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Resumen

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Resumen

La fracción estromal-vascular (FSV) del tejido adiposo blanco (WAT) es notablemente heterogénea y consta de numerosos tipos de células que contribuyen funcionalmente a la expansión y remodelación de la WAT en la edad adulta. Un obstáculo tremendo para el estudio de las implicaciones de esta heterogeneidad celular es la incapacidad de aislar fácilmente subpoblaciones celulares funcionalmente distintas de WAT SVF para análisis in vitro e in vivo. La tecnología de secuenciación de células individuales ha identificado recientemente subpoblaciones de células perivasculares PDGFRβ+ fibroinflamatorias y adipogénicas funcionalmente distintas en depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos. Los progenitores fibroinflamatorios (denominados "FIP") son células productoras de colágeno no adipogénicas que pueden ejercer un fenotipo proinflamatorio. Las células precursoras de adipocitos (APC) PDGFRβ+ son altamente adipogénicas tanto in vitro como in vivo tras el trasplante de células. Aquí, describimos múltiples métodos para el aislamiento de estas subpoblaciones de células estromales de depósitos de WAT intraabdominales murinos. Las FIP y las APC pueden aislarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o aprovechando la tecnología de perlas inmunomagnéticas basadas en anticuerpos biotinilados. Las células aisladas se pueden utilizar para el análisis molecular y funcional. El estudio de las propiedades funcionales de la subpoblación de células estromales de forma aislada ampliará nuestro conocimiento actual de la remodelación del tejido adiposo en condiciones fisiológicas o patológicas a nivel celular.

Introducción

El tejido adiposo blanco (WAT) representa el principal sitio para el almacenamiento de energía en los mamíferos. Dentro de este tejido, los adipocitos, o "células grasas", almacenan el exceso de calorías en forma de triglicéridos, empaquetados en grandes gotas lipídicas uniloculares. Además, los adipocitos segregan multitud de factores que regulan diversos aspectos de la homeostasis energética 1,2,3. Los adipocitos constituyen la mayor parte del volumen de WAT; sin embargo, los adipocitos solo representan menos del 50% del total de células encontradas en WAT 4,5. El compartimento no adipocitario de WAT, o fracción estromal-vascular (SVF), es bastante heterogéneo y contiene células endoteliales vasculares, células inmunitarias residentes en tejidos, fibroblastos y poblaciones de células precursoras de adipocitos (APC).

WAT es excepcional por su notable capacidad de expansión de tamaño a medida que aumenta la demanda de almacenamiento de energía. El mantenimiento de esta plasticidad tisular es esencial, ya que el almacenamiento adecuado de lípidos en WAT protege contra la deposición ectópica deletérea de lípidos en tejidos no adiposos6. La forma en que los depósitos individuales de WAT experimentan esta expansión en respuesta al exceso calórico es un determinante crítico de la sensibilidad a la insulina en el contexto de la obesidad7. La expansión patológica de WAT, observada en individuos obesos con síndrome metabólico, se caracteriza por una expansión preferencial de los depósitos viscerales de WAT a expensas del tejido graso subcutáneo metabólicamente favorable. Además, la resistencia a la insulina en la obesidad se asocia con la remodelación patológica de la WAT. Se caracteriza por crecimiento hipertrófico de los adipocitos existentes (aumento de tamaño), angiogénesis inadecuada, inflamación metabólica crónica, acumulación de componentes de la matriz extracelular (fibrosis) e hipoxia tisular 8,9. Estos fenotipos WAT de obesidad se asocian con esteatosis hepática y resistencia a la insulina, similar a lo que se observa en la condición de lipodistrofia (ausencia de WAT funcional). Por el contrario, la expansión saludable de la WAT se observa en la población obesa metabólicamente sana y se caracteriza por la expansión preferencial de la WAT subcutánea protectora y la expansión del depósito a través de la hiperplasia de los adipocitos10. El reclutamiento de nuevos adipocitos está mediado por la diferenciación de novo de los adipocitos a partir de las células precursoras de los adipocitos (APC) (denominada "adipogénesis"). La hiperplasia de los adipocitos coincide con grados relativamente más bajos de fibrosis WAT e inflamación metabólica 6,11. Una multitud de tipos de células dentro del microambiente WAT influyen directamente en la salud y la capacidad de expansión de WAT en la obesidad12. Como tal, la definición de la función de los diversos tipos de células presentes en WAT sigue siendo una alta prioridad para el campo.

Durante la última década, se han empleado varias estrategias para definir y aislar APC nativas de WAT SVF13 humano y de ratón. Estas estrategias aíslan las APC en función de la expresión en la superficie celular de marcadores comunes de células madre/progenitoras mesenquimales mediante técnicas de separación celular basadas en anticuerpos. Estos enfoques incluyen la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), el uso de anticuerpos marcados con fluoróforos o la separación inmunomagnética de perlas (es decir, anticuerpos modificados químicamente). Las proteínas de la superficie celular dirigidas para el aislamiento de APC incluyen PDGFRα, PDGFRβ, CD34 y SCA-1. Estos enfoques han ayudado a enriquecer a las APC; Sin embargo, las poblaciones celulares aisladas en base a estos marcadores son bastante heterogéneas. Estudios muy recientes de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) han puesto de manifiesto la heterogeneidad molecular y funcional de las células estromales dentro de la fracción estromal-vascular aislada (SVF) de WAT murino 14,15,16,17. A partir de nuestros propios análisis funcionales y de scRNA-seq, hemos identificado y caracterizado subpoblaciones de células perivasculares PDGFRβ+ adipogénicas inmunomoduladoras y adipogénicas funcionalmente distintas en el compartimento estromal del WAT intraabdominal en ratones adultos15. Los precursores fibroinflamatorios, o FIP, representan una subpoblación prominente de células PDGFRβ+ y pueden aislarse en función de la expresión de LY6C (células LY6C+ PDGFRβ+)15. Los FIP carecen de capacidad adipogénica, ejercen una fuerte respuesta proinflamatoria a diversos estímulos, producen colágeno y secretan factores antiadipogénicos15. La actividad proinflamatoria y fibrogénica de estas células aumenta en asociación con la obesidad en ratones, implicando a estas células como reguladoras de la remodelación de WAT. La subpoblación LY6C-CD9-PDGFRβ+ representa células precursoras de adipocitos (APC). Estas APCs están enriquecidas en la expresión de Pparg y otros genes pro-adipogénicos, y se diferencian fácilmente en adipocitos maduros in vitro e in vivo15. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de estas distintas poblaciones celulares de depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos utilizando FACS, y la separación inmunomagnética de perlas con anticuerpos biotinilados. Este protocolo se puede utilizar para aislar subpoblaciones progenitoras adiposas funcionalmente distintas de múltiples depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos machos y hembras15. El estudio de estas poblaciones celulares funcionalmente distintas de forma aislada puede contribuir en gran medida a nuestra comprensión actual de los mecanismos moleculares que regulan la adipogénesis y la remodelación del tejido adiposo intraabdominal en la salud y la enfermedad.

El protocolo a continuación detalla el aislamiento de los progenitores adiposos del WAT del epidídimo murino; sin embargo, el mismo procedimiento puede utilizarse para aislar las células correspondientes de los depósitos de WAT mesentérico y retroperitoneal de ratones machos y hembras15. Un protocolo detallado sobre cómo identificar y aislar estos depósitos en ratones se puede encontrar en Bagchi et al.18. Este protocolo ha sido optimizado para el uso de ratones de 6-8 semanas de edad. La frecuencia y la capacidad de diferenciación de las APC pueden disminuir en asociación con el envejecimiento.

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Protocolo

Todos los protocolos y procedimientos para animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas.

1. Aislamiento de la fracción vascular estromal (FSV) a partir de tejido adiposo blanco gonadal

  1. Diseccione el tejido adiposo blanco gonadal de ratones de 6 a 8 semanas de edad y coloque almohadillas de grasa en 1 solución de PBS.
  2. Combine hasta 4 depósitos de grasa (se recomiendan 2-4 depósitos de 1-2 ratones) y pique el tejido en un vaso de precipitados de 10 ml que contenga 200 μl de tampón de digestión (1x HBSS, 1,5% BSA y 1 mg/mL de colagenasa D).
  3. Transfiera el tejido picado a un tubo de centrífuga de 50 mL que contenga 10 mL de tampón de digestión.
  4. Incubar la mezcla a 37 °C en un baño de agua durante 1 h mientras se agita.
  5. Filtre el tejido digerido a través de un colador de células de 100 μm para eliminar el tejido no digerido.
  6. Diluir la muestra filtrada a 30 mL con PBS que contenga un 2% de FBS y centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire el sobrenadante, que contiene adipocitos maduros.
  7. Proceda inmediatamente al método de aislamiento celular preferido.

2. Aislamiento de APC y FIP mediante FACS

  1. Disuelva el gránulo en 1 ml de 1x tampón de lisis RBC agitando suavemente el tubo.
  2. Incubar en RT durante 1-2 min.
  3. Agregue 10 mL de FBS/PBS al 2% y pase a través de un filtro de células de 40 μm a un tubo de centrífuga limpio de 50 mL.
  4. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet en 400-800 μL de bloque FBS/PBS al 2% que contenga Fc (1:200).
  6. Incubar a 4 °C durante 10 min.
  7. Transfiera 400 μL-800 μL de suspensiones celulares que contengan ≤106 células por ml a tubos de 1,5 ml y agregue anticuerpos. Las concentraciones de anticuerpos se enumeran en la sección Tabla de materiales .
    1. Prepare tubos de control separados para 1) células sin teñir, 2) controles de un solo color y 3) controles FMO (fluorescencia menos uno).
    2. Teñir las muestras con anticuerpos PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.
  8. Incubar a 4 °C durante 15 min protegido de la luz.
  9. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
  10. Aspire los medios y resuspenda las células en 400 μL de FBS/PBS al 2%.
  11. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
  12. Aspire los medios y resuspenda las células en 400-800 μL de 2% de FBS/PBS. A continuación, pase a través de tapas de filtro de 40 μm a tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml para FACS.
  13. Siga los siguientes pasos para la compuerta.
    1. Utilice controles sin manchar y de un solo color para compensar.
    2. Utilice los controles FMO para establecer puertas experimentales.
    3. Utilice la estrategia de compuerta que se muestra en la Figura 1 para obtener APC y FIP. Gate APCs como células CD45- CD31- PDGFRβ+ , LY6C- CD9- y FIPs como células CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ .
  14. Recoja las células clasificadas en tubos que contengan 500 μL de suero al 100% y mantenga las células en hielo.
  15. Centrifugar las celdas a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Añadir un 2% de FBS/PBS para lavar las células centrifugando de nuevo a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y use las células peletizadas.
  16. Vuelva a suspender las células peletizadas en el volumen adecuado de medio de cultivo APC gonadal (para cultivo celular) o tampón adecuado para el análisis posterior.

3. Separación inmunomagnética de fracciones adipogénicas y no adipogénicas

  1. Aísle la SVF del tejido adiposo blanco gonadal siguiendo los pasos 1.1-1.7.
  2. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet SVF en 10 mL de 1x MS Buffer disponible en el mercado.
  3. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm.
  4. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células peletizadas en 100 μL de 1x MS Buffer.
  6. Realice la depleción de células CD31+ y CD45+ como se explica a continuación (Figura 2A, Paso 1). Esto se hace para eliminar las células endoteliales y del linaje hematopoyético.
    1. Cuente las células con un contador de células y ajuste la concentración a ≤ 1 x 108 células/mL.
    2. Añadir los anticuerpos CD31 y CD45 conjugados con biotina a la suspensión celular, cada uno a una concentración de ≤ 0,25 μg por 106 células e incubar en hielo durante 15 min.
    3. Lave las células añadiendo 4 mL de 1x MS Buffer.
    4. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 100 μL de tampón MS 1x.
    6. Añadir 10 μL de nanoperlas de estreptavidina e incubar las células en hielo durante 15 min.
    7. Lave las células añadiendo 4 mL de tampón MS 1x.
    8. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C y, a continuación, aspirar el sobrenadante.
    9. Vuelva a suspender las células en 2,5 mL de tampón MS 1x y transfiéralas a un tubo de polipropileno de 5 mL.
    10. Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 5 minutos.
    11. Recoja las células sin etiquetar vertiendo la suspensión celular en un tubo de centrífuga limpio de 15 ml.
      NOTA: Evite sacudir o secar las gotas colgantes, ya que esto conduce a la contaminación de la fracción celular no deseada.
    12. Retire el tubo del imán y repita los pasos 3.6.9. al 3.6.11. dos veces más para un total de 3 lavados.
  7. Separación de fracciones adipogénicas y no adipogénicas (Figura 2A, Paso 2)
    1. Continúe trabajando con fracción no etiquetada (es decir, fracción CD45--CD31-).
    2. Centrifugar el tubo de 15 ml que contiene células sin etiquetar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 μL de tampón MS 1x.
    4. Añadir anticuerpos LY6C y CD9 conjugados con biotina, respectivamente, a una concentración de ≤ 0,25 μg por 106 células e incubar en hielo durante 15 min.
    5. Siga los pasos 3.6.3. al punto 3.6.12. para completar la segunda separación.
    6. Recoge fracciones sin consolidar. Las células no marcadas (LY6C-CD9-) representan la fracción adipogénica que contiene APC (Figura 2A, Paso 3).
    7. Retire el tubo del imán, vuelva a suspender y eluya las células unidas en 1x tampón MS. Eluidos o fracción marcada (LY6C+ CD9+), representa la fracción no adipogénica que contiene FIP (Figura 2A, Paso 3).
    8. Centrifugar fracciones marcadas y no marcadas a 600 x g durante 5 min para pellets de celdas a 4 °C.
  8. Proceda inmediatamente al cultivo celular (paso 6) o utilice precursores indiferenciados para los análisis preferidos (paso 4 y/o paso 5).

4. Evaluar la pureza de las fracciones adipogénicas y no adipogénicas mediante citometría de flujo

  1. Resuspender fracciones celulares aisladas en perlas en 200-400 μL de bloque Fc que contenga FBS/PBS al 2% (1:200).
  2. Incubar a 4 °C durante 10 min.
  3. Transfiera la suspensión celular a tubos de 1,5 ml y agregue anticuerpos. Las concentraciones de anticuerpos se enumeran en la Tabla de Materiales.
    1. Prepare tubos de control separados para 1) células sin teñir, 2) controles de un solo color y 3) controles FMO.
    2. A las muestras, agregue los anticuerpos CD45, CD31, CD9 y LY6C.
  4. Incubar a 4 °C durante 15 min protegido de la luz.
  5. Centrifugar a 600 x g durante 5 minutos a 4 °C.
  6. Aspirar sobrenadante y resuspender las células en 400 μL de 2% de FBS/PBS.
  7. Centrifugar la suspensión a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
  8. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 400-800 μL de 2% de FBS/PBS. Filtre a través de tapas de filtro de 40 μm en tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml para su análisis por citometría de flujo.
  9. Análisis de citometría de flujo para evaluar la pureza
    1. Utilice controles sin manchar y de un solo color para compensar.
    2. Utilice los controles FMO para establecer puertas experimentales.
    3. Utilice la estrategia de compuerta para celdas vivas y individuales como se muestra en la Figura 2B.
    4. Realice la compuerta como se muestra en la Figura 2B para CD45, CD31, LY6C y CD9.
    5. Utilice el software de citometría de flujo para evaluar las frecuencias de las células CD45- CD31- LY6C- CD9- (APC) y las células CD45- CD31- LY6C+ (FIP) dentro de fracciones aisladas.

5. Análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa para evaluar la pureza de FIP y APC

  1. Extraiga el ARNm de células aisladas magnéticamente o FACS utilizando el kit de extracción disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
  2. Utilice 1 μg de ARN para sintetizar ADNc utilizando un kit de transcriptasa inversa de ADNc (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Determine los niveles relativos de ARNm de los genes selectivos de APC y FIP (Tabla 1) mediante PCR cuantitativa utilizando la mezcla maestra de PCR verde SYBR.
    1. Configure la reacción de la muestra para PCR de la siguiente manera: 5 μL de 2x colorante verde SYBR, 1 μL de ADNc (~50 ng/μL), 0,5 μL de cada cebador directo e inverso (10 μM) y 3 μL de agua.
    2. Utilice las siguientes condiciones estándar de PCR para la ejecución cuantitativa de PCR: etapa de retención: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min; Etapa PCR (40 ciclos): 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min.
  4. Normalice los valores a los niveles del gen de mantenimiento (Rps18) mediante el cálculo de ΔΔ-Ct.
  5. Para evaluar la significación estadística, realice la prueba t de Student no emparejada.

6. Cultivo celular y diferenciación

  1. Centrifugar celdas aisladas magnéticamente o FACS a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
  2. Vuelva a suspender el pellet en 500 μL de medio de cultivo APC gonadal y coloque 40K células/pocillo de cada fracción en una placa de cultivo de 48 pocillos.
  3. Reemplace los medios cada 1-2 días. Las APC comenzarán a diferenciarse en adipocitos a medida que se acerquen a la confluencia. Los FIP mantenidos en el mismo medio son resistentes a la adipogénesis.

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Resultados

Este protocolo describe dos estrategias que permiten el aislamiento de distintas poblaciones de células estromales de depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos. Las APC y FIP pueden aislarse mediante FACS (Figura 1) o separación inmunomagnética de perlas con anticuerpos biotinilados (Figura 2). Ambos enfoques utilizan reactivos y anticuerpos que están disponibles comercialmente. La separación inmunomagnética de perlas conduce a la separación d...

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Discusión

La cepa de ratones C57BL/6 es la cepa de ratón más utilizada en los estudios de obesidad inducida por la dieta. Los ratones C57BL/6 aumentan rápidamente de peso cuando se les administra una dieta alta en grasas (HFD) y desarrollan algunas de las características prominentes del síndrome metabólico asociado con la obesidad (por ejemplo, resistencia a la insulina e hiperlipidemia). En particular, la expansión de WAT que ocurre en asociación con la alimentación con dieta alta en grasas (HFD) ocurre de manera especí...

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Divulgaciones

T.A.P. es empleado y accionista de Novo Nordisk A/S

Agradecimientos

Los autores agradecen a Lisa Hansen y Kirsten Vestergaard por su excelente asistencia técnica, y a P. Scherer, N. Joffin y C. Crewe por la lectura crítica del manuscrito. Los autores agradecen al UTSW Flow Cytometry Core por su excelente orientación y asistencia en el desarrollo de los protocolos descritos aquí. R.K.G. es compatible con NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 y NIDDK R01 DK119163. J.P. está patrocinado por un premio predoctoral del Fondo de Innovación de Dinamarca.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainersFisher Scientific352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS)Fisher Scientific21040CV
5ml polypropylene tubesFisher Scientific352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSSSigmaH8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)Roche11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.)Fisher ScientificBP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)BioLegend480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)BioLegend480019
100 µL MojoSort Streptavidin NanobeadsBioLegend480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis BuffereBioscience00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)eBioscience553141
Antibodies
Biotin CD45BioLegend103103Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: 30-F11
Biotin CD31BioLegend102503Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MEC13.3
Biotin CD9BioLegend124803Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MZ3
Biotin LY6CBioLegend128003Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5BioLegend102419Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5BioLegend103131Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PEBioLegend136006Concentration: Dilution 1:50
Species: Mouse
Clone: APB5
LY6C-APCBioLegend128016Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD9-FITCBioLegend124808Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucoseCorning10-014-CV
192 mL MCDB201SigmaM6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024Sigma12303C
5 mL 100% ITS premixBD Bioscience354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphateSigmaA8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basicR&D systems3139-FB-025/CF
5 mL Pen/StrepCorning30-001-CI
500 µL GentamycinGibco15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.

Referencias

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