Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo adattato per derivare, espandere e crioconservare le cellule endoteliali microvascolari cerebrali ottenute differenziando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e per studiare le proprietà della barriera eculare nel sangue in un modello ex vivo.

Abstract

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) possono essere differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) per sviluppare modelli cellulari ex vivo per lo studio della funzione della barriera eculare-encefalica (BBB). Questo protocollo modificato fornisce passaggi dettagliati per ricavare, espandere e crioconservare IPC dagli iPSC umani utilizzando un donatore e reagenti diversi da quelli riportati nei protocolli precedenti. Gli iPSC vengono trattati con 6 mezzi essenziali per 4 giorni, seguiti da 2 giorni di mezzo di coltura senza siero endoteliale umano integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base, acido retinoico e integratore B27. Al giorno 6, le cellule vengono sotto-coltivate su una matrice di collagene / fibronectina per 2 giorni. L'immunocitochimica viene eseguita al giorno 8 per l'analisi dei marcatori BMEC utilizzando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 e SLC2A1. Il western blotting viene eseguito per confermare l'espressione del marcatore BMEC e l'assenza di SOX17, un marcatore endodermico. Il potenziale angiogenico è dimostrato con un saggio di germogliazione. La resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) viene misurata utilizzando elettrodi a bacchetta e voltohmmetro a partire dal giorno 7. L'attività del trasportatore Efflux per la sottofamiglia di cassette di binding ATP B membro 1 e la sottofamiglia di cassette di binding ATP C membro 1 viene misurata utilizzando un lettore multi-piastra al giorno 8. Una derivazione riuscita dei BMEC è confermata dalla presenza di marcatori cellulari rilevanti, bassi livelli di SOX17, potenziale angiogenico, attività del trasportatore e valori TEER ~2000 Ω x cm². I BMEC vengono espansi fino al giorno 10 prima di passare su piastre di collagene/fibronectina appena rivestite o crioconservate. Questo protocollo dimostra che i BMEC derivati da iPSC possono essere espansi e passaggi almeno una volta. Tuttavia, dopo la crioconservazione sono stati osservati valori TEER più bassi e una localizzazione più scarsa dei marcatori BMEC. I BMEC possono essere utilizzati in esperimenti di co-coltura con altri tipi di cellule (neuroni, glia, periciti), in modelli cerebrali tridimensionali (organ-chip e idrogel), per la vascolarizzazione degli organoidi cerebrali e per lo studio della disfunzione BBB nei disturbi neuropsichiatrici.

Introduzione

Funzione barriera ematico-encefalica
La barriera eto-encefalica (BBB) forma un confine che limita il movimento delle sostanze dal sangue al cervello. La BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) che formano un monostrato che rivestono la vascolarizzazione. I BMEC, insieme ad astrociti, neuroni, periciti, microglia e matrice extracellulare, formano l'unità neurovascolare. I BMEC hanno una struttura paracellulare strettamente regolata che consente alla BBB di mantenere un'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER), che limita la diffusione passiva e funge da indicatore di integrità^{della barrier}

Protocollo

Gli iPSC umani sono stati riprogrammati dai fibroblasti di donatori sani utilizzando un protocollo approvato dagli Institutional Review Boards del Massachusetts General Hospital e del McLean Hospital, e caratterizzato come descritto negli studi^{precedenti 44,45,46}.

NOTA: In breve, i fibroblasti sono stati riprogrammati in iPSC tramite riprogrammazione genetica basata sull'mRNA⁴⁷. Gli iPSC sono stati mantenuti in mezzo a cellule staminali (SCM) (vedi elenco dei materiali) e conservati ad una densità di ~1,2 x 10² ce

Risultati

Differenziazione BMEC
È necessario seguire con precisione alcuni passaggi critici di questo protocollo (figura 1). L'uso medio E6 il primo giorno è importante, poiché viene spesso utilizzato per derivare il lignaggio neuroectoderma dagli IPSC in un periodo di tempo relativamente breve producendo risultati riproducibili su più linee^{cellulari 36}. Un altro passo importante è il giorno 4 della differenziazione, dove il mezzo E6 dovrebbe essere pas...

Discussione

Modifiche e risoluzione dei problemi

In questo protocollo sono state apportate alcune modifiche all'utilizzo di una matrice extracellulare comunemente utilizzata e di supporti di coltura cellulare durante la coltura iPSC per la derivazione di BMEC (Figura 1). Queste modifiche non hanno influito sulla capacità di ricavare BMECS dagli iPSC umani come descritto nel protocollo^{Lippmann 1}. Una linea iPSC di un donatore sano dive...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
Accutase	Sigma Aldrich	A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG	Life Technologies	A-31572
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb	Cell Signaling	3528S
CLDN5 (Claudin-5)	Thermo Fisher Scientific	35-2500
Collagen IV from human placenta	Sigma Aldrich	C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)	Corning	353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)	Corning	353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)	Corning	3460
Countess slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
DMEM/F12 (without phenol red)	Thermo Fisher Scientific	A1413202
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-50mL
Donkey serum	Sigma Aldrich	D9663-10ML
DPBS (+/+)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2	World Precision Instruments	N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)	Thermo Fisher Scientific	A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma Aldrich	F2442
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher Scientific	A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Human endothelial serum-free medium	Thermo Fisher Scientific	11111044
InCell Analyzer 6000	General Electric	N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	N/A
MK-571	Sigma Aldrich	M7571-5MG
NutriStem	Stemgent	01-0005
Occludin	Thermo Fisher Scientific	33-1500
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Services	15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader	Perkin Elmer	N/A
Recombinant Human VEGF 165	Peprotech	100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625-100MG
Rhodamine 123	Sigma Aldrich	83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)	ThermoFisher	PA1-21041
SOX17	Cell Signaling	81778S
TJP-1 (ZO-1)	ThermoFisher	PA5-28869
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)	Sigma Aldrich	SML0572-5MG
Versene solution	Thermo Fisher Scientific	15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)	Tocris/Thermo Fisher Scientific	1254