JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Özet

Beyaz yağ dokusunun (WAT) stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) oldukça heterojendir ve yetişkinlikte WAT'ın genişlemesine ve yeniden şekillenmesine işlevsel olarak katkıda bulunan çok sayıda hücre tipinden oluşur. Bu hücresel heterojenliğin etkilerini incelemenin önündeki muazzam bir engel, in vitro ve in vivo analizler için işlevsel olarak farklı hücre alt popülasyonlarını WAT SVF'den kolayca izole edememektir. Tek hücreli dizileme teknolojisi, son zamanlarda yetişkin farelerin karın içi WAT depolarında fonksiyonel olarak farklı fibro-inflamatuar ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımlamıştır. Fibro-inflamatuar progenitörler ("FIP'ler" olarak adlandırılır), proinflamatuar bir fenotip uygulayabilen adipojenik olmayan kollajen üreten hücrelerdir. PDGFRβ+ adiposit öncü hücreleri (APC'ler), hücre transplantasyonu üzerine hem in vitro hem de in vivo olarak oldukça adipojeniktir. Burada, bu stromal hücre alt popülasyonlarının murin intraabdominal WAT depolarından izolasyonu için birden fazla yöntem tanımlanmıştır. FIP'ler ve APC'ler, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile veya biyotinile antikor bazlı immünomanyetik boncuk teknolojisinden yararlanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş hücreler moleküler ve fonksiyonel analiz için kullanılabilir. Stromal hücre alt popülasyonunun fonksiyonel özelliklerini izole olarak incelemek, hücresel düzeyde fizyolojik veya patolojik koşullar altında yağ dokusunun yeniden şekillenmesi hakkındaki mevcut bilgilerimizi genişletecektir.

Giriş

Beyaz yağ dokusu (WAT), memelilerde enerji depolamanın ana bölgesini temsil eder. Bu doku içinde, adipositler veya "yağ hücreleri", büyük tek gözlü lipid damlacıkları halinde paketlenmiş trigliserit formunda fazla kaloriyi depolar. Ayrıca, adipositler, enerji homeostazınınçeşitli yönlerini düzenleyen çok sayıda faktör salgılar 1,2,3. Adipositler, WAT hacminin büyük kısmını oluşturur; bununla birlikte, adipositler, WAT 4,5'te bulunan toplam hücrelerin yalnızca %50'sinden daha azını temsil eder. WAT'ın adiposit olmayan bölmesi veya stromal-vasküler fraksiyon (SVF) oldukça heterojendir ve vasküler endotel hücreleri, dokuda yerleşik bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve adiposit öncü hücre (APC) popülasyonlarını içerir.

WAT, enerji depolama talebi arttıkça boyut olarak genişleme konusundaki olağanüstü kapasitesi açısından olağanüstüdür. Bu doku plastisitesinin korunması önemlidir, çünkü lipitlerin WAT'ta yeterli depolanması, adipoz olmayan dokulara zararlı ektopik lipid birikimine karşı koruma sağlar6. Bireysel WAT depolarının kalori fazlalığına yanıt olarak bu genişlemeye maruz kalma şekli, obezite ortamında insülin duyarlılığının kritik bir belirleyicisidir7. Metabolik sendromlu obez bireylerde gözlenen patolojik WAT genişlemesi, metabolik olarak uygun deri altı yağ dokusu pahasına viseral WAT depolarının tercihli genişlemesi ile karakterizedir. Ayrıca, obezitede insülin direnci, WAT'ın patolojik yeniden şekillenmesi ile ilişkilidir. Bu, mevcut adipositlerin hipertrofik büyümesi (boyutta artış), yetersiz anjiyogenez, kronik metabolik inflamasyon, hücre dışı matris bileşenlerinin birikimi (fibroz) ve doku hipoksisiile karakterizedir 8,9. Obezitenin bu WAT fenotipleri, lipodistrofi durumunda gözlenene benzer şekilde hepatik steatoz ve insülin direnci ile ilişkilidir (fonksiyonel WAT yokluğu). Buna karşılık, metabolik olarak sağlıklı obez popülasyonda sağlıklı WAT genişlemesi gözlenir ve koruyucu deri altı WAT'ın tercihli genişlemesi ve adiposit hiperplazisi10 yoluyla depo genişlemesi ile karakterize edilir. Yeni adipositlerin alımına, adiposit öncü hücrelerinden (APC'ler) ("adipogenez" olarak adlandırılır) de novo adiposit farklılaşması aracılık eder. Adiposit hiperplazisi, nispeten daha düşük derecelerde WAT fibrozu ve metabolik inflamasyon ile çakışır 6,11. WAT mikro çevresindeki çok sayıda hücre tipi, obezitede WAT'ın sağlığını ve genişletilebilirliğini doğrudan etkiler12. Bu nedenle, WAT'ta bulunan çeşitli hücre tiplerinin işlevini tanımlamak, alan için yüksek bir öncelik olmaya devam etmektedir.

Son on yılda, yerel APC'leri insan ve fare WAT SVF13'ten tanımlamak ve izole etmek için çeşitli stratejiler kullanılmıştır. Bu tür stratejiler, antikor bazlı hücre ayırma teknikleri kullanarak ortak mezenkimal kök / progenitör hücre belirteçlerinin hücre yüzeyi ekspresyonuna dayalı olarak APC'leri izole eder. Bu yaklaşımlar, florofor işaretli antikorlar kullanılarak floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasını (FACS) veya immünomanyetik boncuk ayrımını (yani kimyasal olarak modifiye edilmiş antikorlar) içerir. APC'lerin izolasyonu için hedeflenen hücre yüzey proteinleri arasında PDGFRα, PDGFRβ, CD34 ve SCA-1 bulunur. Bu yaklaşımlar APC'ler için zenginleştirmeye yardımcı oldu; Bununla birlikte, bu belirteçlere dayalı olarak izole edilen hücre popülasyonları oldukça heterojendir. Çok yeni tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) çalışmaları, murin WAT14,15,16,17'nin izole edilmiş stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) içindeki stromal hücrelerin moleküler ve fonksiyonel heterojenliğini vurgulamıştır. Kendi scRNA-seq ve fonksiyonel analizlerimizden, yetişkin farelerde intraabdominal WAT'ın stromal bölmesinde fonksiyonel olarak farklı bağışıklık modüle edici ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımladık ve karakterize ettik15. Fibro-inflamatuar öncüler veya FIP'ler, PDGFRβ+ hücrelerinin belirgin bir alt popülasyonunu temsil eder ve LY6C ekspresyonuna (LY6C + PDGFRβ+ hücreleri) dayalı olarak izole edilebilir15. FIP'ler adipojenik kapasiteden yoksundur, çeşitli uyaranlara güçlü bir pro-inflamatuar yanıt verir, kollajen üretir ve anti-adipojenik faktörler salgılar15. Bu hücrelerin pro-enflamatuar ve fibrojenik aktivitesi, farelerde obezite ile ilişkili olarak artar ve bu hücreleri WAT yeniden şekillenmesinin düzenleyicileri olarak gösterir. LY6C- CD9- PDGFRβ+ alt popülasyonu, adiposit öncü hücrelerini (APC'ler) temsil eder. Bu APC'ler, Pparg ve diğer pro-adipojenik genlerin ekspresyonu ile zenginleştirilir ve in vitro ve in vivo15 olarak olgun adipositlere kolayca farklılaşır. Burada, bu farklı hücre popülasyonlarının FACS kullanılarak yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından izolasyonu ve biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayrımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, yetişkin erkek ve dişi farelerin birden fazla karın içi WAT deposundan fonksiyonel olarak farklı adipoz progenitör alt popülasyonları izole etmek için kullanılabilir15. Bu fonksiyonel olarak farklı hücre popülasyonlarını izole edilmiş olarak incelemek, sağlık ve hastalıkta adipogenezi ve intraabdominal yağ dokusunun yeniden şekillenmesini düzenleyen moleküler mekanizmalar hakkındaki mevcut anlayışımıza büyük katkı sağlayabilir.

Aşağıdaki protokol, murin epididimal WAT'tan adipoz progenitörlerin izolasyonunu detaylandırmaktadır; bununla birlikte, aynı prosedür, hem erkek hem de dişi farelerin mezenterik ve retroperitoneal WAT depolarından karşılık gelen hücreleri izole etmek için kullanılabilir15. Farelerde bu depoların nasıl tanımlanacağı ve izole edileceğine dair ayrıntılı bir protokol Bagchi ve ark.18'de bulunabilir. Bu protokol, 6-8 haftalık farelerin kullanımı için optimize edilmiştir. APC'lerin sıklığı ve farklılaşma kapasitesi yaşlanma ile ilişkili olarak azalabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri ve prosedürleri, Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Gonadal beyaz yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu

  1. 6-8 haftalık farelerden gonadal beyaz yağ dokusunu inceleyin ve yağ pedlerini 1x PBS çözeltisine yerleştirin.
  2. 4 adede kadar yağ deposunu birleştirin (1-2 fareden 2-4 depo önerilir) ve dokuyu 200 μL sindirim tamponu (1x HBSS,% 1.5 BSA ve 1 mg / mL kollajenaz D) içeren 10 mL'lik bir beherde kıyın.
  3. Kıyılmış dokuyu 10 mL sindirim tamponu içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  4. Karışımı 37 °C'de bir su banyosunda çalkalayarak 1 saat inkübe edin.
  5. Sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için sindirilmiş dokuyu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
  6. Filtrelenmiş numuneyi% 2 FBS içeren PBS ile 30 mL'ye seyreltin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Olgun adipositler içeren süpernatanı aspire edin.
  7. Hemen tercih edilen hücre izolasyon yöntemine geçin.

2. FACS kullanarak APC'lerin ve FIP'lerin izolasyonu

  1. Tüpü hafifçe sallayarak peleti 1 mL 1x RBC lizis tamponunda çözün.
  2. RT'de 1-2 dakika inkübe edin.
  3. 10 mL %2 FBS/PBS ekleyin ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden temiz bir 50 mL santrifüj tüpüne geçirin.
  4. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Ortamı aspire edin ve peleti Fc bloğu (1:200) içeren 400-800 μL %2 FBS/PBS'de yeniden süspanse edin.
  6. 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
  7. mL'de ≤106 hücre içeren 400 μL-800 μL hücre süspansiyonlarını 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve antikorlar ekleyin. Antikor konsantrasyonları Malzeme Tablosu bölümünde listelenmiştir.
    1. 1) boyanmamış hücreler, 2) tek renk kontrolleri ve 3) FMO (floresan eksi bir) kontrolleri için ayrı kontrol tüpleri hazırlayın.
    2. Örnekleri PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C antikorları ile boyayın.
  8. Işıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  9. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  10. Ortamı aspire edin ve hücreleri 400 μL'lik %2 FBS/PBS'de yeniden süspanse edin.
  11. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  12. Ortamı aspire edin ve hücreleri 400-800 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra 40 μm filtre kapaklarından FACS için 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere geçirin.
  13. Geçit için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Telafi için lekesiz ve tek renkli kontroller kullanın.
    2. Deneysel kapıları ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın.
    3. APC'leri ve FIP'leri elde etmek için Şekil 1'de gösterilen geçit stratejisini kullanın. Kapı APC'leri CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- ve FIP'leri CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ hücreleri olarak kullanın.
  14. Sıralanmış hücreleri 500 μL% 100 serum içeren tüplerde toplayın ve hücreleri buz üzerinde tutun.
  15. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da tekrar santrifüjleyerek yıkamak için% 2 FBS / PBS ekleyin. Süpernatanı atın, peletlenmiş hücreleri kullanın.
  16. Peletlenmiş hücreleri, sonraki analiz için uygun hacimde gonadal APC kültür ortamında (hücre kültürü için) veya uygun tamponda yeniden süspanse edin.

3. Adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların immünomanyetik ayrımı

  1. 1.1-1.7 adımlarını izleyerek SVF'yi gonadal beyaz yağ dokusundan izole edin.
  2. Süpernatanı aspire edin ve SVF peletini 10 mL 1x ticari olarak temin edilebilen MS Tamponunda yeniden süspanse edin.
  3. Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
  4. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı aspire edin ve peletlenmiş hücreleri 100 μL 1x MS Tamponunda yeniden süspanse edin.
  6. Aşağıda tartışıldığı gibi CD31 + ve CD45 + hücre tükenmesini gerçekleştirin (Şekil 2A, Adım 1). Bu, endotelyal ve hematopoietik soy hücrelerini çıkarmak için yapılır.
    1. Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve konsantrasyonu ≤ 1 x 108 hücre / mL'ye ayarlayın.
    2. Biyotin konjuge CD31 ve CD45 antikorlarını, her biri 106 hücre başına ≤ 0.25 μg konsantrasyonda hücre süspansiyonuna ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    3. 4 mL 1x MS Tampon ekleyerek hücreleri yıkayın.
    4. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı aspire edin ve peleti 100 μL 1x MS tamponu ile yeniden süspanse edin.
    6. 10 μL streptavidin nanoboncuk ekleyin ve hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
    7. 4 mL 1x MS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.
    8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı aspire edin.
    9. Hücreleri 2.5 mL 1x MS tamponunda yeniden süspanse edin ve 5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.
    10. Tüpü 5 dakika boyunca mıknatıs rafına yerleştirin.
    11. Hücre süspansiyonunu temiz bir 15 mL santrifüj tüpüne dökerek etiketlenmemiş hücreleri toplayın.
      NOT: İstenmeyen hücre fraksiyonundan kontaminasyona yol açtığından, asılı damlacıkları sallamaktan veya lekelemekten kaçının.
    12. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve 3.6.9 adımlarını tekrarlayın. 3.6.11'e kadar. toplam 3 yıkama için iki kez daha.
  7. Adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların ayrılması (Şekil 2A, Adım 2)
    1. Etiketlenmemiş kesir (yani, CD45- CD31- kesir) ile çalışmaya devam edin.
    2. Etiketlenmemiş hücreler içeren 15 mL'lik tüpü 600 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı aspire edin ve peleti 100 μL 1x MS tamponunda yeniden süspanse edin.
    4. Biyotin konjuge LY6C ve CD9 antikorlarını, sırasıyla, 106 hücre başına ≤ 0.25 μg konsantrasyonda ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    5. 3.6.3 adımlarını takip edin. 3.6.12'ye kadar. ikinci ayrımı tamamlamak için.
    6. İlişkilendirilmemiş kesirleri toplayın. Etiketlenmemiş hücreler (LY6C-CD9-), APC'leri içeren adipojenik fraksiyonu temsil eder (Şekil 2A, Adım 3).
    7. Tüpü mıknatıstan çıkarın, yeniden süspanse edin ve bağlı hücreleri 1x MS tamponunda elüte edin. Elüatlar veya etiketli fraksiyon (LY6C + CD9 +), FIP içeren adipojenik olmayan fraksiyonu temsil eder (Şekil 2A, Adım 3).
    8. Etiketli ve etiketsiz fraksiyonları 600 x g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de pelet hücrelerine santrifüjleyin.
  8. Hemen hücre kültürüne geçin (adım 6) veya tercih edilen analizler için farklılaşmamış öncüler kullanın (adım 4 ve/veya adım 5).

4. Akış sitometrisi ile adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların saflığını değerlendirin

  1. Fc bloğu (1:200) içeren 200-400 μL'lik %2 FBS/PBS'de boncuk izole hücre fraksiyonlarını yeniden süspanse edin.
  2. 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
  3. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve antikorlar ekleyin. Antikor konsantrasyonları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
    1. 1) boyanmamış hücreler, 2) tek renk kontrolleri ve 3) FMO kontrolleri için ayrı kontrol tüpleri hazırlayın.
    2. Örneklere CD45, CD31, CD9 ve LY6C antikorları ekleyin.
  4. Işıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  5. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  6. Süpernatan aspire edin ve hücreleri 400 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin.
  7. Süspansiyonu 600 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 400-800 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi ile analiz için 40 μm filtre kapaklarından 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere süzün.
  9. Saflığı değerlendirmek için akış sitometrisi analizi
    1. Telafi için lekesiz ve tek renkli kontroller kullanın.
    2. Deneysel kapıları ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın.
    3. Şekil 2B'de gösterildiği gibi canlı ve tek hücreler için geçit stratejisini kullanın.
    4. CD2, CD45, LY31C ve CD6 için Şekil 9B'de gösterildiği gibi geçitleme işlemini gerçekleştirin.
    5. İzole fraksiyonlar içinde CD45- CD31- LY6C- CD9- hücrelerinin (APC'ler) ve CD45- CD31- LY6C + hücrelerinin (FIP'ler) frekanslarını değerlendirmek için akış sitometrisi yazılımını kullanın.

5. FIP'lerin ve APC'lerin saflığını değerlendirmek için kantitatif PCR kullanarak gen ekspresyonu analizi

  1. Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen ekstraksiyon kitini ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak manyetik veya FACS izole hücrelerden mRNA'yı çıkarın.
  2. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir cDNA Ters Transkriptaz kiti ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak cDNA'yı sentezlemek için 1 μg RNA kullanın.
  3. SYBR yeşil PCR ana karışımı kullanarak kantitatif PCR ile APC ve FIP'leri seçici genlerin (Tablo 1) nispi mRNA seviyelerini belirleyin.
    1. PCR için numune reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: 5 μL 2x SYBR yeşil boya, 1 μL cDNA (~50 ng/ μL), her bir ileri ve geri astardan 0.5 μL (10 μM) ve 3 μL su.
    2. Kantitatif PCR çalıştırması için aşağıdaki standart PCR koşullarını kullanın: tutma aşaması: 50 °C 2 dakika, 95 °C 10 dakika; PCR aşaması (40 döngü): 15 saniye boyunca 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C.
  4. ΔΔ-Ct'yi hesaplayarak değerleri temizlik geni (Rps18) seviyelerine normalleştirin.
  5. İstatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için, eşleştirilmemiş Öğrenci t-testini gerçekleştirin.

6. Hücre kültürü ve farklılaşması

  1. Manyetik olarak veya FACS ile izole edilmiş hücreleri 600 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  2. Peletleri 500 μL gonadal APC kültür ortamında yeniden süspanse edin ve 48 oyuklu bir kültür plakasındaki her fraksiyondan 40K hücre / kuyu plakalayın.
  3. Ortamı her 1-2 günde bir değiştirin. APC'ler, birleşmeye yaklaştıkça adipositlere farklılaşmaya başlayacaktır. Aynı ortamda tutulan FIP'ler, adipogenez geçirmeye dirençlidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokol, yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından farklı stromal hücre popülasyonlarının izolasyonuna izin veren iki stratejiyi tanımlar. APC'ler ve FIP'ler, FACS (Şekil 1) veya biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayırma (Şekil 2) ile izole edilebilir. Her iki yaklaşım da ticari olarak temin edilebilen reaktifleri ve antikorları kullanır. İmmünomanyetik boncuk ayrımı, gWAT SVF'den adipojenik olmayan hücrelerden adipojeni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Farelerin C57BL / 6 suşu, diyete bağlı obezite çalışmalarında en çok kullanılan fare türüdür. C57BL / 6 fareleri, yüksek yağlı bir diyete (HFD) yerleştirildiğinde hızla kilo alır ve obezite ile ilişkili metabolik sendromun bazı belirgin özelliklerini geliştirir (örneğin, insülin direnci ve hiperlipidemi). Özellikle, yüksek yağlı diyet (HFD) beslemesi ile ilişkili olarak meydana gelen WAT genişlemesi, depoya özgü bir şekilde gerçekleşir 19,20,21,22,23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

T.A.P., Novo Nordisk A/S'nin bir çalışanı ve hissedarıdır

Teşekkürler

Yazarlar, mükemmel teknik yardımları için Lisa Hansen ve Kirsten Vestergaard'a ve el yazmasının eleştirel okuması için P. Scherer, N. Joffin ve C. Crewe'ye minnettardır. Yazarlar, burada açıklanan protokollerin geliştirilmesinde mükemmel rehberlik ve yardım için UTSW Akış Sitometrisi Çekirdeğine teşekkür eder. R.K.G., NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 ve NIDDK R01 DK119163 tarafından desteklenir. J.P., Danimarka İnovasyon Fonu'ndan bir doktora öncesi ödül ile desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainersFisher Scientific352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS)Fisher Scientific21040CV
5ml polypropylene tubesFisher Scientific352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSSSigmaH8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)Roche11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.)Fisher ScientificBP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)BioLegend480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)BioLegend480019
100 µL MojoSort Streptavidin NanobeadsBioLegend480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis BuffereBioscience00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)eBioscience553141
Antibodies
Biotin CD45BioLegend103103Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: 30-F11
Biotin CD31BioLegend102503Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MEC13.3
Biotin CD9BioLegend124803Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MZ3
Biotin LY6CBioLegend128003Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5BioLegend102419Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5BioLegend103131Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PEBioLegend136006Concentration: Dilution 1:50
Species: Mouse
Clone: APB5
LY6C-APCBioLegend128016Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD9-FITCBioLegend124808Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucoseCorning10-014-CV
192 mL MCDB201SigmaM6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024Sigma12303C
5 mL 100% ITS premixBD Bioscience354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphateSigmaA8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basicR&D systems3139-FB-025/CF
5 mL Pen/StrepCorning30-001-CI
500 µL GentamycinGibco15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.

Referanslar

  1. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  4. Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
  5. Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
  6. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  7. Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
  8. Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324(2009).
  9. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  10. Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
  11. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  12. Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30(2016).
  13. Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
  14. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
  15. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636(2018).
  16. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501(2019).
  17. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
  18. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).
  19. Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
  20. Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
  21. Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
  22. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  23. Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861(2018).
  24. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  25. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  26. Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
  27. Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890(2018).
  28. Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
  29. Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 162Stromal H crelerSVFPDGFRFIP lerAPC lerFACSmm nomanyetik BoncuklarYa Dokusunun Yeniden ekillenmesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır