マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

要約

このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気ビーズ分離により、マウス腹腔内白色脂肪組織(WAT)デポから脂肪形成および線維炎症性間質細胞亜集団を単離するための技術的アプローチを説明しています。

要約

白色脂肪組織(WAT)の間質血管画分(SVF)は、非常に不均一であり、成人期のWATの拡張とリモデリングに機能的に寄与する多数の細胞タイプで構成されています。この細胞の不均一性の影響を研究する上での大きな障壁は、in vitroおよびin vivo分析のためにWAT SVFから機能的に異なる細胞亜集団を容易に分離できないことです。シングルセルシーケンシング技術は最近、成体マウスの腹腔内WATデポにおいて、機能的に異なる線維炎症性および脂肪形成性PDGFRβ+血管周囲細胞亜集団を同定しました。線維炎症性前駆細胞(「FIP」と呼ばれる)は、炎症誘発性の表現型を発揮できる非脂肪原性コラーゲン産生細胞です。PDGFRβ+脂肪細胞前駆細胞(APC)は、細胞移植時にin vitroおよびin vivoの両方で高い脂肪形成を示します。ここでは、マウスの腹腔内WATデポからこれらの間質細胞亜集団を単離するための複数の方法について説明します。FIPおよびAPCは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)またはビオチン化抗体ベースの免疫磁気ビーズ技術を利用することにより、単離できます。単離された細胞は、分子解析や機能解析に利用することができます。間質細胞亜集団の機能特性を単独で研究することで、細胞レベルでの生理学的または病理学的条件下での脂肪組織リモデリングに関する現在の知識が広がります。

概要

白色脂肪組織(WAT)は、哺乳類のエネルギー貯蔵の主要な部位を表しています。この組織内では、脂肪細胞、または「脂肪細胞」が過剰なカロリーをトリグリセリドの形で貯蔵し、大きな単房性脂肪滴にパッケージ化されています。さらに、脂肪細胞は、エネルギー恒常性の様々な側面を調節する多数の因子を分泌する^1,2,3。脂肪細胞はWATボリュームの大部分を占めています。ただし、脂肪細胞はWAT ^4,5に見られる全細胞の50%未満しか占めていません。WATの非脂肪細胞コンパートメント、または間質血管画分(SVF)は、非常に不均一であり、血管内皮細胞、組織常在免疫細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞前駆細胞(APC)集団が含まれています。

WATは、エネルギー貯蔵の需要の増加に伴ってサイズを拡大するという驚くべき能力において、非常に優れています。WATでの脂質の適切な保存は、非脂肪組織への有害な異所性脂質沈着から保護するため、この組織の可塑性を維持することが不可欠です⁶。カロリー過剰に反応して個々のWATデポがこの拡大を経験する方法は、肥満の状況におけるインスリン感受性の重要な決定要因です⁷。メタボリックシンドロームの肥満患者に観察される病理学的WAT拡張は、代謝的に好ましい皮下脂肪組織を犠牲にして、内臓WATデポの優先的な拡大によって特徴付けられます。さらに、肥満におけるインスリン抵抗性は、WATの病理学的リモデリングに関連しています。これは、既存の脂肪細胞の肥大成長(サイズの増加)、不十分な血管新生、慢性代謝炎症、細胞外マトリックス成分の蓄積(線維化)、および組織の低酸素症によって特徴付けられます^8,9。これらの肥満のWAT表現型は、脂肪異栄養症(機能的WATの欠如)の状態で観察されるものと同様に、脂肪肝およびインスリン抵抗性と関連しています。対照的に、健康なWATの拡大は代謝的に健康な肥満集団で観察され、脂肪細胞過形成¹⁰を介した保護皮下WATおよびデポー拡大の優先的な拡大によって特徴付けられます。新しい脂肪細胞の動員は、脂肪細胞前駆細胞(APC)からのde novo脂肪細胞の分化(「脂肪形成」と呼ばれる)によって媒介されます。脂肪細胞の過形成は、比較的低い程度のWAT線維症および代謝性炎症と一致します^6,11。WAT微小環境内の多数の細胞型は、肥満におけるWATの健康と拡張性に直接影響します¹²。そのため、WATに存在するさまざまな細胞タイプの機能を定義することは、この分野にとって依然として高い優先事項です。

過去10年間で、ヒトおよびマウスのWAT SVF¹³から天然APCを定義し、単離するためにいくつかの戦略が採用されてきました。このような戦略では、抗体ベースの細胞分離技術を用いて、一般的な間葉系幹細胞/前駆細胞マーカーの細胞表面発現に基づいてAPCを単離します。これらのアプローチには、蛍光標識抗体を用いた蛍光活性化細胞選別(FACS)や、免疫磁気ビーズ分離(すなわち、化学的に修飾された抗体)が含まれます。APCの単離を標的とする細胞表面タンパク質には、PDGFRα、PDGFRβ、CD34、およびSCA-1が含まれます。これらのアプローチは、APCの充実に役立っています。しかし、これらのマーカーに基づいて単離された細胞集団は、かなり不均一です。ごく最近のシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)研究では、マウスWAT ^14,15,16,17の単離された間質血管画分(SVF)内の間質細胞の分子的および機能的不均一性が浮き彫りになっています。私たち自身のscRNA-seqおよび機能解析から、成体マウスの腹腔内WATの間質コンパートメントにおける機能的に異なる免疫調節および脂肪形成PDGFRβ+血管周囲細胞亜集団を同定し、特徴付けました¹⁵。線維炎症性前駆体(FIP)は、PDGFRβ+細胞の顕著な亜集団であり、LY6C発現(LY6C+ PDGFRβ+細胞)に基づいて単離することができる¹⁵。FIPは脂肪形成能力を欠き、さまざまな刺激に対して強い炎症誘発性反応を発揮し、コラーゲンを生成し、抗脂肪生成因子を分泌します¹⁵。これらの細胞の炎症誘発性および線維形成活性は、マウスの肥満に関連して増加し、これらの細胞がWATリモデリングの調節因子として関与しています。LY6C- CD9- PDGFRβ+亜集団は、脂肪細胞前駆細胞(APC)を表します。これらのAPCは、Ppargおよび他の脂肪形成促進遺伝子の発現に富んでおり、in vitroおよびin vivoで成熟脂肪細胞に容易に分化します¹⁵。ここでは、FACSを使用して成体マウスの腹腔内WATデポからこれらの異なる細胞集団を単離し、ビオチン化抗体を使用して免疫磁気ビーズを分離するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、成体雄および雌マウスの複数の腹腔内WATデポから機能的に異なる脂肪前駆細胞亜集団を単離するために使用することができる¹⁵。これらの機能的に異なる細胞集団を単独で研究することは、健康と疾患における脂肪形成と腹腔内脂肪組織のリモデリングを調節する分子メカニズムの現在の理解に大きく貢献する可能性があります。

以下のプロトコルは、マウス精巣上体WATからの脂肪前駆細胞の単離を詳述しています。しかし、同じ手順を使用して、雄および雌マウス¹⁵の両方の腸間膜および後腹膜WATデポから対応する細胞を単離することができる。マウスでこれらのデポを同定し、単離する方法に関する詳細なプロトコルは、Bagchi et ^al.18に記載されています。このプロトコルは、6〜8週齢のマウスの使用に最適化されています。APCの頻度と分化能力は、加齢に伴って低下する可能性があります。

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プロトコル

すべての動物のプロトコルと手順は、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの施設用動物使用およびケア委員会によって承認されています。

1. 性腺白脂肪組織からの間質血管画分(SVF)の単離

1. 6〜8週齢のマウスの性腺白脂肪組織を解剖し、脂肪パッドを1x PBS溶液に入れます。
2. 最大4つの脂肪デポ(1〜2匹のマウスから2〜4のデポを推奨)を組み合わせ、200 μLの消化バッファー(1x HBSS、1.5% BSAおよび1 mg/mLコラゲナーゼD)を含む10 mLビーカーで組織をミンチにします。
3. ミンチ組織を10 mL消化バッファーが入った50 mLの遠心チューブに移します。
4. 混合物を37°Cの水浴中で1時間、振とうしながらインキュベートします。
5. 100 μmのセルストレーナーで消化した組織をろ過し、未消化の組織を除去します。
6. ろ過したサンプルを 2% FBS を含む PBS で 30 mL に希釈し、600 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 成熟脂肪細胞を含む上清を吸引します。
7. すぐに優先細胞単離法に進んでください。

2. FACSを用いたAPCとFIPの分離

1. チューブを穏やかに振って、ペレットを1x RBC溶解バッファー1 mLに溶解します。
2. 室温で1〜2分間インキュベートします。
3. 2% FBS/PBSを10 mL加え、40 μmのセルストレーナーを清浄な50 mLの遠心チューブに通します。
4. 600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
5. 培地を吸引し、ペレットを400〜800μLの2%FBS/PBS含有Fcブロック(1:200)に再懸濁します。
6. 4°Cで10分間インキュベートします。
7. 1mLあたり6細胞を≤10個含有する細胞懸濁液400μL〜800μLを1.5mLチューブに移し、抗体を添加します。抗体濃度は、材料表のセクションに記載されています。
   1. 1)未染色細胞、2)単色コントロール、3)FMO(蛍光マイナス1)コントロール用に別々のコントロールチューブを調製します。
   2. PDGFRβ、CD45、CD31、CD9、LY6C抗体でサンプルを染色します。
8. 4°Cで15分間インキュベートし、光から保護します。
9. 600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
10. 培地を吸引し、細胞を400 μLの2% FBS/PBSに再懸濁します。
11. 600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
12. 培地を吸引し、細胞を400-800 μLの2% FBS/PBSに再懸濁します。次に、40 μmのフィルターキャップを5 mLポリスチレン丸底チューブに入れ、FACS用に入れます。
13. ゲートについては、次の手順に従います。
    1. 補正には、汚れていない単色コントロールを使用します。
    2. FMOコントロールを使用して実験ゲートを設定します。
    3. 図 1 に示すゲーティング戦略を使用して、APC と FIPS を取得します。ゲートAPCはCD45-CD31-PDGFRβ⁺ LY6C-CD9^-、FIPはCD45-CD31-PDGFRβ⁺ LY6C⁺細胞です。
14. 選別した細胞を500 μLの100%血清が入ったチューブに集め、細胞を氷上に保持します。
15. 細胞を600 x g で5分間、4°Cで遠心分離します。 2% FBS/PBSを添加し、再度600 x g で4°C、5分間遠心分離して細胞を洗浄します。 上清を捨て、ペレット化した細胞を使用します。
16. ペレット化した細胞を、適切な量の性腺APC培養培地(細胞培養用)またはその後の分析のために適切な緩衝液に再懸濁します。

3. 脂肪形成画分と非脂肪形成画分の免疫磁気分離

1. ステップ1.1-1.7に従って、性腺白脂肪組織からSVFを単離します。
2. 上清を吸引し、SVFペレットを1x 1x 市販のMS Bufferに10 mL再懸濁します。
3. 細胞懸濁液を40μmの細胞ストレーナーでろ過します。
4. 600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
5. 上清を吸引し、ペレット化した細胞を1x MS Bufferの100 μLに再懸濁します。
6. 以下で説明するように、CD31⁺ およびCD45⁺ 細胞の枯渇を行います(図2A、 ステップ1)。これは、内皮細胞と造血系統細胞を除去するために行われます。
   1. セルカウンターを使用して細胞をカウントし、濃度を 1 x 10⁸ 細胞/mL ≤に調整します。
   2. ビオチン標識CD31抗体とCD45抗体を細胞懸濁液にそれぞれ10個^{6個あたり} ≤0.25μgの濃度で加え、氷上で15分間インキュベートします。
   3. 1x MS Bufferを4 mL添加して細胞を洗浄します。
   4. 600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   5. 上清を吸引し、ペレットを1x MSバッファー100 μLで再懸濁します。
   6. ストレプトアビジンナノビーズ10μLを添加し、細胞を氷上で15分間インキュベートします。
   7. 1x MSバッファー4 mLを加えて細胞を洗浄します。
   8. 600 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
   9. 細胞を2.5 mLの1x MSバッファーに再懸濁し、5 mLのポリプロピレンチューブに移します。
   10. チューブをマグネットラックに5分間置きます。
   11. 細胞懸濁液を清潔な15 mL遠心チューブに注ぎ、非標識細胞を回収します。
       注:ぶら下がっている液滴を振ったり吸い取ったりすると、不要な細胞分画による汚染につながるため、避けてください。
   12. チューブを磁石から取り外し、手順3.6.9を繰り返します。を 3.6.11.さらに2回、合計3回の洗浄。
7. 脂肪形成画分と非脂肪形成画分の分離(図2A、 ステップ2)
   1. ラベルのない画分(つまり、CD45-CD31^-画分)で作業を続けます。
   2. 非標識細胞を含む15 mLチューブを600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   3. 上清を吸引し、ペレットを1x MSバッファー100 μLに再懸濁します。
   4. ビオチン標識LY6C抗体とCD9抗体をそれぞれ≤ 0.25 μg/10⁶ 細胞あたり添加し、氷上で15分間インキュベートします。
   5. 手順 3.6.3 に従います。を 3.6.12.をクリックして、2 回目の分離を完了します。
   6. バインドされていない分数を収集します。非標識細胞(LY6C-CD9^-)は、APCを含む脂肪形成画分を表します(図2A、ステップ3)。
   7. チューブを磁石から取り出し、結合細胞を再懸濁して1x MSバッファーで溶出します。溶出液または標識画分(LY6C⁺ CD9⁺)は、FIPを含む非脂肪形成画分を表します(図2A、 ステップ3)。
   8. 標識フラクションおよび非標識フラクションを600 x g で5分間遠心分離し、細胞を4°Cでペレット化します。
8. 直ちに細胞培養に進むか(ステップ6)、または優先分析のために未分化前駆体を使用します(ステップ4および/またはステップ5)。

4. 脂肪形成画分および非脂肪生成画分の純度をフローサイトメトリーで評価する

1. ビーズ単離した細胞画分を、200-400 μLの2% FBS/PBS含有Fcブロック(1:200)に再懸濁します。
2. 4°Cで10分間インキュベートします。
3. 細胞懸濁液を1.5mLチューブに移し、抗体を添加します。抗体濃度は 材料表に記載されています。
   1. 1)未染色細胞、2)単色コントロール、3)FMOコントロール用に別々のコントロールチューブを調製します。
   2. サンプルにCD45、CD31、CD9、およびLY6C抗体を添加します。
4. 4°Cで15分間インキュベートし、光から保護します。
5. 600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
6. 上清を吸引し、細胞を400 μLの2% FBS/PBSに再懸濁します。
7. 懸濁液を600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
8. 上清を吸引し、細胞を400-800μLの2%FBS/PBSに再懸濁します。40 μmのフィルターキャップを通して5 mLのポリスチレン丸底チューブにろ過し、フローサイトメトリーで分析します。
9. 純度を評価するためのフローサイトメトリー解析
   1. 補正には、汚れていない単色コントロールを使用します。
   2. FMOコントロールを使用して実験ゲートを設定します。
   3. 図2Bに示すように、生細胞と単一細胞にゲーティング戦略を使用します。
   4. CD45、CD31、LY6C、および CD9 について 、図 2B に示すようにゲーティングを実行します。
   5. フローサイトメトリーソフトウェアを使用して、単離画分中のCD45-CD31-LY6C-CD9^-細胞(APC)およびCD45-CD31-LY6C⁺細胞(FIP)の頻度を評価します。

5. FIPおよびAPCの純度を評価するための定量PCRを用いた遺伝子発現解析

1. 磁気的に単離された細胞またはFACSで単離された細胞から、市販の抽出キット( 材料表を参照)を使用して、製造元の指示に従ってmRNAを抽出します。
2. 1 μg の RNA を使用して、製造元の指示に従って cDNA 逆転写酵素キット ( 材料表を参照) を使用して cDNA を合成します。
3. APCおよびFIP選択的遺伝子の相対的なmRNAレベル(表1)を、SYBRグリーンPCRマスターミックスを用いた定量的PCRにより測定します。
   1. PCR用のサンプル反応を次のように設定します:5 μLの2x SYBR緑色色素、1 μLのcDNA(~50 ng/μL)、各フォワードプライマーとリバースプライマー0.5 μL(10 μM)、および3 μLの水。
   2. 定量的PCRランには、以下の標準PCR条件を使用してください: ホールドステージ:50°Cで2分間、95°Cで10分間;PCRステージ(40サイクル):95°Cで15秒、60°Cで1分間。
4. ΔΔ-Ctを計算することにより、値をハウスキーピング遺伝子(Rps18)レベルに正規化します。
5. 統計的有意性を評価するには、対応のないスチューデントのt検定を実行します。

6. 細胞培養と分化

1. 磁気的に単離された細胞またはFACSで、600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
2. ペレットを500 μLの性腺APC培養培地に再懸濁し、48ウェル培養プレートの各画分から40K細胞/ウェルをプレート化します。
3. メディアは1〜2日ごとに交換してください。APCは、合流点に近づくにつれて脂肪細胞への分化が始まります。同じ培地で維持されているFIPは、脂肪形成を受けることに耐性があります。

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結果

このプロトコルは、成体マウスの腹腔内WATデポから異なる間質細胞集団の単離を可能にする2つの戦略を説明しています。APCおよびFIPは、FACS(図1)またはビオチン化抗体による免疫磁気ビーズ分離(図2)によって単離できます。どちらのアプローチも、すべて市販の試薬と抗体を利用します。免疫磁気ビーズの分離は、gWAT SVFからの脂肪形成細胞と非脂...

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ディスカッション

マウスのC57BL/6系統は、食事誘発性肥満の研究で最も使用されているマウス系統です。C57BL/6マウスは、高脂肪食(HFD)を摂取すると急速に体重が増加し、肥満に関連するメタボリックシンドロームの顕著な特徴(インスリン抵抗性や高脂血症など)を発現します。特に、高脂肪食(HFD)の摂食に関連して起こるWATの拡大は、デポ特異的な方法で起こる19,20,21,22,23。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainers	Fisher Scientific	352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	21040CV
5ml polypropylene tubes	Fisher Scientific	352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSS	Sigma	H8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)	Roche	11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.)	Fisher Scientific	BP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)	BioLegend	480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)	BioLegend	480019
100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads	BioLegend	480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)	eBioscience	553141
Antibodies
Biotin CD45	BioLegend	103103	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11
Biotin CD31	BioLegend	102503	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3
Biotin CD9	BioLegend	124803	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3
Biotin LY6C	BioLegend	128003	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5	BioLegend	102419	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5	BioLegend	103131	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PE	BioLegend	136006	Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5
LY6C-APC	BioLegend	128016	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4
CD9-FITC	BioLegend	124808	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucose	Corning	10-014-CV
192 mL MCDB201	Sigma	M6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024	Sigma	12303C
5 mL 100% ITS premix	BD Bioscience	354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate	Sigma	A8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basic	R&D systems	3139-FB-025/CF
5 mL Pen/Strep	Corning	30-001-CI
500 µL Gentamycin	Gibco	15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.