Выделение субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из внутрибрюшных жировых депо мышей

Резюме

В этом протоколе описан технический подход к выделению субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из депо внутрибрюшной белой жировой ткани (WAT) мышей путем сортировки клеток, активируемых флуоресценцией, или отделения иммуномагнитных шариков.

Аннотация

Стромально-васкулярная фракция (SVF) белой жировой ткани (WAT) удивительно неоднородна и состоит из многочисленных типов клеток, которые функционально способствуют расширению и ремоделированию WAT во взрослом возрасте. Огромным препятствием для изучения последствий этой клеточной гетерогенности является невозможность легко выделить функционально различные субпопуляции клеток из WAT SVF для анализа in vitro и in vivo. Технология секвенирования одиночных клеток недавно выявила функционально различные фибровоспалительные и адипогенные субпопуляции периваскулярных клеток PDGFRβ+ во внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей. Фибровоспалительные предшественники (называемые «FIP») представляют собой неадипогенные клетки, продуцирующие коллаген, которые могут проявлять провоспалительный фенотип. Клетки-предшественники адипоцитов (APC) PDGFRβ+ обладают высокой адипогенной способностью как in vitro, так и in vivo после трансплантации клеток. В данной статье мы описываем несколько методов выделения этих субпопуляций стромальных клеток из внутрибрюшных депо WAT мышей. FIP и APC могут быть выделены с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) или с помощью технологии иммуномагнитных гранул на основе биотинилированных антител. Выделенные клетки могут быть использованы для молекулярного и функционального анализа. Изучение функциональных свойств субпопуляции стромальных клеток в изоляции расширит наши текущие знания о ремоделировании жировой ткани в физиологических или патологических условиях на клеточном уровне.

Введение

Белая жировая ткань (WAT) является основным местом хранения энергии у млекопитающих. В этой ткани адипоциты, или «жировые клетки», хранят избыточные калории в виде триглицеридов, упакованных в большие однокамерные липидные капли. Кроме того, адипоциты выделяют множество факторов, которые регулируют различные аспекты энергетического гомеостаза ^1,2,3. Адипоциты составляют основную часть объема ВАТ; однако адипоциты составляют менее 50% от общего числа клеток, обнаруженных в WAT ^4,5. Неадипоцитарный компартмент WAT, или ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все протоколы и процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному использованию и уходу за животными Юго-западного медицинского центра Техасского университета.

1. Выделение стромально-васкулярной фракции (СВФ) из гонадной белой жировой ткани

1. Рассеките гонадную белую жировую ткань у 6-8-недельных мышей и поместите жировые пакеты в 1x раствор PBS.
2. Объедините до 4 жировых депо (рекомендуется 2-4 депо от 1-2 мышей) и измельчите ткань в стакане объемом 10 мл, содержащем 200 мкл буфера для пищеварения (1x HBSS, 1,5% BSA и 1 мг/мл коллагеназы D).
3. Переложите измельченную салфетку в центрифужную проби....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот протокол описывает две стратегии, которые позволяют выделить отдельные популяции стромальных клеток из внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей. АПК и ФИП могут быть выделены с помощью FACS (рис. 1) или иммуномагнитного разделения шариков с биотинилированными антителами.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мышиная линия C57BL/6 является наиболее часто используемой линией мышей в исследованиях ожирения, вызванного диетой. Мыши C57BL/6 быстро набирают вес при посадке на диету с высоким содержанием жиров (HFD) и развивают некоторые характерные черты метаболического синдрома, связанные с ожирением .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainers	Fisher Scientific	352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	21040CV
5ml polypropylene tubes	Fisher Scientific	352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSS	Sigma	H8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)	Roche	11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.)	Fisher Scientific	BP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)	BioLegend	480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)	BioLegend	480019
100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads	BioLegend	480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)	eBioscience	553141
Antibodies
Biotin CD45	BioLegend	103103	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11
Biotin CD31	BioLegend	102503	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3
Biotin CD9	BioLegend	124803	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3
Biotin LY6C	BioLegend	128003	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5	BioLegend	102419	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5	BioLegend	103131	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PE	BioLegend	136006	Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5
LY6C-APC	BioLegend	128016	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4
CD9-FITC	BioLegend	124808	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucose	Corning	10-014-CV
192 mL MCDB201	Sigma	M6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024	Sigma	12303C
5 mL 100% ITS premix	BD Bioscience	354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate	Sigma	A8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basic	R&D systems	3139-FB-025/CF
5 mL Pen/Strep	Corning	30-001-CI
500 µL Gentamycin	Gibco	15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.