مضان ناقص واحد).
    2. تلطيخ العينات بالأجسام المضادة PDGFRβ و CD45 و CD31 و CD9 و LY6C.
  8. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
  9. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. نضح الوسائط وإعادة تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من 2٪ FBS / PBS.
  11. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  12. نضح الوسائط وإعادة تعليق الخلايا في 400-800 ميكرولتر من 2٪ FBS / PBS. ثم قم بالمرور عبر أغطية مرشح 40 ميكرومتر إلى أنابيب مستديرة القاع من البوليسترين سعة 5 مل ل FACS.
  13. اتبع الخطوات التالية للبوابة.
    1. استخدم عناصر تحكم غير ملوثة وأحادية اللون للتعويض.
    2. استخدم عناصر تحكم FMO لتعيين البوابات التجريبية.
    3. استخدم استراتيجية البوابات الموضحة في الشكل 1 للحصول على ناقلات الجنود المدرعة و FIPs. بوابة ناقلات الجنود المدرعة مثل خلايا CD45- CD31- PDGFRβ + LY6C- CD9- و FIPs مثل خلايا CD45- CD31- PDGFRβ + LY6C + .
  14. جمع الخلايا المصنفة في أنابيب تحتوي على 500 ميكرولتر من مصل 100٪ والحفاظ على الخلايا على الجليد.
  15. خلايا الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف 2٪ FBS / PBS لغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي مرة أخرى عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الطافية استخدام الخلايا المحببة.
  16. إعادة تعليق الخلايا المحببة في الحجم المناسب من وسائط زراعة APC للغدد التناسلية (لزراعة الخلايا) أو المخزن المؤقت المناسب للتحليل اللاحق.

3. الفصل المناعي المغنطيسي للكسور الدهنية وغير المشبعة بالدهون

  1. اعزل SVF من الأنسجة الدهنية البيضاء للغدد التناسلية باتباع الخطوات 1.1-1.7.
  2. نضح المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات SVF في 10 مل من 1x MS Buffer المتاح تجاريا.
  3. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  4. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا المحببة في 100 ميكرولتر من 1x MS Buffer.
  6. قم بإجراء استنفاد خلايا CD31 + و CD45 + كما هو موضح أدناه (الشكل 2A ، الخطوة 1). يتم ذلك لإزالة خلايا النسب البطانية والمكونة للدم.
    1. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا واضبط التركيز على ≤ 1 × 108 خلايا / مل.
    2. أضف الأجسام المضادة CD31 و CD45 المترافقة بالبيوتين إلى تعليق الخلية ، كل منها بتركيز ≤ 0.25 ميكروغرام لكل 106 خلايا واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    3. اغسل الخلايا بإضافة 4 مل من 1x MS Buffer.
    4. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1x MS.
    6. أضف 10 ميكرولتر من حبيبات الستربتافيدين النانوية واحتضان الخلايا على الثلج لمدة 15 دقيقة.
    7. اغسل الخلايا بإضافة 4 مل من 1x MS buffer.
    8. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم نضح المادة الطافية.
    9. أعد تعليق الخلايا في 2.5 مل من المخزن المؤقت 1x MS ونقلها إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 5 مل.
    10. ضع الأنبوب في رف المغناطيس لمدة 5 دقائق.
    11. اجمع الخلايا غير المصنفة عن طريق صب تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 15 مل.
      ملاحظة: تجنب هز أو تنشيف القطرات المعلقة لأن هذا يؤدي إلى التلوث من جزء الخلية غير المرغوب فيه.
    12. أخرج الأنبوب من المغناطيس وكرر الخطوات 3.6.9. إلى 3.6.11. مرتين أخريين لما مجموعه 3 غسلات.
  7. فصل الكسور الدهنية وغير الدهنية (الشكل 2 أ ، الخطوة 2)
    1. استمر في العمل مع الكسر غير المسمى (أي CD45- CD31- الكسر).
    2. جهاز طرد مركزي أنبوب سعة 15 مل يحتوي على خلايا غير موسومة عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1x MS.
    4. أضف الأجسام المضادة LY6C و CD9 المترافقة بالبيوتين ، على التوالي ، بتركيز ≤ 0.25 ميكروغرام لكل 106 خلايا واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    5. اتبع الخطوات 3.6.3. إلى 3.6.12. لإكمال الفصل الثاني.
    6. اجمع الكسور غير المنضمة. تمثل الخلايا غير المسماة (LY6C- CD9-) جزءا دهنيا يحتوي على APCs (الشكل 2A ، الخطوة 3).
    7. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، وأعد تعليق الخلايا المرتبطة وإزالتها في 1x MS buffer. Eluates أو الكسر المسمى (LY6C + CD9+) ، يمثل جزءا غير مسبب للدهون يحتوي على FIPs (الشكل 2A ، الخطوة 3).
    8. أجهزة الطرد المركزي المصنفة وغير المصنفة كسور عند 600 × جم لمدة 5 دقائق إلى خلايا الحبيبات عند 4 درجات مئوية.
  8. انتقل فورا إلى زراعة الخلايا (الخطوة 6) أو استخدم السلائف غير المتمايزة للتحليلات المفضلة (الخطوة 4 و / أو الخطوة 5).

4. تقييم نقاء الكسور الدهنية وغير الدهنية عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. إعادة تعليق كسور الخلايا المعزولة بالخرز في 200-400 ميكرولتر من 2٪ FBS / PBS تحتوي على كتلة Fc (1: 200).
  2. احتضان على حرارة 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. انقل معلق الخلية إلى أنابيب سعة 1.5 مل وأضف أجساما مضادة. يتم سرد تركيزات الأجسام المضادة في جدول المواد.
    1. قم بإعداد أنابيب تحكم منفصلة ل 1) الخلايا غير الملوثة ، 2) عناصر التحكم أحادية اللون ، و 3) عناصر التحكم في FMO.
    2. أضف إلى العينات الأجسام المضادة CD45 و CD31 و CD9 و LY6C.
  4. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
  5. أجهزة الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. نضح طاف وإعادة تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من 2٪ FBS / PBS.
  7. جهاز طرد مركزي التعليق عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. نضح الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 400-800 ميكرولتر من 2٪ FBS / PBS. قم بالتصفية من خلال أغطية مرشح 40 ميكرومتر في أنابيب مستديرة القاع من البوليسترين سعة 5 مل للتحليل بواسطة قياس التدفق الخلوي.
  9. تحليل التدفق الخلوي لتقييم النقاء
    1. استخدم عناصر تحكم غير ملوثة وأحادية اللون للتعويض.
    2. استخدم عناصر تحكم FMO لتعيين البوابات التجريبية.
    3. استخدم استراتيجية البوابات للخلايا الحية والمفردة كما هو موضح في الشكل 2 ب.
    4. قم بإجراء البوابات كما هو موضح في الشكل 2B ل CD45 و CD31 و LY6C و CD9.
    5. استخدم برنامج قياس التدفق الخلوي لتقييم ترددات خلايا CD45- CD31- LY6C- CD9- (APCs) وخلايا CD45- CD31- LY6C + (FIPs) داخل الكسور المعزولة.

5. تحليل التعبير الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتقييم نقاء FIPs و APCs

  1. استخراج mRNA من الخلايا المعزولة مغناطيسيا أو FACS باستخدام مجموعة الاستخراج المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  2. استخدم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتخليق cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي cDNA (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  3. تحديد مستويات mRNA النسبية للجينات الانتقائية APC و FIPs (الجدول 1) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام مزيج SYBR الأخضر PCR.
    1. قم بإعداد تفاعل العينة لتفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: 5 ميكرولتر من صبغة خضراء 2x SYBR ، 1 ميكرولتر من cDNA (~ 50 نانوغرام / ميكرولتر) ، 0.5 ميكرولتر من كل برايمر أمامي وخلفي (10 ميكرومتر) و 3 ميكرولتر من الماء.
    2. استخدم شروط PCR القياسية التالية لتشغيل PCR الكمي: مرحلة الانتظار: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ مرحلة PCR (40 دورة): 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  4. تطبيع القيم لمستويات جين التدبير المنزلي (Rps18) عن طريق حساب ΔΔ-Ct.
  5. لتقييم الدلالة الإحصائية ، قم بإجراء اختبار t للطالب غير المزاوج.

6. زراعة الخلايا والتمايز

  1. خلايا معزولة مغناطيسيا أو FACS لأجهزة الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسائط زراعة الغدد التناسلية APC ولوحة 40K خلية / بئر من كل كسر في لوحة استزراع 48 بئر.
  3. استبدل الوسائط كل 1-2 أيام. ستبدأ APCs في الخضوع للتمايز إلى الخلايا الشحمية عند اقترابها من نقطة التقاء. FIPs التي يتم الاحتفاظ بها في نفس الوسائط مقاومة للخضوع لتكوين الدهون.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يصف هذا البروتوكول استراتيجيتين تسمحان بعزل مجموعات الخلايا اللحمية المتميزة من مستودعات WAT داخل البطن للفئران البالغة. يمكن عزل APCs و FIPs بواسطة FACS (الشكل 1) أو فصل الحبيبات المغناطيسية المناعية بالأجسام المضادة البيوتينيلية (الشكل 2). يستخدم كلا النهجين الك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

سلالة C57BL / 6 من الفئران هي سلالة الفئران الأكثر استخداما في دراسات السمنة التي يسببها النظام الغذائي. تكتسب الفئران C57BL / 6 الوزن بسرعة عند وضعها على نظام غذائي غني بالدهون (HFD) وتطور بعض السمات البارزة لمتلازمة التمثيل الغذائي المرتبطة بالسمنة (على سبيل المثال ، مقاومة الأنسولين وفرط شحميات...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

T.A.P. هو موظف ومساهم في نوفو نورديسك A / S

Acknowledgements

يعرب المؤلفون عن امتنانهم لليزا هانسن وكيرستن فيسترجارد للمساعدة الفنية الممتازة ، و P. Scherer و N. Joffin و C. Crewe على القراءة النقدية للمخطوطة. يشكر المؤلفون UTSW Flow Cytometry Core على التوجيه والمساعدة الممتازين في تطوير البروتوكولات الموضحة هنا. يتم دعم R.K.G. من قبل NIH NIDDK R01 DK104789 و NIDDK RC2 DK118620 و NIDDK R01 DK119163. JP برعاية جائزة ما قبل الدكتوراه من صندوق الابتكار الدنماركي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainersFisher Scientific352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS)Fisher Scientific21040CV
5ml polypropylene tubesFisher Scientific352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSSSigmaH8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)Roche11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.)Fisher ScientificBP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)BioLegend480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)BioLegend480019
100 µL MojoSort Streptavidin NanobeadsBioLegend480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis BuffereBioscience00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)eBioscience553141
Antibodies
Biotin CD45BioLegend103103Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: 30-F11
Biotin CD31BioLegend102503Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MEC13.3
Biotin CD9BioLegend124803Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MZ3
Biotin LY6CBioLegend128003Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5BioLegend102419Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5BioLegend103131Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PEBioLegend136006Concentration: Dilution 1:50
Species: Mouse
Clone: APB5
LY6C-APCBioLegend128016Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD9-FITCBioLegend124808Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucoseCorning10-014-CV
192 mL MCDB201SigmaM6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024Sigma12303C
5 mL 100% ITS premixBD Bioscience354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphateSigmaA8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basicR&D systems3139-FB-025/CF
5 mL Pen/StrepCorning30-001-CI
500 µL GentamycinGibco15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.

References

  1. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  4. Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
  5. Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
  6. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  7. Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
  8. Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324(2009).
  9. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  10. Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
  11. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  12. Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30(2016).
  13. Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
  14. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
  15. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636(2018).
  16. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501(2019).
  17. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
  18. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).
  19. Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
  20. Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
  21. Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
  22. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  23. Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861(2018).
  24. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  25. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  26. Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
  27. Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890(2018).
  28. Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
  29. Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162 SVF PDGFR FIPs APCs FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved