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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine angepasste Methode zur Ableitung, Erweiterung und Kryokonservierung mikrovaskulärer Endothelzellen des Gehirns, die durch Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, und zur Untersuchung der Eigenschaften der Bluthirnschranke in einem Ex-vivo-Modell.

Zusammenfassung

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs) im Gehirn können von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unterschieden werden, um ex vivo-Zellmodelle zur Untersuchung der Funktion der Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu entwickeln. Dieses modifizierte Protokoll enthält detaillierte Schritte zum Ableiten, Erweitern und Kryokonservieren von BMECs von menschlichen iPSCs, die einen anderen Spender und Reagenzien verwenden als in früheren Protokollen. iPSCs werden mit essentiellen 6 Medium für 4 Tage behandelt, gefolgt von 2 Tagen menschlichen endothelialen Serum-freien Kulturmedium mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor, Retinsäure, und B27 Ergänzung ergänzt. An Tag 6 werden die Zellen 2 Tage lang auf eine Kollagen-Fibronectin-Matrix subkultiviert. Die Immunzytochemie wird an Tag 8 für die BMEC-Markeranalyse mit CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 und SLC2A1 durchgeführt. Western Blotting wird durchgeführt, um den BMEC-Markerausdruck und das Fehlen von SOX17, einem endodermalen Marker, zu bestätigen. Angiogenic Potenzial wird mit einem keimenden Assay demonstriert. Der transendotheliale elektrische Widerstand (TEER) wird ab Tag 7 mit Essstäbchenelektroden und Voltohmmeter gemessen. Die Efflux-Transporteraktivität für die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B-Mitglied 1 und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C-Mitglied 1 wird an Tag 8 mit einem Mehrplattenleser gemessen. Die erfolgreiche Ableitung von BMECs wird durch das Vorhandensein relevanter Zellmarker, niedrige SOX17-Spiegel, angiogenes Potenzial, Transportaktivität und TEER-Werte Ω x cm2bestätigt. BMECs werden bis zum 10. Tag erweitert, bevor sie auf frisch beschichtete Kollagen-/Fibronectinplatten oder Kryopreservede übergeben werden. Dieses Protokoll zeigt, dass iPSC-abgeleitete BMECs mindestens einmal erweitert und durchlaufen werden können. Nach der Kryokonservierung wurden jedoch niedrigere TEER-Werte und eine schlechtere Lokalisierung von BMEC-Markern beobachtet. BMECs können in Co-Kultur-Experimenten mit anderen Zelltypen (Neuronen, Glia, Pericyten), in dreidimensionalen Gehirnmodellen (Organ-Chip und Hydrogel), zur Vaskularisierung von Hirnorganoiden und zur Untersuchung von BBB-Dysfunktion bei neuropsychiatrischen Störungen eingesetzt werden.

Einleitung

Blut-Hirn-Barriere-Funktion
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) bildet eine Grenze, die die Bewegung von Substanzen aus dem Blut zum Gehirn einschränkt. Die BBB besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen (BMECs) des Gehirns, die eine Monoschicht bilden, die die Vaskulatur auskundaufzen. BMECs bilden zusammen mit Astrozyten, Neuronen, Pericyten, Mikroglia und extrazellulärer Matrix die neurovaskuläre Einheit. BMECs haben eine streng regulierte parazelluläre Struktur, die es dem BBB ermöglicht, einen hohen transendotheliaalen elektrischen Widerstand (TEER) aufrechtzuerhalten, der die passive Diffusion begrenzt und als Indikator für die Barriereintegrität1,2dient. BMECs haben auch Proteine, die bei der transzellulären Bewegung wie Endozytose, Transzytose und Transmigration sowie Extravasation von Leukozyten während einer Immunantwort unterstützen3. BMECs sind auf Zustrom- und Efflux-Transporter für die Ernährung und Entfernung von Abfallprodukten angewiesen, um ein heimelatisativer Gleichgewicht im Gehirn zu halten3. So ist beispielsweise die Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1) ein Zustromtransporter, der für die Bewegung von Glukose über die BBB4verantwortlich ist, während Efflux-Transporter wie die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B Member 1 (ABCB1) und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C Member 1 (ABCC1) für die Rückführung von Substraten in den Blutkreislauf verantwortlich sind3,5,6,7. ABCB1-Substrate sind Morphin, Verapamil4und Antipsychotika wie Olanzapin und Risperidon8, während der ABCC1-Transporter eine Vielzahl von Substraten hat, einschließlich Sulfatkonjugate, Vincrinin und Glucuronid-Konjugate4.

Anwendung von BBB-Modellen bei psychiatrischen Störungen
BBB Dysfunktion wurde in eine Reihe von neurologischen und psychiatrischen Störungen verwickelt, einschließlich Schizophrenie und bipolare Störung9,10. Kürzlich werden iPSC-abgeleitete ex vivo-Zellmodelle verwendet, um die zellulären und molekularen Grundlagen psychiatrischer Störungen zu hinterfragt, aber diese Modelle berücksichtigen derzeit nicht die potenzielle Rolle, die die Neurovaskulatur11,12,13spielt. Es wird vermutet, dass periphere entzündliche Zytokine, die im Blut zirkulieren, die BBB14,15,16,17, aber es gibt auch Beweise für parazelluläre18,19,20,21,22, transzellulär23,24,25,26,27,28,29und extrazelluläre Matrix20,29,30,31,32 Anomalien, die zur BBB Dysfunktion beitragen. Eine Störung des BBB kann dazu führen, dass der Inhalt des Blutes in das Blut parenchyma eintritt und aktivierte Astrozyten und/oder Mikroglia, um proinflammatorische Zytokine freizusetzen, die wiederum eine Entzündungsreaktioninitiieren 33, die schädliche Auswirkungen auf das Gehirn haben kann34. BMECs sind die primäre Komponente der BBB und die Untersuchung der Struktur und Funktion dieser Zellen kann das Verständnis der BBB Dysfunktion bei neurologischen und psychiatrischen Störungen verbessern.

Alternative BMEC-Modelle
Vor der Entwicklung effizienter Protokolle zur Ableitung von BMECs aus iPSCs1,6,35,36hatten Forscher verewigte BMECs37 eingesetzt, um die BBB-Funktion zu untersuchen. Viele dieser Modelle erreichten jedoch keine wünschenswerten BBB-Phänotypen, wie einen physiologischen Bereich von TEER-Werten38,39. Die Verwendung von iPSCs hat den Vorteil, dass der genetische Hintergrund des Individuums, aus dem die Zellen abgeleitet sind, erhalten bleibt. Wissenschaftler arbeiten aktiv an der Entwicklung von iPSC-abgeleiteten ex-vivo-Mikroumweltmodellen, die die Struktur und Funktion des menschlichen Gehirns rekapitulieren. Die Forscher haben Methoden entwickelt, um BMECs abzuleiten, die strukturell und physiologisch ähnlich wie BMECs sind,die in vivo gefunden werden. Methoden zur Gewinnung gereinigter Populationen von iPSC-abgeleiteten BMECs erfordern eine Reihe verschiedener Schritte, wobei Protokolle in den letzten Jahren optimiert wurden1,6,35,36. Im Allgemeinen werden iPSC-abgeleitete BMECs in Essential 6 (E6) Medium für 4 Tage kultiviert, gefolgt von 2 Tagen in humanen endothelialen Serum-freien Medium (hESFM) ergänzt mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor (bFGF), Retinsäure (RA), und B27 Ergänzung. Die Zellen werden dann auf einer Kollagen-IV-Matrix (COL4) und Fibronectin (FN) kultiviert, um >90% homogene BMECs1zu erhalten.

Die Identität von BMECs wird durch Immunfluoreszenz bestätigt, die die Koexpression von BMEC-Proteinen einschließlich Thrombozyten-Endothel-Zelladhäsionsmolekül-1 (PECAM1), SLC2A1 und engen Knotenproteinen wie engem Knotenprotein 1 (TJP1), Occludin (OCLN) und Claudin-5 (CLDN5)6zeigt. Sprouting-Assays wurden verwendet, um das angiogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten BMECs zu bestätigen. 6 Die BBB-Integrität von BMECs wird durch das Vorhandensein physiologischer in vitro TEER-Werte (2000 x cm2)37 und messbare Aktivität für Efflux-Transporter wie ABCB1 und ABCC11,6,36. Jüngste methodische Fortschritte der Lippmann-Gruppe haben zu iPSC-abgeleiteten BMEC-Protokollen mit reduzierter experimenteller Variabilität und verbesserter Reproduzierbarkeit1geführt. Es ist jedoch nicht bekannt, ob sie über die Unterkultivierungsstufe hinaus erweitert und durchdrungen werden können. Unser modifiziertes Protokoll zielt darauf ab, dieses Problem zu lösen, indem iPSC-abgeleitete BMECs über Tag 8 hinaus übergeben und bewertet werden, ob sie weiter ausgebaut werden können, um BBB-Eigenschaften nach der Kryokonservierung beizubehalten. Obwohl keine Studien die Passage von iPSC-abgeleiteten BMECs beschrieben haben, existiert ein Protokoll für die BMEC-Kryokonservierung, das physiologische BBB-Eigenschaften behält, nachdem sie einen Frost-Tau-Zyklus40durchlaufen haben. Es ist jedoch nicht bekannt, dass BMECs nach der Kryokonservierung durchundlassen und BBB-Eigenschaften behalten können.

BMECs, die von iPSCs mit dem Lippmann-Protokoll abgeleitet wurden, wurden verwendet, um BBB-Störungen bei neurologischen Erkrankungen wie der Huntington-Krankheit zu modellieren7. Solche iPSC-abgeleiteten BMECs wurden auch verwendet, um die Auswirkungen von bakteriellen Infektionen wie Neisseria meningitidis oder Gruppe B Streptococcus auf Störung der Blut-CSF-Barriere und BBB bzw.41,42zu untersuchen. Auch mit iPSC-abgeleiteten BMECs von 22q-Deletion-Syndrom-Patienten mit Schizophrenie, Forscher beobachteten eine Zunahme der interzellulären AdhäsionMolekül-1 (ICAM-1), ein wichtiges Adhäsionsmolekül in BMECs, die bei der Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten in das Gehirn43helfen. Zusammengenommen zeigen diese Studien den Nutzen von iPSC-abgeleiteten BMECs für die Untersuchung von BBB-Störungen bei komplexen neuropsychiatrischen Störungen.

Protokoll

Human ePSCs wurden von den Fibroblasten gesunder Spender mit einem von den Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital und McLean Hospital genehmigten Protokoll umprogrammiert und wie in früheren Studienbeschrieben 44,45,46charakterisiert.

HINWEIS: Kurz gesagt, Fibroblasten wurden über mRNA-basierte genetische Neuprogrammierung47auf iPSC umprogrammiert. Die iPSCs wurden im Stammzellmedium (SCM) (siehe Materialliste) gehalten und mit einer Dichte von 1,2 x 102 Zellen/ml mit 1 ml SCM, 10 m mit rho-assoziiertem Proteinkinase-Inhibitor (ROCKi) Y-27632 und 10% (v/v) Dimethylsulfid (DMSO) in kryopreserveden Durchstechflaschen in flüssigem Stickstoff bei -160 °C gelagert. Alle nachstehenden Verfahren werden in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Kellermembranmatrixverdünnung und Plattenbeschichtung

  1. Verdünnter (1:50) Wachstumsfaktor reduzierte Kellermembranmatrix, die vom Engelbreth-Holm-Schwarmtumor in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Phenolrot gereinigt wurde.
  2. Beschichten Sie Zellkulturplatten mit der entsprechenden Menge an verdünnter Kellermembranmatrix (d.h. 6-Well-Platte = 1ml, 12-Well-Platte = 0,5 ml) und bebrüten diese Platten mindestens 1 Stunde bei 37 °C.

2. iPSC Wartung

HINWEIS: Die maximale Konfluenz pro Brunnen in einer 6-Well-Flachbodenplatte beträgt 1,2 x 106 Zellen.

  1. Thaw kryokonreserved iPSCs in SCM mit 10 'M Y-27632 und Platte auf eine 6-Well-Platte mit verdünntem Wachstumsfaktor reduziert Kellermembran Matrix beschichtet.
  2. Halten Sie iPSCs in SCM mit 10 M Y-27632 für die ersten 24 Stunden nach dem Auftauen aufrecht. Wechseln Sie nach 24 Stunden auf frisches Medium.
  3. Bewahren Sie iPSCs in SCM auf, bis die Zellen vor dem Passieren 80-90% Koninfluenza erreichen.
    1. Berechnen Sie, wie viele iPSCs für die Differenzierung benötigt werden, indem Sie die gewünschte Dichte zur Differenzierung (15.600 Zellen/cm2) mit der Oberfläche des Brunnens multiplizieren. Für eine 6-Well-Flachbodenplatte 15.600 Zellen/cm2 x 9,6 cm2 für insgesamt 149.760 Zellen/Well multiplizieren.
  4. Um durchzufahren, waschen Sie die Zellen mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS). Dann inkubieren Sie die Zellen mit nicht-enzymatischer Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (siehe Materialliste) für 5 Minuten bei 37 °C.
    1. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sanft zu entfernen. Sammeln Sie Zellen in frischem SCM.
    2. Plattenzellen auf Zellkulturplatten, die mit verdünntem SCM beschichtet sind, und halten Zellen, wie in Schritt 2.3 beschrieben, oder lagern sie bei 1,2 x 106 Zellen/ml in 1 ml SCM, 10 M Y-27632 und 10 % DMSO (v/v) in kryopservierten Durchstechflaschen in flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von -160 °C.

3. Differenzierung von iPSCs zu BMECs

HINWEIS: Nicht-enzymatische EDTA trennt Zellen in Klumpen. Enzymatische EDTA (siehe Materialtabelle) trennt Zellen in einzellige Suspension. Retinsäure (RA) sollte vor Licht geschützt werden.

  1. Waschen Sie iPSCs einmal mit Dulbeccophosphat Buffer Saline (DPBS). Mit enzymatischer EDTA (1 ml für 6-Well-Platte, 0,5 ml für 12-Well-Platte und 0,25 ml für 24-Well-Platte) ca. 5 Minuten bei 37 °C inkubieren, um eine Einzelzellsuspension zu ergeben.
  2. Sammeln Sie Zellen und Zentrifuge bei 300 x g (relative Zentrifugalkraft) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspend Zellpellets in SCM mit 10 M Y-27632.
  3. Bestimmen Sie die Zelldichte mit Trypan Blue und einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Plattenzellen mit einer Dichte von 15.600 Zellen/cm2 oder 149.760 Zellen/Well einer 6-Well-Flachbodenplatte (mit einer Oberfläche von 9,6 cm2/well) in SCM mit 10 'M Y-27632 für 24 Stunden.
  4. Initiieren Sie die Differenzierung nach 24 Stunden, indem Sie SCM in E6-Medium ändern. Ändern Sie E6 medium täglich für die nächsten 4 Tage.
  5. Ersetzen Sie am 4. Tag der Differenzierung E6 medium durch hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27 Ergänzung, 20 ng/mL bFGF und 10 M RA. Ändern Sie dieses Medium nicht für die nächsten 48 Stunden.
  6. 200 ml hESFM mit verdünntem (1:200) B27 vorbereiten, 1 ml 50x konzentrierte B27-Ergänzung zu 199 ml hESFM mischen.
  7. Bereiten Sie 20 ng/ml bFGF vor, indem Sie 50 g bFGF in 250 l Tris-Puffer (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) rekonstituieren, um eine 200-g/ml-Stammlösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit 20 ng/mL bFGF vor, indem Sie 20 l von 200 g/ml bFGF mit 200 ml hESFM mischen.
  8. Bereiten Sie 10 M RA vor, indem Sie zuerst eine 40 mg/ml RA-Lagerlösung herstellen, indem Sie 2,5 ml DMSO auf 100 mg RA-Pulver hinzufügen. Verdünnen Sie diese Konzentration auf 3 mg/ml, um eine 10 mM Stofflösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit einer Menge von 10 M RA vor, indem Sie 200 l von 10 m RA in 200 ml hESFM mischen.

4. Beschichtung Kollagen IV (COL4) und Fibronectin (FN) Matrix zur Reinigung von iPSC-Derived BMEC

  1. Fügen Sie 2 ml steriles Wasser auf 2 mg FN hinzu, um 1 mg/ml FN-Stammlösung herzustellen. Fügen Sie 5 ml steriles Wasser auf 5 mg COL4 hinzu, um eine 1 mg/ml COL4-Stammlösung herzustellen.
    1. LASSEN Sie FN für mindestens 30 Minuten bei 37 °C auflösen und der COL4 bei Raumtemperatur auflösen.
  2. Die FN-Stammlösung in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 g/ml und COL4-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 400 g/ml verdünnt.
  3. Beschichten Sie die gewünschten Platten (6-Well-Platte = 1 ml COL4/FN-Lösung, 12-Well-Platte = 0,5 ml, 24-Well-Platte = 0,25 ml und 12-Transwell-gefilterte Platte = 0,25 ml) mit der Mischung aus 400 g/ml COL4 und 100 g/ml FN.
  4. Platten mindestens 2 Stunden oder über Nacht bei 37 °C inkubieren; für Transwell gefilterte Platten wird mindestens 4 Stunden empfohlen.

5. Unterkultur und Reinigung von iPSC-abgeleiteten BMECs

HINWEIS: Die Inkubation mit enzymatischer EDTA kann je nach Konfluenz der Zellen am 6. Tag der Differenzierung länger als 15 Minuten dauern.

  1. Am 6. Tag der Differenzierung, waschen Zellen zweimal mit DPBS. Mit 1 ml enzymatischer EDTA mindestens 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis eine einzellige Suspension erhalten ist.
  2. Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspend Zellpellets mit frischem hESFM mit verdünnten (1:200) B27 Ergänzung, 20 ng/mL bFGF, und 10 M RA.
  3. Samenzellen auf Platten, die mit einer Mischung aus 400 g/mL COL4 und 100 g/ml FN beschichtet sind. Samenzellen mit einem Verhältnis von 1 Brunnen einer 6-Well-Platte zu 3 Brunnen einer 12-Well-Platte, 3 Brunnen einer 12-Transwell-gefilterten Platte oder 6 Brunnen einer 24-Well-Platte.
  4. Saat undifferenzierte iPSCs aus der gleichen Zelllinie auf COL4/FN beschichtet12-Transwell gefilterte Platte als Negativkontrolle für die TEER-Analyse.
  5. Nach 24 Stunden Sub-Kultivierung, ändern Medium zu hESFM mit B27 Ergänzung nur. Nach diesem Schritt sind keine mittleren Änderungen erforderlich.

6. Sprouting Assay

  1. Sammeln Sie Day 8 iPSC-abgeleitete BMECs und säen Sie sie mit 100.000 Zellen/Well auf eine 24-Well-Flachbodenplatte, frisch beschichtet mit 200 l/cm2 Kellermembranmatrix.
  2. Behandeln Sie diese Zellen mit hESFM mit verdünntem (1:200) B27 und 40 ng/ml vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor A (VEGFA165).
  3. Beobachten Sie Zellen alle 24 Stunden und ändern Sie das Medium alle zwei Tage.

7. Immunzytochemie (ICC)

HINWEIS: ICC wird auf 24-Well-Flachbodenplatten durchgeführt.

  1. Nach 48 Stunden Subkultivierung (Tag 8) zweimal Zellen mit DPBS waschen. Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten.
  2. Waschen Sie Zellen dreimal mit DPBS, 5 Minuten pro Wäsche. Vorblockzellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur in DPBS mit 5% Eselserum und 0,3% Triton X-100 (v/v).
  3. Inkubat mit primären Antikörpern: Maus Anti-Human-PECAM1 (1:100, Lager 0,5 mg/ml), Kaninchen anti-human-TJP1 (1:200, Lager 0,53 mg/ml), Maus anti-human-CLDN5 (1:200, Lager 0,5 mg/ml), Maus-Anti-Human-OCLN (1:200, Lager 0,5 mg/ml) und Kaninchen Anti-Human-SLC2A1 (1:100, Lager 0,2 mg/ml) in DPBS mit 5% Eselserum über Nacht bei 4°C.
    1. Spülen Sie die Zellen einmal mit DPBS und waschen Sie dann fünfmal für 5 Minuten pro Wäsche mit DPBS.
  4. Inkubieren Sie Zellen mit sekundären Antikörpern: Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 (1:200) und Esel-Anti-Maus 488 (1:200) in DPBS mit 5% Eselserum für 1 Stunde.
  5. Nach dieser Inkubation fügen Sie Hoechst 33342 Trihydrochlorid-Trihydrat verdünnt (1:1000) in DPBS für 10 Minuten hinzu.
    1. Entfernen Sie die Hoechst 33342 Lösung und spülen Sie sie einmal mit DPBS und waschen Sie sie viermal mit DPBS für 5 Minuten pro Wäsche.
  6. Visualisieren Sie Zellen auf Fluoreszenzmikroskopen, um nach Expression und Lokalisierung von Zellerstoren zu suchen.

8. TEER Messung und Analyse

HINWEIS: Corning 12-Transwell gefilterte Platten sind mit Filtern ausgestattet, die aus 1,12 cm2 Polyethylenterephthalatmembranen und 0,4 Mikrometer Poren bestehen. TEER-Messungen werden in technischen (3 pro Brunnen) und biologischen Replikationen (3 Brunnen pro Zelllinie und/oder Zustand) durchgeführt.

  1. Messen Sie TEER 24 Stunden nach der Subkultivierung (Tag 7) mit Essstäbchenelektroden und einem Voltohmmeter alle 24 Stunden. Spezifische Anweisungen zur Messung finden Sie im Voltohmmeter-Benutzerhandbuch.
    1. Um TEER zu messen, laden Sie das Voltohmmeter-Instrument am Vorabend auf. Wischen Sie das Instrument und die Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol leicht ab, bevor Sie sie in die Sicherheitshaube legen.
    2. Schalten Sie das Ohm-Messgerät ein und kalibrieren Sie es, wie vom Hersteller empfohlen.
    3. Stecken Sie die Essstäbchenelektroden ein und spülen Sie Elektroden mit 70% Ethanol gefolgt von DPBS.
    4. Legen Sie die kürzere Endelektrode in den Transbrunneneinsatz (die apikale Kammer) und das längere Ende in die basolaterale Kammer.
    5. Messen Sie zunächst einen Rohbrunnen, der nur mit COL4/FN beschichtet ist. Dann messen Sie die anderen Brunnen.
    6. Schnelles Spülen von Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol, gefolgt von DPBS bei der Messung verschiedener Bedingungen (d. h. Messung verschiedener Zelllinien).
  2. Nachdem alle Messungen (in Ω) aufgezeichnet wurden, spülen Sie Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol und dann sterilem Wasser aus. Elektrode vorsichtig abwischen und in der Sicherheitshaube die Luft trocknen lassen.
  3. Durchschnittliche Ausführung der teER-Werte (in Ω) aus dem leeren Brunnen, und subtrahieren Sie diesen Durchschnittswert von jedem Rohwert des TEER nach Bedingung.
    1. Durchschnittlich die subtrahierten Werte und multiplizieren Sie sie mit 1,12 cm2 (die Oberfläche des 12-Transwell-Einsatzes).
    2. Verwenden Sie transformierte Werte aus Schritt 6, um das Diagramm mit TEER-Wert und Standardfehlern für jeden Tag der TEER-Messung zu generieren.

9. Efflux Transporter Aktivität und Analyse

HINWEIS: Efflux Transporter Aktivität Assay wird auf einer 24-well-Flachbodenplatte durchgeführt. Zu den Voninteresse entoselnden Efflux-Transportern gehören ABCB1 und ABCC1. Es wird empfohlen, dass jede Bedingung in Dreifacharbeit mit Kontrollbrunnen (d. h. leerer Brunnen ohne die jeweiligen Inhibitoren) durchgeführt wird.

  1. Nach 48 Stunden Subkultivierung (Tag 8) brüten Zellen mit 10 M Valspodar (ABCB1-Hemmer) oder 10 M MK571 (ABCC1-Hemmer) 1 Stunde bei 37 °C.
    1. Bereiten Sie 10 mM Valspodar-Bestand vor, indem Sie 5 mg Pulver (1214,64 g/mol) in 412 l DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 m Valspodar herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 ml Valspodar-Bestand mit 10 ml hESFM.
    2. Bereiten Sie 10 mM MK571 Vorrat vor, indem Sie 5 mg Pulver (537,07 g/mol) in 931 l auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M MK571 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM MK571 Lager mit 10 ml hESFM.
  2. Nach 1 Stunde die Zellen mit 10 M Rhodam 123 (ABCB1-Substrat) oder 10 M 2',7'--Dichlorodihydrofluorescein-Diaacetat (H2DCFDA, ABCC1-Substrat) mit oder ohne ihre jeweiligen Inhibitoren 1 Stunde bei 37 °C inkubieren.
    1. Bereiten Sie 10 mM Rhodamin 123 vor, indem Sie 10 mg Pulver (380,82 g/mol) in 875 l DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M Rhodamine 123 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM Rhodamine 123 Mit 10 ml hESFM.
    2. Bereiten Sie 10 mM H2DCFDA vor, indem Sie 50 mg Pulver (487,29 g/mol) in 10,26 ml DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M Rhodamine 123 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM Rhodamine 123 Mit 10 ml hESFM.
  3. Waschen Sie Zellen zweimal mit 0,5 ml DPBS und Lyse mit DPBS, die 5% Triton-X (v/v) enthalten.
  4. Messen Sie die Fluoreszenz der lysierten Zellen mit einem Multi-Platten- oder Mikroplattenleser (siehe Materialliste).
    1. Stellen Sie das Fluoreszenzplattenleser-Instrument auf 485 Nanometer Anregung und 530 Nanometer-Emission ein und messen Sie die Fluoreszenz bei diesen Wellenlängen.
    2. Für Brunnen, die nicht im Transportertest verwendet werden, waschen Sie Zellen zweimal mit DPBS, bevor Sie sie mit 4% PFA für die Zellkernquantifizierung fixieren.
  5. Inkubieren Sie Zellen mit Hoechst 33342 Trihydrochlorid-Trihydrat verdünnt (1:1000) in DPBS für 10 Minuten. Bild mehrere visuelle Felder in jedem Brunnen, um die durchschnittliche Anzahl von Zellkernen mit Fluoreszenzmikroskopen zu berechnen.
  6. Zählen Sie Kerne mit Fidschi und normalisieren Sie Fluoreszenzwerte pro Zelle auf diese Zählungen.
    1. Berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzakkumulation, indem Sie den Rohfluoreszenzakkumulationswert für jede Bedingung von ihrem jeweiligen Rohwert subtrahieren.
    2. Durchschnittliche subtrahierte Werte für jede Bedingung.
    3. Teilen Sie Durchschnittswerte aus Schritt 9.6.1 durch die durchschnittliche Zellenanzahl. Verwenden Sie diese Werte, um Fluoreszenzwerte pro Zelle zu normalisieren.
    4. Verwenden Sie normalisierte Werte, um eine grafische Darstellung für jede Inhibitorbedingung zu generieren und alle erforderlichen statistischen Analysen durchzuführen.

10. Passieren, Erweitern und Kryokonservierung von BMECs

  1. Tag 8 BMEC-Kulturen mit frischem hESFM auffüllen, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27 und lassen Die Zellen auf der COL4/FN-Matrix noch zwei Tage expandieren.
  2. Beschichten Sie eine neue 12-Transwell-gefilterte Platte und eine 24-Well-Flachbodenplatte mit 400 g/mL COL4 und 100 g/mL FN und brüten 4 Stunden lang.
  3. Am 10. Tag die Zellen mit DPBS waschen und mit 1 ml enzymatischer EDTA mindestens 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis eine Einzelzellsuspension erhalten ist.
  4. Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
    1. Um diese Zellen kryokonservieren, setzen Sie Zellpellets mit frischem hESFM mit 30% Fetal Bovine Serum (FBS) und 10% DMSO wieder auf.
    2. IPSC-abgeleitete BMECs in kryokonservierten Fläschchen in einem Isopropanol-Behälter für die ersten 24 Stunden bei -80 °C lagern und dann in flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung bei -160 °C geben.
    3. Um diese Zellen zu durchleben, setzen Sie Zellpellets mit frischem hESFM, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27, wieder auf.
  5. Samenzellen auf beschichteten Platten, die in Schritt 10.2 hergestellt werden. Samenzellen mit einem Verhältnis von 1 Brunnen einer 6-Well-Platte zu 3 Brunnen einer 12-Transwell-gefilterten Platte und zu 6 Brunnen einer 24-Well-Platte. Lassen Sie Zellen 24 Stunden lang wachsen und erweitern.
  6. Messen Sie TEER am 11. Tag anhand der in Schritt 8 aufgeführten Schritte.
  7. Führen Sie am 12. Tag ICC aus, indem Sie die in Schritt 9 aufgeführten Schritte ausführen.
  8. Um kryokonservierte BMECs aufzutauen, legen Sie die kryokonservierten Fläschchen in ein warmes Wasser oder Perlenbad bei 37oC. Dann übertragen Sie die aufgetauten BMECs auf 5 ml hESFM, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27.
    1. Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Zellen in hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27, 10 M RA und 10 M Y-27632.
    2. Nach 24 Stunden schalten Sie Medium auf hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27 und 10 'M Y-27632 ohne RA.

Ergebnisse

BMEC-Differenzierung
Einige kritische Schritte in diesem Protokoll sollten genau befolgt werden (Abbildung 1). E6 mittlere Nutzung an Tag 1 ist wichtig, da es oft für die Ableitung von Neuroektoderm Linie von iPSCs innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums, die reproduzierbare Ergebnisse über mehrere Zelllinien36. Ein weiterer wichtiger Schritt ist der 4. Tag der Differenzierung, bei dem E6-Medium auf hESFM mit verdünnten (1:200) B27, 20 ng/mL bF...

Diskussion

Änderungen und Fehlerbehebung

In diesem Protokoll haben wir einige Änderungen bei der Verwendung einer häufig verwendeten extrazellulären Matrix und Zellkulturmedien während der iPSC-Kultivierung für die Ableitung von BMECs vorgenommen (Abbildung 1). Diese Änderungen hatten keinen Einfluss auf die Fähigkeit, BMECS aus menschlichen iPSCs abzuleiten, wie im Lippmann-Protokoll1beschrieben. Eine iPSC-Leitung eines ander...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (to R.K.), a National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL) unterstützt. ein National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (nach R.K.), ein Sydney R Baer Jr Foundation Grant (zu P.L.), der Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (nach R.K.), die Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (zu R.K.), die Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (zu R.K.), das Harvard Stem Cell Institute (zu R.K.) und von Steve Willis und Elissa Freud (zu R.K.). Wir danken Dr. Annie Kathuria für ihre kritische Lektüre und ihr Feedback zum Manuskript.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetateSigma AldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgGLife TechnologiesA-31572
B27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAbCell Signaling3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Collagen IV from human placentaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)Corning353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)Corning353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)Corning3460
Countess slidesThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (without phenol red)Thermo Fisher Scientific A1413202
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
Donkey serumSigma AldrichD9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Fisher Scientific14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)Thermo Fisher ScientificA1516401
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronectinSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium Thermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Human endothelial serum-free mediumThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificN/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Services15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate ReaderPerkin ElmerN/A
Recombinant Human VEGF 165Peprotech100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)Peprotech100-18B
Retinoic acidSigma AldrichR2625-100MG
Rhodamine 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Cell Signaling81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Versene solutionThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris/Thermo Fisher Scientific1254

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