Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مكيفة لاشتقاق, توسيع, و cryopreserve خلايا البطانية الأوعية الدموية المجهرية التي تم الحصول عليها عن طريق التمييز بين الخلايا الجذعية متعددة القدرات الناجمة عن النشاط البشري, ودراسة خصائص حاجز الدم في الدماغ في نموذج الجسم الحي السابق.

Abstract

يمكن تمييز الخلايا البطاخلية الدقيقة في الدماغ (BMECs) عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريًا (iPSCs) لتطوير نماذج خلوية سابقة للدماغ (BBB) لدراسة حاجز الدم في الدماغ. ويوفر هذا البروتوكول المعدل خطوات تفصيلية لاشتقاق وتوسيع وتكرير BMECs من مراكز iPSCs البشرية باستخدام متبرع وكاشفات مختلفة عن تلك التي تم الإبلاغ عنها في البروتوكولات السابقة. يتم التعامل مع iPSCs مع الأساسية 6 المتوسطة لمدة 4 أيام، تليها 2 أيام من endothelial الإنسان خالية من المصل المتوسطة المتوسطة تكملها عامل النمو الليفي الأساسي، حمض الريتينويك، وتكملة B27. في اليوم 6، الخلايا هي تحت-مثقف على مصفوفة الكولاجين/فيبرومينكتين لمدة 2 أيام. يتم إجراء الكيمياء المناعية في اليوم 8 لتحليل علامة BMEC باستخدام CLDN5 و OCLN و TJP1 و PECAM1 و SLC2A1. يتم تنفيذ النشاف الغربي لتأكيد تعبير علامة BMEC ، وغياب SOX17 ، وهي علامة ادمرمة. ويتضح احتمال أنجيوجينيك مع فحص تنبت. يتم قياس المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم (TEER) باستخدام أقطاب عيدان الطعام ومقياس الفولث بدءاً من اليوم السابع. يتم قياس نشاط النقل Efflux لـ ATP ربط كاسيت subfamily B عضو 1 ATP ربط كاسيت subfamily عضو C 1 باستخدام قارئ لوحة متعددة في اليوم 8. ويؤكد الاشتقاق الناجح لـ BMECs وجود علامات الخلية ذات الصلة، وانخفاض مستويات SOX17، وإمكانية التشغية، ونشاط الناقل، وقيم TEER ~ 2000 Ω × سم2. يتم توسيع BMECs حتى اليوم 10 قبل تمرير على لوحات الكولاجين المطلية حديثا / فيبرومينكين أو cryopreserved. يوضح هذا البروتوكول أنه يمكن توسيع BMECs المشتقة من iPSC و تمريرها مرة واحدة على الأقل. ومع ذلك، فقد لوحظت قيم أقل من TEER وتعريب أقل لعلامات BMEC بعد الحفظ بالتبريد. يمكن استخدام BMECs في تجارب الثقافة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى (الخلايا العصبية ، glia ، pericytes)، في نماذج الدماغ ثلاثية الأبعاد (رقاقة الجهاز والهيدروجيل) ، لإضفاء الطابع الوعائي على الأعضاء في الدماغ ، ولدراسة الخلل في خلل BBB في الاضطرابات النفسية العصبية.

Introduction

وظيفة حاجز الدم في الدماغ
يشكل حاجز الدم في الدماغ (BBB) حدًا يحد من حركة المواد من الدم إلى الدماغ. وBBB يتكون من خلايا البطاخلية الدقيقة في الدماغ (BMECs) التي تشكل أحادية الطبقة بطانة الأوعية الدموية. BMECs، جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية، والخلايا العصبية، وال بيريكيتس، microglia، ومصفوفة خارج الخلية، تشكل وحدة الأوعية العصبية. BMECs لديها هيكل شبه الخلايا المنظمة بإحكام يسمح BBB للحفاظ على مقاومة كهربائية عالية عبر ال endothelial (TEER) ، مما يحد من الانتشار السلبي ويعمل كمؤشر على سلامة الحاجز1،2. BMECs أيضا البروتينات التي تساعد في الحركة عبر الخلية مثل الاندوس، transcytosis، والهجرة، فضلا عن البذخ من الكريات البيض خلال استجابة مناعية3. تعتمد BMECs على تدفق و efflux الناقلين للتغذية وإزالة النفايات المنتجات، من أجل الحفاظ على التوازن المثلي في الدماغ3. على سبيل المثال، المنقول الناقل الأسرة 2 عضو 1 (SLC2A1) هو ناقل تدفق المسؤولة عن حركة الجلوكوز عبر BBB4، في حين أن الناقلين efflux مثل ATP ربط الكاسيت B عضو 1 (ABCB1) و ATP ربط الكاسيت الفرعي C عضو 1 (ABCC1) هي المسؤولة عن العودة الركائز مرة أخرى إلى مجرى الدم3،5،6،7. ABCB1 ركائز تشمل المورفين, فيراباميل4, ومضادات الذهان مثل olanzapine وrisperidone8, في حين أن الناقل ABCC1 لديه مجموعة متنوعة من ركائز بما في ذلك المتقارنات كبريتات, vincristine, وglucuronide conjugates4.

تطبيق نماذج BBB في الاضطرابات النفسية
وقد تورط الخلل BBB في عدد من الاضطرابات العصبية والنفسية, بما في ذلك الفصام والاضطراب ثنائي القطب9,10. في الآونة الأخيرة ، iPSC المستمدة من النماذج الخلوية السابقة vivo تستخدم لاستجواب الأسس الخلوية والجزيئية من الاضطرابات النفسية ، ولكن هذه النماذج حاليا لا تأخذ في الاعتبار الدور المحتمل الذي تضطلع به neurovasculature11،12،13. هو افتراض أن السيتوكينات الالتهابية الطرفية المتداولة في الدم يمكن أن تؤثر سلبا على BBB14،15،16،17، ولكن هناك أيضا أدلة على18شبه الخلية،19،20،21،2122,عبر الخلية23,24,25,26,27,28,29, ومصفوفة خارج الخلية20,29,30,31,32 تشوهات تساهم في خلل BBB. يمكن أن يؤدي تعطيل BBB إلى دخول محتويات الدم إلى الدماغ وproenchyma وتفعيل الخلايا الفلكية و /أو microglia لإطلاق السيتوكينات البروينفلورية ، والتي بدورها تبدأ استجابة التهابية33 التي يمكن أن يكون لها آثار ضارة على الدماغ34. BMECs هي المكون الرئيسي لBBB ودراسة هيكل ووظيفة هذه الخلايا يمكن أن تعزز فهم الخلل BBB في الاضطرابات العصبية والنفسية.

نماذج BMEC البديلة
قبل تطوير بروتوكولات فعالة لاشتقاق BMECs من iPSCs1,6,35,36, كان الباحثون قد استخدموا BMECs37 الخالدة لدراسة وظيفة BBB. ومع ذلك، فشل العديد من هذه النماذج لتحقيق المرغوب فيه BBB الظاهريات، مثل هذا النطاق الفسيولوجية من القيم38،39. 2- والاستفادة من مراكز الـ iPSCs هي ميزة الاحتفاظ بالخلفية الوراثية للفرد الذي تُستمد منه الخلايا. يعمل العلماء بنشاط على إنشاء نماذج البيئة الدقيقة المستمدة من iPSC التي تُخص بنية ووظيفة الدماغ البشري. وقد طور الباحثون أساليب لاشتقاق BMECs التي تشبه هيكليا وفسيولوجيا BMECs الموجودة في الجسم الحي. تتطلب طرق الحصول على مجموعات منقّاة من BMECs المشتقة من iPSC عددًا من الخطوات المختلفة مع بروتوكولات يتم تحسينها في السنوات القليلة الماضية1و6و35و36. عموما, iPSC المشتقة من BMECs هي مثقف في الأساسية 6 (E6) المتوسطة لمدة 4 أيام, تليها 2 أيام في الإنسان endothelial المصل خالية من المتوسطة (hESFM) تكمل مع عامل النمو الليفي الأساسي (bFGF), حمض الريتينيك (RA), و B27 الملحق. ثم يتم استزراع الخلايا على الكولاجين الرابع (COL4) ومصفوفة فيبرومينيكتان (FN) للحصول على > 90٪ BMECs متجانسة1.

يتم تأكيد هوية BMECs عن طريق الفلوروس المغناطيسية التي تظهر التعبير المشترك لبروتينات BMEC بما في ذلك جزيء التصاق الخلايا البطانية الصفائح الدموية -1 (PECAM1) وSLC2A1 والبروتينات الضيقة مثل وصلة الوصل الضيقة البروتين 1 (TJP1) ، occludin (OCLN) ، وكلاودن -5 (CLDN5)6. وقد استخدمت مقايسات النتـر للتأكد من الإمكانات الـ أوعية للـ iPSC المشتقة من BMECs. 6 يتم تقييم سلامة BBB من BMECs من خلال وجود قيم فيزيولوجية في المختبر TEER (~20000Ω × سم2)37 ونشاط قابل للقياس لنقل efflux مثل ABCB1 وBCC11،6،36. وقد أدت التطورات المنهجية الأخيرة من قبل مجموعة ليبمان إلى بروتوكولات BMEC المشتقة من iPSC مع تقليل التغير التجريبي وتعزيز قابلية التكاثر1. ومع ذلك، لا يُعرف ما إذا كان من الممكن توسيعها وتجاوزها إلى ما بعد مرحلة الاستزراع الفرعي. يهدف بروتوكولنا المعدل إلى معالجة هذه المشكلة عن طريق تمرير BMECs المشتقة من iPSC إلى ما بعد اليوم الثامن وتقييم ما إذا كان يمكن توسيعها بشكل أكبر للاحتفاظ بخصائص BBB بعد الحفظ بالتبريد. في حين لم تصف أي دراسات تمرير BMECs المشتقة من iPSC ، يوجد بروتوكول للحفظ بالتبريد BMEC الذي يحتفظ بخصائص BBB الفسيولوجية بعد خضوعه لدورة التجميد40. ومع ذلك، فإنه غير معروف BMECs ما بعد التبريد يمكن أن يكون ممر والاحتفاظ بخصائص BBB.

BMECs المستمدة من iPSCs باستخدام بروتوكول ليبمان وقد استخدمت لنموذج اضطراب BBB في الاضطرابات العصبية مثل مرض هنتنغتون7. وقد استخدمت هذه BMECs مشتقة من iPSC أيضا للتحقيق في آثار العدوى البكتيرية مثل التهاب السحايا Neisseria أو المجموعة B العقدية على تعطيل حاجز CSF الدم وBBB على التوالي41,42. أيضا، باستخدام BMECs المشتقة من iPSC من مرضى متلازمة الحذف 22q الذين يعانون من الفصام، لاحظ الباحثون زيادة في جزيء التصاق بين الخلايا-1 (ICAM-1)، وهو جزيء التصاق كبير في BMECs التي تساعد في التوظيف والبذخ من الكريات البيض في الدماغ43. هذه الدراسات مجتمعة، تثبت فائدة BMECs المشتقة من iPSC لدراسة اضطراب BBB في الاضطرابات العصبية والنفسية المعقدة.

Protocol

تمت إعادة برمجة iPSCs الإنسان من الخلايا الليفية من المتبرعين الأصحاء باستخدام بروتوكول وافق عليه المجلسين مراجعة المؤسسات من مستشفى ماساتشوستس العام ومستشفى ماكلين, وتتميز كما وصف في الدراسات السابقة44,45,46.

ملاحظة: باختصار، تم إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى iPSC عبر إعادة برمجة البرمجة الجينية القائمة على مرنا47. تم الاحتفاظ iPSCs في الخلايا الجذعية المتوسطة (SCM) (انظر قائمة المواد) وتخزينها في كثافة ~ 1.2 × 102 خلايا / مل مع 1 مل من SCM، 10 ميكرومتر مع مثبط كيناز البروتين المرتبط بالرخو (ROCKi) Y-27632، و10٪ (v/v) كبريتيد ثنائي الفينيل (DMSO)، في قارورة المبردة في النيتروجين السائل عند -160 درجة مئوية. 10- تُنفذ جميع الإجراءات التالية أدناه في خزانة للسلامة الأحيائية ما لم يُذكر خلاف ذلك.

1. الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة التخفيف وطلاء لوحة

  1. المخفف (1:50) عامل النمو خفض غشاء الطابق السفلي مصفوفة تنقية من ورم Engelbreth-Holm-Swarm في Dulbecco 'sعدل النسر المتوسط (DMEM) دون الفينول الأحمر.
  2. معطف لوحات ثقافة الخلية مع كمية مناسبة من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المخفف (أي، 6-جيدا لوحة = 1mL، 12-جيدا لوحة = 0.5 مل) واحتضان هذه اللوحات في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.

2. صيانة iPSC

ملاحظة: الحد الأقصى للالتقاء في البئر في لوحة 6-جيدا مسطحة القاع هو ~ 1.2 × 106 الخلايا.

  1. ذوبان iPSCs cryopreserved في SCM مع 10 μM Y-27632 ولوحة على لوحة 6-well المغلفة مع عامل النمو المخفف مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
  2. الحفاظ على iPSCs في SCM مع 10 ميكرومتر Y-27632 لأول 24 ساعة بعد ذوبان الجليد. التبديل إلى المتوسط الطازج بعد 24 ساعة.
  3. الحفاظ على iPSCs في SCM حتى الخلايا تصل إلى 80-90٪ التقاء قبل passaging.
    1. احسب عدد الـ iPSCs التي ستكون هناك حاجة للتمايز عن طريق ضرب الكثافة المطلوبة للتمايز (15,600 خلية/سم2)على مساحة سطح البئر. لطبقة مسطحة القاع 6 جيدا، مضاعفة 15600 خلية / سم2 في 9.6 سم2 لمجموع 149760 الخلايا / جيدا.
  4. للمرور، اغسل الخلايا بمحلول الملح المتوازن من هانكس (HBBS). ثم، احتضان الخلايا مع حمض الإثيلين غير الأنزيمية (EDTA) (انظر قائمة المواد) لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
    1. استخدم مكشطة الخلايا لرفع بلطف قبالة الخلايا. جمع الخلايا في SCM جديدة.
    2. خلايا لوحة على لوحات ثقافة الخلية المغلفة مع SCM المخفف والحفاظ على الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.3 أو تخزينها في ~ 1.2 × 106 الخلايا / مل في 1 مل من SCM، 10 μM Y-27632، و 10٪ DMSO (الخامس / الخامس) في قارورات المبردة في النيتروجين السائل في درجة حرارة -160 درجة مئوية.

3- تمييز مراكز iPSCs إلى BMECs

ملاحظة: EDTA غير انزيمية يفصل الخلايا إلى كتل. إنزيمية EDTA (انظر جدول المواد) يفصل الخلايا في تعليق خلية واحدة. حمض الريتينويك (RA) يجب أن تكون محمية من الضوء.

  1. غسل iPSCs مرة واحدة مع محلول الفوسفات العازلة في دولبيككو (DPBS). احتضان مع EDTA الأنزيمية (1 مل لطبقة 6-جيدا، 0.5 مل ل12-جيدا لوحة، و 0.25 مل ل24-جيدا لوحة) لمدة 5 دقائق تقريبا في 37 درجة مئوية لتحقيق تعليق خلية واحدة.
  2. جمع الخلايا والطرد المركزي في 300 × ز (قوة الطرد المركزي النسبية) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الكريات خلية resuspend في SCM تحتوي على 10 μM Y-27632.
  3. تحديد كثافة الخلايا باستخدام عداد الخلايا تريبان الأزرق والآلي أو جهاز قياس الهيموسيت. خلايا الصفيحة بكثافة 15,600 خلية/سم2 أو 149,760 خلية/بئر من لوحة مسطحة القاع 6 جيدا (مع مساحة سطح 9.6 سم2/well) في SCM تحتوي على 10 ميكرومتر-Y-27632 لمدة 24 ساعة.
  4. بدء التمايز بعد 24 ساعة عن طريق تغيير SCM إلى E6 المتوسطة. تغيير E6 المتوسطة يوميا لمدة 4 أيام المقبلة.
  5. في اليوم 4 من التمايز، استبدال E6 المتوسطة مع hESFM تستكمل مع المخفف (1:200) B27 الملحق، 20 نانوغرام / مل bFGF، و 10 ميكرومتر RA. لا تقم بتغيير هذه الوسيلة للـ 48 ساعة القادمة.
  6. إعداد 200 مل من hESFM مع المخفف (1:200) B27، مزيج 1 مل من 50x الملحق B27 المركزة إلى 199 مل من hESFM.
  7. إعداد 20 نانوغرام / مل من bFGF عن طريق إعادة تشكيل 50 ميكروغرام من bFGF في 250 ميكرولتر من تريس العازلة (5 mM تريس، 7.6، 150 mM NaCl) لجعل 200 ميكروغرام / مل حل الأسهم. إعداد 200 مل من hESFM تحتوي على 20 نانوغرام / مل bFGF عن طريق خلط 20 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل bFGF مع 200 مل من hESFM.
  8. إعداد 10 μM RA عن طريق إجراء أول 40 ملغ / مل من حل الأسهم RA بإضافة 2.5 مل من DMSO إلى 100 ملغ من مسحوق RA. تمييع هذا التركيز إلى 3 ملغ / مل لجعل 10 mM حل الأسهم. إعداد 200 مل من hESFM تحتوي على 10 ميكرومتر RA عن طريق خلط 200 ميكرولتر من 10μM RA في 200 مل hESFM.

4. طلاء الكولاجين الرابع (COL4) ومصفوفة فيبرومينيكين (FN) لتنقية BMEC المشتقة من iPSC

  1. إضافة 2 مل من الماء المعقم إلى 2 ملغ من FN لجعل 1 ملغ / مل FN حل الأسهم. إضافة 5 مل من الماء المعقم إلى 5 ملغ من COL4 لجعل 1 ملغم / مل COL4 حل الأسهم.
    1. السماح FN للذوبان لمدة 30 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية و COL4 لتذوب في درجة حرارة الغرفة.
  2. تخفيف FN حل المخزون في المياه المعقمة إلى تركيز نهائي من 100 ميكروغرام / مل وCOL4 حل المخزون إلى تركيز النهائي من 400 ميكروغرام / مل.
  3. معطف لوحات المطلوب (6-جيدا لوحة = 1 مل من حل COL4 /FN، 12-جيدا لوحة = 0.5 مل، 24-جيدا لوحة = 0.25 مل، و 12-transwell لوحة مرشحة = 0.25 مل) مع خليط من 400 ميكروغرام / مل COL4 و 100 μg / mL FN.
  4. ألواح احتضان لمدة لا تقل عن ساعتين أو بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية؛ للوحات ترانسويل المصفاة، ينصح بحد أدنى من 4 ساعات.

5- الاستزراع الفرعي وتنقية مراكز BMEC المشتقة من iPSC

ملاحظة: قد يستغرق الاحتضان مع EDTA الأنزيمية أكثر من 15 دقيقة اعتمادًا على التقاء الخلايا في اليوم السادس من التمييز.

  1. في اليوم السادس من التمايز، يغسل الخلايا مرتين مع DPBS. احتضان مع 1 مل من EDTA الأنزيمية لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة.
  2. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الكريات خلية ريسوسينيد مع hESFM الطازجة مع المخفف (1:200) ملحق B27, 20 نانوغرام/ مل bFGF, و 10 μM RA.
  3. خلايا البذور على لوحات مغلفة بمزيج من 400 ميكروغرام/مل COL4 و100 ميكروغرام/مل FN. خلايا البذور باستخدام نسبة 1 بئر من لوحة 6-جيدا إلى 3 آبار من لوحة 12 جيدا، 3 آبار من لوحة 12 ترانسويل المصفاة، أو 6 آبار من لوحة 24 جيدا.
  4. بذور iPSCs غير متمايزة من نفس خط الخلية على COL4/FN المغلفة 12-transwell لوحة المصفاة كتحكم سلبي لتحليل TEER.
  5. بعد 24 ساعة من زراعة دون، تغيير المتوسطة إلى hESFM مع ملحق B27 فقط. لا توجد تغييرات متوسطة مطلوبة بعد هذه الخطوة.

6. فحص براعم

  1. جمع اليوم 8 iPSC المستمدة BMECs وبذرتها في 100،000 خلية / جيدا على لوحة مسطحة القاع 24 جيدا المغلفة حديثا مع 200 ميكرولتر / سم2 من مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
  2. علاج هذه الخلايا مع hESFM مع المخفف (1:200) B27 و 40 نانوغرام / مل من عامل النمو البطانية الوعائية A (VEGFA165).
  3. مراقبة الخلايا كل 24 ساعة وتغيير المتوسطة كل يومين.

7. الكيمياء المناعية (ICC)

ملاحظة: يتم تنفيذ ICC على لوحات مسطحة القاع 24-جيدا.

  1. بعد 48 ساعة من زراعة فرعية (اليوم 8) ، وغسل الخلايا مرتين مع DPBS. قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ شبه شكلي (PFA) لمدة 20 دقيقة.
  2. غسل الخلايا ثلاث مرات مع DPBS، 5 دقائق لكل غسل. خلايا ما قبل الكتلة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في DPBS مع مصل حمار 5٪ و 0.3٪ تريتون X-100 (v/v).
  3. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية: الماوس المضادة للإنسان-PECAM1 (1:100، الأسهم 0.5 ملغ /مل)، أرنب المضادة للإنسان-TJP1 (1:200، الأسهم 0.53 ملغ/مل)، الماوس المضادة للإنسان CLDN5 (1:200، الأسهم 0.5 ملغ / مل), الماوس المضادة للإنسان-OCLN (1:200, الأسهم 0.5 ملغ /مل), والأرانب المضادة للإنسان-SLC2A1 (1:100, الأسهم 0.2 ملغ/مل) في DPBS تحتوي على 5٪ مصل الحمير بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    1. شطف الخلايا مرة واحدة مع DPBS ثم يغسل خمس مرات لمدة 5 دقائق لكل غسل مع DPBS.
  4. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية: حمار المضادة للأرانب اليكسا فلور 555 (1:200) والحمار المضادة للماوس 488 (1:200) في DPBS تحتوي على 5٪ مصل حمار لمدة 1 ساعة.
  5. بعد هذا الحضانة، إضافة Hoechst 33342 ثلاثي هيدروكلوريد ثلاثي هيدروهيد المخفف (1:1000) في DPBS لمدة 10 دقائق.
    1. إزالة حل Hoechst 33342 وشطف مرة واحدة مع DPBS وغسل أربع مرات مع DPBS لمدة 5 دقائق لكل غسل.
  6. تصور الخلايا على المجاهر fluorescence للبحث عن التعبير وتوطين صانعي الخلايا.

8. TEER القياس والتحليل

ملاحظة: تم تجهيز الألواح المصفاة من 12-Transwell من كورنينج بمرشحات تتكون من أغشية بولي إيثيلين تيريفثاليت 1.12 سم2 و 0.4 ميكرومتر. ويتم الحصول على قياسات الـ TEER بالتقنية (3 لكل بئر) والمضاعفة البيولوجية (3 آبار لكل خط خلية و/أو حالة).

  1. بعد 24 ساعة من زراعة فرعية (اليوم 7)، وقياس TEER باستخدام أقطاب عيدان الطعام ومقياس فولتوهممتر كل 24 ساعة. الرجوع إلى دليل المستخدم voltohmmeter للحصول على تعليمات محددة بشأن الحصول على القياسات.
    1. لقياس TEER، قم بشحن جهاز القياس في الليلة السابقة. مسح طفيفة الصك وأقطاب عيدان الطعام مع 70٪ الإيثانول قبل وضعها في غطاء محرك السيارة السلامة.
    2. قم بتشغيل الطاقة ومعايرة مقياس أوم كما أوصت به الشركة المصنعة.
    3. سد في أقطاب عيدان الطعام وشطف أقطاب مع 70٪ الإيثانول تليها DPBS.
    4. ضع القطب الطرفي الأقصر في إدراج البئر العابر (الغرفة الزهية) والنهاية الأطول في الغرفة القاعدية.
    5. قياس أولاً بئر فارغة التي يتم المغلفة مع COL4/FN فقط. ثم قياس الآبار الأخرى.
    6. شطف بسرعة أقطاب عيدان الطعام مع 70٪ الإيثانول تليها DPBS عند قياس ظروف مختلفة (أي قياس خطوط الخلايا المختلفة).
  2. بعد أن تم تسجيل جميع القياسات (في Ω) ، شطف أقطاب عيدان الطعام مع 70 ٪ من الإيثانول ثم الماء العقيم. قم بمسح القطب برفق واتركه جافًا في غطاء محرك السيارة الآمن.
  3. متوسط قيم TEER ثلاثية الليكات (في Ω) من البئر الفارغ وطرح قيمة المتوسط هذه من كل قيمة من قيمة TEER الأولية حسب الحالة.
    1. متوسط القيم المطروحة وضربها بـ 1.12 سم2 (المساحة السطحية لإدراج 12-transwell).
    2. استخدم القيم المحولة من الخطوة 6 لإنشاء الرسم البياني الذي يظهر قيمة TEER والأخطاء القياسية لكل يوم من قياس TEER.

9. نشاط وتحليل الناقل إيفلوكس

ملاحظة: يتم إجراء مقايسة نشاط النقل Efflux على لوحة مسطحة القاع 24-جيدا. وتشمل ناقلات إيفلوكس ذات الاهتمام ABCB1 وABCC1. ويوصى بأن يتم تنفيذ كل حالة في ثلاث 33 مع آبار التحكم (أي آبار فارغة دون مثبطات كل منها).

  1. بعد 48 ساعة من الاستزراع الفرعي (اليوم 8)، احتضان الخلايا مع 10 ميكرومتر فالسبودار (مثبط ABCB1) أو 10 μM MK571 (مثبطات ABCC1) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    1. إعداد 10 mM فالسبودار المخزون عن طريق حل 5 ملغ من مسحوق (1214.64 ز /مول) في 412 ميكرولتر من DMSO وتمييع لتركيز العمل من 10 μM. على سبيل المثال، لجعل 10 مل من hESFM مع 10 μM Valspodar، مزيج 10 ميكرولتر من 10 mM فالسبودار الأسهم مع 10 مل من hESFM.
    2. إعداد 10 mM MK571 المخزون عن طريق حل 5 ملغ مسحوق (537.07 غرام / مول) في 931 ميكرولتر وتمييع لتركيز العمل من 10 μM. على سبيل المثال، لجعل 10 مل من hESFM مع 10 μM MK571، مزيج 10 ميكرولتر من 10 mM MK571 الأسهم مع 10 مل من hESFM.
  2. بعد 1 ساعة، واحتضان الخلايا مع 10 ميكرومتر رودامين 123 (الركيزة ABCB1) أو 10 μM 2'، 7'-dichlorhydroflucecein diacetate (H2DCFDA، الركيزة ABCC1) مع أو بدون مثبطات كل منها لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
    1. إعداد 10 mM rhodamine 123 عن طريق حل 10 ملغ من مسحوق (380.82 غرام /مول) في 875 ميكرولتر من DMSO وتمييع لتركيز العمل من 10 ميكرومتر. على سبيل المثال، لجعل 10 مل من hESFM مع 10 ميكرومتر رودامين 123، مزيج 10 ميكرولتر من 10 mM rhodamine 123 الأسهم مع 10 مل من hESFM.
    2. إعداد 10 mM H2DCFDA عن طريق حل 50 ملغ من مسحوق (487.29 غرام /مول) في 10.26 مل من DMSO وتمييع لتركيز العمل من 10 μM. على سبيل المثال، لجعل 10 مل من hESFM مع 10 ميكرومتر رودامين 123، مزيج 10 ميكرولتر من 10 mM rhodamine 123 الأسهم مع 10 مل من hESFM.
  3. غسل الخلايا مرتين مع 0.5 مل من DPBS وlyse باستخدام DPBS تحتوي على 5٪ تريتون X (v/v).
  4. قياس الفلورية للخلايا lysed باستخدام قارئ لوحة متعددة أو microplate (انظر قائمة المواد).
    1. تعيين أداة قارئ لوحة الفلورسنت إلى 485 نانمتر الإثارة و 530 نانومتر الانبعاثات وقياس الفلورينس في هذه الأطوال الموجية.
    2. بالنسبة للآبار غير المستخدمة في مقايسة الناقل، قم بغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS قبل تحديدها بنسبة 4٪ PFA للحصول على كمية نواة الخلية.
  5. تحتضن الخلايا مع Hoechst 33342 ثلاثي هيدروكلوريد ثلاثي هيدروكلوريد المخفف (1:1000) في DPBS لمدة 10 دقائق. صورة حقول بصرية متعددة في كل بئر لحساب متوسط تعداد نوات الخلايا باستخدام المجاهر الفلوريسانس.
  6. عد النوى باستخدام فيجي وتطبيع قيم الفلوريسنس على أساس كل خلية لهذه التهم.
    1. حساب متوسط تراكم الفلورس عن طريق طرح قيمة تراكم الفلورسين الخام لكل شرط من قيمته الفارغة الخاصة به.
    2. متوسط القيم المطروحة لكل شرط.
    3. تقسيم متوسط القيم من الخطوة 9.6.1 على متوسط عدد الخلايا. استخدم هذه القيم لتطبيع قيم الفلوريسنس على أساس كل خلية.
    4. استخدم القيم المُطَرَّتة لتوليد تمثيل رسومي لكل حالة من حالات المثبطات وإجراء أي تحليل إحصائي ضروري.

10. Passaging ، والتوسع ، والتبريد حجز BMECs

  1. تجديد الثقافات 8 BMEC مع hESFM الطازجة تستكمل مع المخفف (1:200) B27 والسماح للخلايا لتوسيع لمدة يومين أكثر على مصفوفة COL4/FN.
  2. معطف لوحة جديدة 12-Transwell تصفية و 24-جيدا لوحة مسطحة القاع مع 400 ميكروغرام / مل COL4 و 100 ميكروغرام / مل FN واحتضان لمدة 4 ساعات.
  3. في اليوم 10، وغسل الخلايا مع DPBS واحتضان مع 1 مل من EDTA الأنزيمية لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة.
  4. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    1. للتبريد هذه الخلايا, الكريات خلية ريسوسينيد مع hESFM الطازجة مع 30٪ مصل البقرة الجنين (FBS) و 10٪ DMSO.
    2. تخزين BMECs المشتقة من iPSC في قوارير مبردة في حاوية isopropanol لأول 24 ساعة عند -80 درجة مئوية ، ثم ضعها في النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل عند -160 درجة مئوية.
    3. لتمرير هذه الخلايا، الكريات الخلية resuspend مع hESFM الطازجة تستكمل مع المخفف (1:200) B27.
  5. خلايا البذور على لوحات مغلفة أعدت في الخطوة 10.2. خلايا البذور باستخدام نسبة 1 بئر من لوحة 6-جيدا إلى 3 آبار من لوحة 12 ترانسويل المصفاة وإلى 6 آبار من لوحة 24 جيدا. السماح للخلايا بالنمو والتوسع لمدة 24 ساعة.
  6. في يوم 11، قياس TEER باتباع الخطوات المذكورة في الخطوة 8.
  7. في اليوم 12، قم بإجراء ICC باتباع الخطوات المذكورة في الخطوة 9.
  8. لذوبان BMECs المبردة، ضع قوارير التبريد في ماء دافئ أو حمام حبة في 37سC. ثم نقل BMECs المذاب إلى 5 مل من hESFM تكملها مع المخفف (1:200) B27.
    1. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. Resuspend الخلايا في hESFM تكملها مع المخفف (1:200) B27، 10 μM RA و 10 μM Y-27632.
    2. بعد 24 ساعة، التبديل المتوسطة إلى hESFM تكملها مع المخفف (1:200) B27 و 10 μM Y-27632 دون RA.

النتائج

تمايز BMEC
وينبغي اتباع بعض الخطوات الهامة في هذا البروتوكول بدقة(الشكل 1). E6 متوسطة الاستخدام في اليوم 1 مهم، لأنه غالبا ما يستخدم لاشتقاق نسب العصبية من iPSCs خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن تسفر عن نتائج استنساخ عبر خطوط الخلايا المتعددة36. وثمة خطوة هام?...

Discussion

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

في هذا البروتوكول، قمنا بإجراء بعض التعديلات في استخدام مصفوفة خارج الخلية شائعة الاستخدام والخلايا وسائل الإعلام ثقافة خلال زراعة iPSC لاشتقاق BMECs(الشكل 1). لم تؤثر هذه التغييرات على القدرة على اشتقاق BMECS من iPSCs ا?...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة العقلية جوائز البحوث السلوكية البيولوجية للعلماء الجدد المبتكرين (BRAINS) جائزة R01MH113858 (إلى R.K.) ، وهي المعاهد الوطنية للصحة جائزة KL2 TR002542 (PL). A المعهد الوطني للصحة العقلية جائزة تطوير العلماء السريرية K08MH086846 (لR.K.) ، وسيدني R Baer الابن منحة مؤسسة (ل. ل) دوريس الخيرية جائزة تطوير العلماء السريرية (لR.K.) ، وريان ليخت سانج ثنائية القطب مؤسسة (إلى R.K.) ، وفيليس & مؤسسة جيروم لايل رابابورت (إلى R.K.)، ومعهد هارفارد للخلايا الجذعية (إلى R.K.) وستيف ويليس وإليسا فرويد (إلى R.K.). نشكر الدكتورة آني كاثروريا على قراءتها النقدية وردود الفعل على المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetateSigma AldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgGLife TechnologiesA-31572
B27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAbCell Signaling3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Collagen IV from human placentaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)Corning353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)Corning353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)Corning3460
Countess slidesThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (without phenol red)Thermo Fisher Scientific A1413202
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
Donkey serumSigma AldrichD9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Fisher Scientific14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)Thermo Fisher ScientificA1516401
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronectinSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium Thermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Human endothelial serum-free mediumThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificN/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Services15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate ReaderPerkin ElmerN/A
Recombinant Human VEGF 165Peprotech100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)Peprotech100-18B
Retinoic acidSigma AldrichR2625-100MG
Rhodamine 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Cell Signaling81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Versene solutionThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris/Thermo Fisher Scientific1254

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Barichello, T. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165 microvascular passaging

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved