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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo detalla un método adaptado para derivar, expandir y criopreservar las células endoteliales microvasculares cerebrales obtenidas diferenciando las células madre pluripotentes inducidas por humanos, y para estudiar las propiedades de la barrera hematoencefálica en un modelo ex vivo.

Resumen

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) para desarrollar modelos celulares ex vivo para estudiar la función de barrera hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado proporciona pasos detallados para derivar, expandir y criopreservar BMECs de iPSCs humanos utilizando un donante y reactivos diferentes a los notificados en protocolos anteriores. Los iPSC se tratan con esencial 6 medios durante 4 días, seguido de 2 días de cultivo endotelial humano libre de suero medio complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico, ácido retinoico, y suplemento B27. En el día 6, las células se sub-cultivan en una matriz de colágeno / fibronectina durante 2 días. La inmunocitoquímica se realiza en el día 8 para el análisis de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 y SLC2A1. La hinchazón occidental se realiza para confirmar la expresión del marcador BMEC y la ausencia de SOX17, un marcador endodérmico. El potencial angiogénico se demuestra con un ensayo que brota. La resistencia eléctrica transdotelial (TEER) se mide utilizando electrodos de palillo y voltohmómetro a partir del día 7. La actividad del transportador Efflux para la subfamilia de casete de enlace ATP miembro B 1 y miembro C del cassette de unión ATP se mide utilizando un lector multiplaque en el día 8. La derivación exitosa de BMECs se confirma mediante la presencia de marcadores celulares relevantes, bajos niveles de SOX17, potencial angiogénico, actividad transportadora y valores TEER ~2000 Ω x cm2. Los BMECs se expanden hasta el día 10 antes de pasar a placas de colágeno/fibronectina recién recubiertas o criopreservadas. Este protocolo demuestra que los BMECs derivados de iPSC se pueden ampliar y pasar al menos una vez. Sin embargo, se observaron valores TEER más bajos y una localización más pobre de los marcadores BMEC después de la criopreservación. BMECs se puede utilizar en experimentos de co-cultivo con otros tipos de células (neuronas, glia, pericitos), en modelos cerebrales tridimensionales (organ-chip e hidrogel), para la vascularización de organoides cerebrales, y para el estudio de la disfunción BBB en trastornos neuropsiquiátricos.

Introducción

Función de barrera hematoencefálica
La barrera hematoencefálica (BBB) forma un límite que limita el movimiento de sustancias desde la sangre hasta el cerebro. El BBB se compone de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) que forman una monocapa que recubre la vasculatura. Los BMECs, junto con astrocitos, neuronas, pericitos, microglia y matriz extracelular, forman la unidad neurovascular. Los BMECs tienen una estructura paracelular estrictamente regulada que permite al BBB mantener una alta resistencia eléctrica transdotelial (TEER), que limita la difusión pasiva y sirve como indicador de la integridad de la barrera1,2. Los BMECs también tienen proteínas que ayudan con el movimiento transcelular como la endocitosis, la transcitosis y la transmigración, así como la extravasación de leucocitos durante una respuesta inmune3. Los BMECs dependen de la afluencia y los transportadores de eflujo para la alimentación y eliminación de productos de desecho, con el fin de mantener un equilibrio homeostatico en el cerebro3. Por ejemplo, solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) es un transportador de afluencia responsable del movimiento de glucosa a través del BBB4, mientras que los transportadores de efflux como el miembro B de casete de encuadernación ATP 1 (ABCB1) y el miembro C de la subfamilia de casete de unión ATP 1 (ABCC1) son responsables de devolver los sustratos de vuelta al torrente sanguíneo3,5,6,7. Los sustratos ABCB1 incluyen morfina, verapamil4,y antipsicóticos como olanzapina y risperidona8,mientras que el transportador ABCC1 tiene una variedad de sustratos incluyendo conjugados de sulfato, vincristina, y glucuronida conjuga4.

Aplicación de modelos BBB en trastornos psiquiátricos
La disfunción del BBB se ha implicado en una serie de trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluyendo esquizofrenia y trastorno bipolar9,10. Recientemente, los modelos celulares ex vivo derivados de iPSC están siendo utilizados para interrogar los fundamentos celulares y moleculares de los trastornos psiquiátricos, pero estos modelos actualmente no tienen en cuenta el papel potencial desempeñado por la neurovasculatura11,12,13. Se presume que las citoquinas inflamatorias periféricas que circulan en la sangre pueden afectar negativamente al BBB14,15,16,17,pero también hay evidencia para paracelular18,19,20,21,22, transcelular23,24,25,26,27,28,29, y matriz extracelular20,29,30,31,32 anomalías que contribuyen a la disfunción BBB. La interrupción del BBB puede resultar en el contenido de la sangre que entra en el parénquima cerebral y la activación de astrocitos y/o microglia para liberar citoquinas proinflamatorias, que a su vez inician una respuesta inflamatoria33 que puede tener efectos perjudiciales en el cerebro34. Los BMECs son el componente principal del BBB y examinar la estructura y la función de estas células puede mejorar la comprensión de la disfunción del BBB en trastornos neurológicos y psiquiátricos.

Modelos ALTERNATIVOS BMEC
Antes del desarrollo de protocolos eficientes para derivar BMECs de iPSCs1,6,35,36,los investigadores habían empleado BMECsinmortalizados 37 para estudiar la función BBB. Sin embargo, muchos de estos modelos no lograron fenotipos BBB deseables, tal rango fisiológico de valores TEER38,39. La utilización de iPSCs tiene la ventaja de conservar el fondo genético del individuo del que se derivan las células. Los científicos están trabajando activamente en el establecimiento de modelos de microambientes ex vivo derivados de iPSC que recapitulan la estructura y la función del cerebro humano. Los investigadores han desarrollado métodos para derivar BMECs que son estructural y fisiológicamente similares a los BMECs encontrados in vivo. Los métodos para obtener poblaciones purificadas de BMECs derivados de iPSC requieren una serie de pasos diferentes con protocolos optimizados en los últimos años1,6,35,36. Generalmente, los BMECs derivados de iPSC se cultivan en el medio esencial 6 (E6) durante 4 días, seguido de 2 días en el medio libre de suero endotelial humano (hESFM) complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico (bFGF), ácido retinoico (RA), y suplemento B27. A continuación, las células se cultivan en una matriz de colágeno IV (COL4) y fibronectina (FN) para obtener >90% BMECs homogéneos1.

La identidad de los BMECs se confirma mediante la inmunofluorescencia que muestra la coexpresión de las proteínas BMEC, incluida la molécula de adhesión de células plaquetarias-endoteliales-1 (PECAM1), SLC2A1 y proteínas de unión estrechas como la proteína de unión estrecha 1 (TJP1), la ocludina (OCLN) y claudin-5 (CLDN5)6. Los ensayos de brotes se han utilizado para confirmar el potencial angiogénico de los BMECs derivados de iPSC. 6 La integridad BBB de los BMECs se evalúa mediante la presencia de valores FIsiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 y actividad medible para transportadores de eflujo como ABCB1 y ABCC11,6,36. Los recientes avances metodológicos del grupo Lippmann han dado lugar a protocolos BMEC derivados de iPSC con menor variabilidad experimental y reproducibilidad mejorada1. Sin embargo, no se sabe si se pueden ampliar y pasar más allá de la etapa de sub-culto. Nuestro protocolo modificado tiene como objetivo abordar este problema pasando los BMECs derivados de iPSC más allá del día 8 y evaluando si se pueden ampliar aún más para conservar las propiedades de BBB después de la criopreservación. Aunque ningún estudio ha descrito la transferencia de BMECs derivados de iPSC, existe un protocolo para la criopreservación BMEC que retiene las propiedades fisiológicas de BBB después de someterse a un ciclo de congelación-deshielo40. Sin embargo, no se sabe después de la criopreservación BMECs se puede pasar y retener propiedades BBB.

Los BMECs derivados de iPSC utilizando el protocolo Lippmann se han utilizado para modelar la interrupción del BBB en trastornos neurológicos como la enfermedad de Huntington7. Estos BMECs derivados de iPSC también se han utilizado para investigar los efectos de la infección bacteriana como Neisseria meningitidis o Streptococcus del Grupo B en la interrupción de la barrera de la FSC en sangre y BBB respectivamente41,42. Además, utilizando BMECs derivados del iPSC de pacientes con síndrome de eliminación de 22q con esquizofrenia, los investigadores observaron un aumento de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), una molécula de adherencia importante en BMECs que ayudan con el reclutamiento y la extravasación de leucocitos en el cerebro43. En conjunto, estos estudios demuestran la utilidad de los BMECs derivados de iPSC para estudiar la interrupción del BBB en trastornos neuropsiquiátricos complejos.

Protocolo

Los iPSC humanos fueron reprogramados de los fibroblastos de donantes sanos utilizando un protocolo aprobado por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital General de Massachusetts y el Hospital McLean, y caracterizados como descritos en estudios anteriores44,45,46.

NOTA: Brevemente, los fibroblastos fueron reprogramados a iPSC a través de la reprogramación genética basada en ARNM47. Los iPSC se mantuvieron en el medio de células madre (SCM) (ver lista de materiales) y se almacenaron a una densidad de ~1.2 x 102 células/ml con 1 ml de SCM, 10 μM con inhibidor de la proteína quinasa asociada a rho (ROCKi) Y-27632, y 10% (v/v) sulfuro de dimetil (DMSO), en viales criopreservados en nitrógeno líquido a -160 °C. Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un gabinete de bioseguridad a menos que se indique lo contrario.

1. Dilución de la matriz de membrana del sótano y recubrimiento de placas

  1. El factor de crecimiento diluido (1:50) redujo la matriz de membrana del sótano purificada a partir del tumor en engelbreth-Holm-Swarm en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco sin fenol rojo.
  2. Cubra las placas de cultivo celular con la cantidad adecuada de matriz de membrana del sótano diluida (es decir, placa de 6 pozos = 1 ml, placa de 12 pozos = 0,5 ml) e incuba estas placas a 37 °C durante al menos 1 hora.

2. Mantenimiento de iPSC

NOTA: La confluencia máxima por pozo en una placa de fondo plano de 6 pozos es ~1.2 x 106 celdas.

  1. Descongelar iPSCs criopreservados en SCM con 10 μM Y-27632 y placa en una placa de 6 pozos recubierta con factor de crecimiento diluido reducido matriz de membrana del sótano.
  2. Mantenga los iPSCs en SCM con 10 μM Y-27632 durante las primeras 24 horas después del deshielo. Cambie a un medio fresco después de 24 horas.
  3. Mantenga los iPSCs en SCM hasta que las células alcancen el 80-90% de la confluencia antes de pasar.
    1. Calcule cuántos iPSC serán necesarios para la diferenciación multiplicando la densidad deseada para la diferenciación (15.600 celdas/cm2)por el área superficial del pozo. Para una placa de fondo plano de 6 pozos, multiplique 15.600 celdas/cm2 por 9,6 cm2 para un total de 149.760 celdas/pozo.
  4. Para pasar, lave las células con la Solución de Sal Equilibrada (HBBS) de Hanks. A continuación, incubar las células con ácido etilenodiaminetetraacetic no enzimático (EDTA) (ver lista de materiales) durante 5 minutos a 37 °C.
    1. Utilice un rascador de células para levantar suavemente las células. Recoger celdas en SCM fresco.
    2. Placas de las células sobre placas de cultivo celular recubiertas con SCM diluidas y mantener las células como se describe en el paso 2.3 o almacenarlas a ~1.2 x 106 células/ml en 1 ml de SCM, 10 μM Y-27632, y 10% DMSO (v/v) en viales criopreservados en nitrógeno líquido a una temperatura de -160 °C.

3. Diferenciación de iPSC a BMECs

NOTA: EDTA no enzimática separa las células en grupos. EDTA enzimática (ver Tabla de Materiales)separa las células en suspensión de una sola célula. El ácido retinoico (AR) debe protegerse de la luz.

  1. Lave iPSCs una vez con la solución salina del tampón de fosfato (DPBS) de Dulbecco. Incubar con EDTA enzimática (1 ml para placa de 6 pozos, 0,5 ml para placa de 12 pozos y 0,25 ml para placa de 24 pozos) durante aproximadamente 5 minutos a 37 °C para producir una sola suspensión celular.
  2. Recoge células y centrífugas a 300 x g (fuerza centrífuga relativa) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pellets de células resuspend en SCM que contienen 10 μM Y-27632.
  3. Determine la densidad celular mediante trypan blue y contador de celdas automatizado o un dispositivo hemocítómetro. Células de placa a una densidad de 15.600 células/cm2 o 149.760 células/pozo de una placa plana de 6 pozos (con una superficie de 9,6 cm2/pozo) en SCM que contiene 10 μM Y-27632 durante 24 horas.
  4. Inicie la diferenciación después de 24 horas cambiando SCM a medio E6. Cambie el medio E6 diariamente durante los próximos 4 días.
  5. En el día 4 de diferenciación, reemplace el medio E6 por hESFM complementado con suplemento diluido (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF y 10 μM RA. No cambie este medio durante las próximas 48 horas.
  6. Preparar 200 ml de hESFM con diluido (1:200) B27, mezclar 1 ml de suplemento B27 concentrado de 50x a 199 ml de hESFM.
  7. Preparar 20 ng/mL de bFGF reconstituyendo 50 μg de bFGF en 250 μL de tampón Tris (Tris de 5 mM, pH 7.6, 150 mM NaCl) para hacer 200 μg/mL solución de stock. Preparar 200 ml de hESFM que contenga 20 ng/mL bFGF mezclando 20 μL de 200 μg/mL bFGF con 200 ml de hESFM.
  8. Preparar 10 μM RA haciendo primero una solución de 40 mg/ml de caldo ra añadiendo 2,5 ml de DMSO a 100 mg de polvo de AR. Diluir esta concentración a 3 mg/ml para hacer solución de stock de 10 mM. Preparar 200 ml de hESFM que contenga 10 μM RA mezclando 200 μL de 10μM RA en 200 mL hESFM.

4. Recubrimiento de colágeno IV (COL4) y matriz de fibronectina (FN) para purificación de BMEC derivado de iPSC

  1. Añadir 2 ml de agua estéril a 2 mg de FN para hacer 1 mg/mL FN solución de stock. Añadir 5 ml de agua estéril a 5 mg de COL4 para hacer una solución de stock COL4 de 1 mg/ml.
    1. Permita que el FN se disuelva durante al menos 30 minutos a 37 °C y que el COL4 se disuelva a temperatura ambiente.
  2. Diluir la solución de stock de FN en agua estéril a una concentración final de 100 μg/mL y col4 solución de stock a una concentración final de 400 μg/mL.
  3. Cubra las placas deseadas (placa de 6 pozos = 1 ml de solución COL4/FN, placa de 12 pozos = 0,5 ml, placa de 24 pozos= 0,25 ml y placa filtrada de 12 trastos = 0,25 ml) con la mezcla de 400 μg/mL COL4 y 100 μg/mL FN.
  4. Incubar placas durante un mínimo de 2 horas o durante la noche a 37 °C; para las placas filtradas Transwell, se recomienda un mínimo de 4 horas.

5. Subcultura y purificación de BMECs derivados de iPSC

NOTA: La incubación con EDTA enzimática puede tardar más de 15 minutos dependiendo de la confluencia de las células el día 6 de la diferenciación.

  1. En el día 6 de diferenciación, lave las células dos veces con DPBS. Incubar con 1 ml de EDTA enzimática durante al menos 15 minutos a 37 °C hasta que se obtenga una sola suspensión celular.
  2. Recoger las células a través de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pellets de células resuspend con hESFM fresco con suplemento diluido (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF, y 10 μM RA.
  3. Células de semillas sobre placas recubiertas con una mezcla de 400 μg/mL COL4 y 100 células FN de μg/ml utilizando una proporción de 1 pozo de una placa de 6 pozos a 3 pozos de una placa de 12 pozos, 3 pozos de una placa filtrada de 12 ciclos, o 6 pozos de una placa de 24 pozos.
  4. Semilla iPSCs indiferenciadas de la misma línea celular en la placa filtrada col4/FN recubierta de 12 ciclos como control negativo para el análisis TEER.
  5. Después de 24 horas de sub-culturing, cambiar medio a hESFM con suplemento B27 solamente. No se necesitan cambios medios después de este paso.

6. Ensayo de brotes

  1. Recoger BMECs derivados del iPSC día 8 y sembrarlos a 100.000 células/pozo en una placa de fondo plano de 24 pozos recién recubierta con 200 μL/cm2 de matriz de membrana del sótano.
  2. Tratar estas células con hESFM con diluido (1:200) B27 y 40 ng/mL del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA165).
  3. Observe las células cada 24 horas y cambie el medio cada dos días.

7. Inmunocitoquímica (ICC)

NOTA: Icc se lleva a cabo en placas planas de 24 pozos.

  1. Después de 48 horas de sub-culturing (día 8), lave las células dos veces con DPBS. Corrija las células con un 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 minutos.
  2. Lave las células tres veces con DPBS, 5 minutos por lavado. Celdas prebloqueadas durante 1 hora a temperatura ambiente en DPBS con 5% suero de burro y 0.3% Tritón X-100 (v/v).
  3. Incubar con anticuerpos primarios: ratón anti-humano-PECAM1 (1:100, stock 0,5 mg/mL), conejo anti-humano-TJP1 (1:200, stock 0,53 mg/mL), ratón anti-humano-CLDN5 (1:200, 0,5 mg/ml), ratón anti-humano-OCLN (1:200, stock 0,5 mg/mL), y conejo anti-humano-SLC2A1(1:100, stock 0,2 mg/mL) en DPBS que contiene un 5% de suero de burro durante la noche a 4°C.
    1. Enjuague las células una vez con DPBS y luego lave cinco veces durante 5 minutos por lavado con DPBS.
  4. Incubar células con anticuerpos secundarios: burro-anti-conejo Alexa Fluor 555 (1:200) y burro-anti-ratón 488 (1:200) en DPBS que contiene 5% suero de burro durante 1 hora.
  5. Después de esta incubación, agregue Hoechst 33342 trihidroclorida trihidrato diluido (1:1000) en DPBS durante 10 minutos.
    1. Retire la solución Hoechst 33342 y enjuague una vez con DPBS y lave cuatro veces con DPBS durante 5 minutos por lavado.
  6. Visualice las células en microscopios de fluorescencia para buscar la expresión y localización de los fabricantes de células.

8. Medición y análisis del TEER

NOTA: Las placas filtradas Corning 12-Transwell están equipadas con filtros que consisten en membranas de tereftalato de polietileno de 1,12 cm2 y 0,4 micrómetros. Las mediciones TEER se obtienen en réplicas técnicas (3 por pozo) y biológicas (3 pozos por línea celular y/o condición).

  1. 24 horas después de la sub-culturing (día 7), mida EL TEER usando electrodos de palillo y un voltohmmeter cada 24 horas. Consulte el manual del usuario de voltohmmeter para obtener instrucciones específicas sobre cómo obtener mediciones.
    1. Para medir EL TEER, cargue el instrumento del voltohmímetro la noche anterior. Limpie ligeramente el instrumento y los electrodos de palillo con un 70% de etanol antes de colocarlos en el capó de seguridad.
    2. Encienda y calibrar el medidor ohmio según lo recomendado por el fabricante.
    3. Conecte los electrodos de palillo y enjuague los electrodos con un 70% de etanol seguido de DPBS.
    4. Coloque el electrodo final más corto en la plaquita trans-pozo (la cámara apical) y el extremo más largo en la cámara basolateral.
    5. Primero mida un pozo en blanco que esté recubierto únicamente con COL4/FN. Entonces mida los otros pozos.
    6. Enjuague rápidamente los electrodos de palillo con un 70% de etanol seguido de DPBS al medir diferentes condiciones (es decir, medir diferentes líneas celulares).
  2. Después de que se hayan registrado todas las mediciones (en Ω), enjuague los electrodos de palillo con un 70% de etanol y luego agua estéril. Limpie suavemente el electrodo y deje que se seque al aire en la capucha de seguridad.
  3. Promediar los valores TEER triplicado (en Ω) del pozo en blanco y restar este valor medio de cada valor TEER sin procesar por condición.
    1. Promedia los valores restados y multiplícalos por 1,12 cm2 (el área de superficie de la plaquita de 12 trasposados).
    2. Utilice valores transformados desde el paso 6 para generar el gráfico que muestra el valor TEER y los errores estándar para cada día de medición teer.

9. Actividad y análisis del transportador de Efflux

NOTA: El ensayo de actividad del transportador Efflux se realiza en una placa de fondo plano de 24 pozos. Los transportistas de interés de Efflux incluyen ABCB1 y ABCC1. Se recomienda que cada condición se realice en triplicato con pozos de control (es decir, pozos en blanco sin los respectivos inhibidores).

  1. Después de 48 horas de sub-cultivo (día 8), incubar células con 10 μM Valspodar (inhibidor ABCB1) o 10 μM MK571 (inhibidor ABCC1) durante 1 hora a 37 °C.
    1. Preparar 10 mM de caldo valspodar disolviendo 5 mg de polvo (1214,64 g/mol) en 412 μL de DMSO y diluir a una concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 ml de hESFM con 10 μM Valspodar, mezcle 10 μL de 10 mM de caldo Valspodar con 10 ml de hESFM.
    2. Preparar 10 mM MK571 stock disolviendo 5 mg de polvo (537,07 g/mol) en 931 μL y diluir a una concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 mL de hESFM con 10 μM MK571, mezcle 10 μL de 10 mM MK571 con 10 ml de hESFM.
  2. Después de 1 hora, incubar células con 10 μM de rhodamina 123 (sustrato ABCB1) o 10 μM 2',7'-diclorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, sustrato ABCC1) con o sin sus respectivos inhibidores durante 1 hora a 37 °C.
    1. Preparar 10 mM rhodamina 123 disolviendo 10 mg de polvo (380,82 g/mol) en 875 μL de DMSO y diluir a una concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 ml de hESFM con 10 μM rhodamina 123, mezclar 10 μL de 10 mM rhodamine 123 stock con 10 ml de hESFM.
    2. Preparar 10 mM H2DCFDA disolviendo 50 mg de polvo (487,29 g/mol) en 10,26 ml de DMSO y diluir a la concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 ml de hESFM con 10 μM rhodamina 123, mezclar 10 μL de 10 mM rhodamine 123 stock con 10 ml de hESFM.
  3. Lave las células dos veces con 0,5 ml de DPBS y lilas utilizando DPBS que contenga el 5% de Triton-X (v/v).
  4. Mida la fluorescencia de las células liadas utilizando un lector multiplaca o microplaca (ver lista de materiales).
    1. Ajuste el instrumento lector de placas fluorescentes a 485 nanómetros de excitación y 530 nanómetros de emisión y mida la fluorescencia en estas longitudes de onda.
    2. Para pozos no utilizados en el ensayo transportador, lave las células dos veces con DPBS antes de fijarlas con 4% PFA para cuantificación de núcleos celulares.
  5. Incubar células con Hoechst 33342 trihidroclorida trihidrato diluido (1:1000) en DPBS durante 10 minutos. Imagen de múltiples campos visuales en cada pozo para calcular el recuento promedio de núcleos celulares utilizando microscopios de fluorescencia.
  6. Contar núcleos utilizando Fiji y normalizar los valores de fluorescencia por célula a estos recuentos.
    1. Calcule la acumulación media de fluorescencia restando el valor de acumulación de fluorescencia cruda para cada condición de su respectivo valor en blanco.
    2. Valores restados promedio para cada condición.
    3. Divida los valores medios del paso 9.6.1 por el recuento promedio de celdas. Utilice estos valores para normalizar los valores de fluorescencia por célula.
    4. Utilice valores normalizados para generar una representación gráfica para cada condición inhibitoria y realizar cualquier análisis estadístico necesario.

10. Pasar, expandir y criopreservar BMECs

  1. Reponga los cultivos BMEC del día 8 con hESFM fresco complementado con B27 diluido (1:200) y permita que las células se expandan durante dos días más en la matriz COL4/FN.
  2. Cubra una nueva placa filtrada de 12 transcillos y una placa de fondo plano de 24 pozos con 400 μg/mL COL4 y 100 μg/mL FN e incubar durante 4 horas.
  3. El día 10, lave las células con DPBS e incuba con 1 ml de EDTA enzimática durante al menos 15 minutos a 37°C hasta que se obtenga una sola suspensión celular.
  4. Recoger las células a través de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    1. Para criopreservar estas células, resuspend pellets celulares con hESFM fresco con 30% Suero Bovino Fetal (FBS) y 10% DMSO.
    2. Almacene los BMECs derivados de iPSC en viales criopreservados en un recipiente de isopropanol durante las primeras 24 horas a -80 °C y, a continuación, colóquelo en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -160 °C.
    3. Para pasar estas células, pellets celulares resuspend con hESFM fresco complementado con diluido (1:200) B27.
  5. Células de semillas sobre placas recubiertas preparadas en el Paso 10.2. Células de semillas que utilizan una proporción de 1 pozo de una placa de 6 pozos a 3 pozos de una placa filtrada de 12 ciclos y a 6 pozos de una placa de 24 pozos. Permita que las células crezcan y se expandan durante 24 horas.
  6. El día 11, mida el TEER siguiendo los pasos enumerados en el paso 8.
  7. El día 12, realice ICC siguiendo los pasos enumerados en el Paso 9.
  8. Para descongelar los BMECs criopreservados, coloque los viales criopreservados en un baño de agua tibia o cuentas a 37oC. A continuación, transfiera los BMECs descongelados a 5 ml de hESFM complementados con B27 diluido (1:200).
    1. Recoger las células a través de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Resuspend las células en hESFM complementadas con diluido (1:200) B27, 10 μM RA y 10 μM Y-27632.
    2. Después de 24 horas, cambie de medio a hESFM complementado con diluido (1:200) B27 y 10 μM Y-27632 sin AR.

Resultados

Diferenciación BMEC
Algunos pasos críticos en este protocolo deben seguirse con precisión (Figura 1). E6 uso medio en el día 1 es importante, ya que se utiliza a menudo para derivar linaje neuroectoderm de iPSCs dentro de un período relativamente corto de tiempo que produce resultados reproducibles a través de múltiples líneas celulares36. Otro paso importante es el día 4 de la diferenciación, donde el medio E6 debe cambiarse a hESFM con ...

Discusión

Modificaciones y solución de problemas

En este protocolo, hicimos algunas modificaciones en el uso de una matriz extracelular de uso común y medios de cultivo celular durante la culturing iPSC para la derivación de BMECs (Figura 1). Estos cambios no afectaron a la capacidad de derivar BMECS de iPSC humanos como se describe en el Protocolo Lippmann1. Se utilizó una línea iPSC de un donante sano diferente para demostrar ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por un Premio R01MH113858 del Instituto Nacional de Investigación Biobehavioral de Salud Mental para Nuevos Científicos Innovadores (BRAINS) R01MH113858 (a R.K.), premio KL2 TR002542 (PL) de los Institutos Nacionales de Salud. un Premio del Instituto Nacional de Desarrollo Científico Clínico de Salud Mental K08MH086846 (a R.K.), una Beca de la Fundación R Baer Jr de Sídney (a P.L.) el Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), la Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), el Instituto de Células Madre de Harvard (a R.K.) y por Steve Willis y Elissa Freud (a R.K.). Agradecemos a la Dra. Annie Kathuria por su lectura crítica y comentarios sobre el manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetateSigma AldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgGLife TechnologiesA-31572
B27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAbCell Signaling3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Collagen IV from human placentaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)Corning353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)Corning353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)Corning3460
Countess slidesThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (without phenol red)Thermo Fisher Scientific A1413202
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
Donkey serumSigma AldrichD9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Fisher Scientific14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)Thermo Fisher ScientificA1516401
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronectinSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium Thermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Human endothelial serum-free mediumThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificN/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Services15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate ReaderPerkin ElmerN/A
Recombinant Human VEGF 165Peprotech100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)Peprotech100-18B
Retinoic acidSigma AldrichR2625-100MG
Rhodamine 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Cell Signaling81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Versene solutionThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris/Thermo Fisher Scientific1254

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