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Résumé

Ce protocole détaille une méthode adaptée pour dériver, étendre, et cryopréserver des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau obtenues en différeciant les cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et pour étudier des propriétés de barrière de cerveau de sang dans un modèle ex vivo.

Résumé

Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (BMECs) peuvent être différenciées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (IPSC) pour développer des modèles cellulaires ex vivo pour étudier la fonction de barrière céphalo-encéphalique (BBB). Ce protocole modifié fournit des étapes détaillées pour tirer, étendre et cryopréserver les CPE des IPSC humains à l’aide d’un donneur et d’un reagents différents de ceux rapportés dans les protocoles précédents. Les iPSC sont traités avec le milieu essentiel de 6 pendant 4 jours, suivis de 2 jours de milieu humain endothélial de culture sérum-libre complété avec le facteur de croissance fibroblaste de base, l’acide rétinoïque, et le supplément de B27. Au jour 6, les cellules sont sous-cultivés sur une matrice collagène/fibronectine pendant 2 jours. L’immunocytochimie est effectuée au jour 8 pour l’analyse des marqueurs BMEC à l’aide de CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 et SLC2A1. Le ballonnement occidental est exécuté pour confirmer l’expression de marqueur de BMEC, et l’absence de SOX17, un marqueur endodermal. Le potentiel angiogénique est démontré avec un essai de germination. La résistance électrique trans-endothéliale (TEER) est mesurée à l’aide d’électrodes baguettes et de voltohmmètres à partir du jour 7. L’activité transporteur Efflux pour la sous-famille de cassettes de liaison ATP B membre 1 et la sous-famille de cassettes de liaison ATP C membre 1 est mesurée à l’aide d’un lecteur multi-plaques au jour 8. La dérivation réussie des BMEC est confirmée par la présence de marqueurs cellulaires pertinents, de faibles niveaux de SOX17, de potentiel angiogénique, d’activité de transporteur et de valeurs TEER ~2000 Ω x cm2. Les BMEC sont élargis jusqu’au jour 10 avant de passer sur des plaques de collagène/fibronectine fraîchement enrobées ou cryopréservées. Ce protocole démontre que les BMEC dérivés de l’iPSC peuvent être élargis et adoptés au moins une fois. Cependant, des valeurs TEER plus faibles et une localisation plus faible des marqueurs BMEC ont été observées après cryopréservation. Les BMEC peuvent être utilisés dans des expériences de co-culture avec d’autres types de cellules (neurones, gliales, péricytes),dans des modèles cérébraux tridimensionnels (puce d’organe et hydrogel), pour la vascularisation des organoïdes cérébraux, et pour étudier le dysfonctionnement de BBB dans les désordres neuropsychiatriques.

Introduction

Fonction barrière céphalo-cérébrale
La barrière céphalo-encéphalique (BBB) forme une limite qui limite le mouvement des substances du sang vers le cerveau. Le BBB est composé de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMECs) qui forment un monocouche tapissant la vascularisation. Les BMEC, ainsi que les astrocytes, les neurones, les péricytes, les microglies et la matrice extracellulaire, forment l’unité neurovasculaire. Les BMEC ont une structure paracellulaire étroitement régulée qui permet au BBB de maintenir une résistance électrique trans-endothéliale élevée (TEER), ce qui limite la diffusion passive et sert d’indicateur del’intégrité de la barrière 1,2. Les BMEC ont également des protéines qui aident au mouvement transcellulaire tel que l’endocytose, la transcytose, et la transmigration, aussi bien que l’extravasation des leucocytes pendant une réponse immunisée3. Les BMEC comptent sur l’afflux et les transporteurs d’efflux pour nourrir et enlever les déchets, afin de maintenir un équilibre homéostatique dans lecerveau 3. Par exemple, solute transporteur famille 2 membre 1 (SLC2A1) est un transporteur d’afflux responsable du mouvement du glucose à travers le BBB4, tandis que les transporteurs efflux tels que la sous-famille de cassettes de liaison ATP B membre 1 (ABCB1) et la sous-famille de cassettes de liaison ATP C membre 1 (ABCC1) sont responsables du retour des substrats dans le fluxsanguin 3,5,6,7. Les substrats ABCB1 comprennent la morphine, le verapamil4et les antipsychotiques tels que l’olanzapine et la rispéridone8,tandis que le transporteur ABCC1 a une variété de substrats, y compris les conjugués de sulfate, la vincristine et les conjugués au glucuronide4.

Application de modèles BBB dans les troubles psychiatriques
Le dysfonctionnement de BBB a été impliqué dans un certain nombre de désordres neurologiques et psychiatriques, y compris la schizophrénie et le désordrebipolaire 9,10. Récemment, des modèles cellulaires ex vivo dérivés de l’iPSC sont utilisés pour interroger les fondements cellulaires et moléculaires des troubles psychiatriques, mais ces modèles ne prennent actuellement pas en compte le rôle potentiel joué par la neurovasculature11,12,13. On émet l’hypothèse que les cytokines inflammatoires périphériques circulant dans le sang peuvent avoir un impact négatif sur le BBB14,15,16,17, mais il ya aussi des preuves pour paracellulaire18,19,20,21,22, transcellulaire23,24,25,26,27,28,29,et la matrice extracellulaire20,29,30,31,32 anomalies contribuant au dysfonctionnement BBB. La perturbation du BBB peut avoir comme conséquence le contenu du sang entrant dans le parenchyme de cerveau et activant des astrocytes et/ou des microglies pour libérer des cytokines proinflammatory, qui à leur tour initient une réponseinflammatoire 33 qui peut avoir des effets préjudiciables surle cerveau 34. Les BMEC sont la composante principale du BBB et l’examen de la structure et de la fonction de ces cellules peut améliorer la compréhension du dysfonctionnement de BBB dans les désordres neurologiques et psychiatriques.

Modèles alternatifs BMEC
Avant l’élaboration de protocoles efficaces pour l’exploitation des BMECs à partir d’iPSC1,6,35,36, les chercheurs avaient utilisé des BMECsimmortalisés 37 pour étudier la fonction BBB. Cependant, beaucoup de ces modèles n’ont pas atteint les phénotypes souhaitables de BBB, une telle gamme physiologique des valeurs de TEER38,39. L’utilisation d’iPSCs a l’avantage de conserver le contexte génétique de l’individu à partir duquel les cellules sont dérivées. Les scientifiques travaillent activement à l’établissement de modèles de microenvironnement ex vivo dérivés de l’iPSC qui récapitulent la structure et la fonction du cerveau humain. Les chercheurs ont mis au point des méthodes pour obtenir des BMEC qui sont structurellement et physiologiquement similaires aux BMECs trouvés in vivo. Les méthodes d’obtention de populations purifiées de BMEC dérivés de l’iPSC nécessitent un certain nombre d’étapes différentes avec des protocoles optimisés au cours desdernières années 1,6,35,36. Généralement, les BMECs iPSC-dérivés sont cultivés dans le milieu essentiel 6 (E6) pendant 4 jours, suivis de 2 jours dans le milieu sans sérum endothélial humain (hESFM) complété avec le facteur de croissance fibroblaste de base (bFGF), l’acide rétinoïque (RA), et le supplément de B27. Les cellules sont ensuite cultivés sur une matrice de collagène IV (COL4) et de fibronectine (FN) pour obtenir >90% homogène BMECs1.

L’identité des BMEC est confirmée par immunofluorescence montrant la co-expression des protéines BMEC, y compris la molécule d’adhérence des cellules plaquettaire-endothéliales-1 (PECAM1), SLC2A1, et les protéines de jonction serrées telles que la protéine de jonction serrée 1 (TJP1), l’occludine (OCLN) et la claudin-5 (CLDN5)6. Des analyses de germination ont été employées pour confirmer le potentiel angiogenic des BMECs iPSC-dérivés. 6 L’intégrité BBB des BMEC est évaluée par la présence de valeurs physiologiques in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 et d’activité mesurable pour les transporteurs d’efflux tels que ABCB1 et ABCC11,6,36. Les progrès méthodologiques récents du groupe Lippmann ont conduit à des protocoles BMEC dérivés de l’iPSC avec une variabilité expérimentale réduite et une reproductibilitéaccrue 1. Cependant, on ne sait pas s’ils peuvent être étendus et transmis au-delà de l’étape de la sous-culture. Notre protocole modifié vise à résoudre ce problème en réussissant les BMEC dérivés de l’iPSC au-delà du jour 8 et en évaluant s’ils peuvent être encore élargis pour conserver les propriétés BBB après cryopréservation. Bien qu’aucune étude n’ait décrit le passage des BMECs iPSC-dérivés, un protocole existe pour la cryopréservation de BMEC qui retient des propriétés physiologiques de BBB après avoir subi un cycle de gel-dégel40. Cependant, il n’est pas connu après la cryopréservation BMECs peuvent être adoptés et conserver les propriétés BBB.

Les BMECs dérivés d’iPSCs utilisant le protocole Lippmann ont été utilisés pour modéliser la perturbation bbb dans les troubles neurologiques tels que la maladie de Huntington7. Ces BMECs iPSC-dérivés ont également été utilisés pour étudier les effets de l’infection bactérienne telle que Neisseria meningitidis ou Streptococcus de groupe B sur la perturbation de la barrière de sang-CSF et BBBrespectivement 41,42. En outre, utilisant des BMECs iPSC-dérivés des patients de syndrome de suppression de 22q présentant la schizophrénie, les chercheurs ont observé une augmentation de molécule d’adhérence intercellulaire-1 (ICAM-1), une molécule importante d’adhérence dans les BMECs qui aident au recrutement et à l’extravasation des leucocytes dans lecerveau 43. Prises ensemble, ces études démontrent l’utilité des BMECs iPSC-dérivés pour étudier la perturbation de BBB dans les désordres neuropsychiatriques complexes.

Protocole

Les iPSCs humains ont été reprogrammés à partir des fibroblastes de donneurs en bonne santé à l’aide d’un protocole approuvé par les commissions d’examen institutionnel du Massachusetts General Hospital et de l’Hôpital McLean, et caractérisé comme décrit dans des étudesantérieures 44,45,46.

REMARQUE : En bref, les fibroblastes ont été reprogrammés à l’iPSC par reprogrammation génétique basée surl’ARNm 47. Les iPSC ont été maintenus dans le milieu des cellules souches (SCM) (voir liste des matériaux) et stockés à une densité de ~1,2 x 102 cellules/mL avec 1 mL de SCM, 10 μM avec inhibiteur de kinase protéique rho-associé (ROCKi) Y-27632, et 10% (v/v) sulfure de diméthyle (DMSO), dans les flacons cryopréservés dans l’azote liquide à -160 °C. Toutes les procédures suivantes ci-dessous sont effectuées dans un cabinet de biosécurité, sauf indication contraire.

1. Dilution de matrice de membrane de sous-sol et revêtement de plaque

  1. Le facteur de croissance dilué (1:50) a réduit la matrice de membrane de sous-sol purifiée de la tumeur d’Engelbreth-Holm-Swarm dans dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) sans rouge phénol.
  2. Plaques de culture de cellules de couche avec la quantité appropriée de matrice diluée de membrane de sous-sol (c.-à-d., plaque de 6 puits = 1mL, plaque de 12 puits = 0.5 mL) et incuber ces plaques à 37 °C pendant au moins 1 heure.

2. maintenance iPSC

REMARQUE : La confluence maximale par puits dans une plaque à fond plat de 6 puits est de ~1,2 x 106 cellules.

  1. Décongeler les iPSCs cryopréservés en MCS avec 10 μM Y-27632 et plaque sur une plaque de 6 puits recouverte d’une matrice de membrane de sous-sol réduite par facteur de croissance diluée.
  2. Maintenez les iPSC en MCS avec 10 μM Y-27632 pendant les 24 premières heures suivant le dégel. Passer à un milieu frais après 24 heures.
  3. Maintenir les iPSC dans le SCM jusqu’à ce que les cellules atteignent 80-90% de confluence avant de passer.
    1. Calculer le nombre d’iPSC nécessaires à la différenciation en multipliant la densité souhaitée pour la différenciation (15 600 cellules/cm2)par la surface du puits. Pour une plaque à fond plat de 6 puits, multipliez 15 600 cellules/cm2 par 9,6 cm2 pour un total de 149 760 cellules/puits.
  4. Pour passer, lavez les cellules avec la solution de sel équilibré (HBBS) de Hanks. Ensuite, incuber les cellules avec de l’acide éthylèneediaminetetraacetic non enzymatique (EDTA) (voir liste des matériaux) pendant 5 minutes à 37 °C.
    1. Utilisez un grattoir cellulaire pour soulever doucement les cellules. Recueillir les cellules dans le SCM frais.
    2. Plaquez les cellules sur des plaques de culture cellulaire recouvertes de MCS dilué et maintenez les cellules décrites à l’étape 2.3 ou stockez-les à ~1,2 x10 6 cellules/mL dans 1 mL de MCS, 10 μM Y-27632 et 10 % DMSO (v/v) en flacons cryopréservés dans de l’azote liquide à une température de -160 °C.

3. Différenciation des IPSC en BMECs

REMARQUE : L’EDTA non enzymatique sépare les cellules en touffes. Enzymatic EDTA (voir tableau des matériaux)sépare les cellules en suspension cellulaire unique. L’acide rétinoïque (PR) doit être protégé de la lumière.

  1. Lavez les iPSC une fois avec la saline tampon de phosphate (DPBS) de Dulbecco. Incuber avec de l’EDTA enzymatique (1 mL pour la plaque de 6 puits, 0,5 mL pour la plaque de 12 puits et 0,25 mL pour la plaque de 24 puits) pendant environ 5 minutes à 37 °C pour produire une suspension à cellule unique.
  2. Recueillir les cellules et la centrifugeuse à 300 x g (force centrifuge relative) pendant 5 minutes à température ambiante. Resuspendez les granulés cellulaires dans SCM contenant 10 μM Y-27632.
  3. Déterminer la densité cellulaire à l’aide du compteur cellulaire Trypan Blue et automatisé ou d’un dispositif d’hémocytomètre. Cellules de plaque à une densité de 15.600 cellules/cm2 ou 149.760 cellules/puits d’une plaque à fond plat de 6 puits (avec une surface de 9.6 cm2/puits)dans SCM contenant 10 μM Y-27632 pendant 24 heures.
  4. Initier la différenciation après 24 heures en changeant SCM en E6 moyen. Changez E6 moyen par jour pour les 4 prochains jours.
  5. Le jour 4 de différenciation, remplacer e6 moyen par hESFM complété par dilué (1:200) supplément B27, 20 ng / mL bFGF, et 10 μM RA. Ne changez pas ce support pour les prochaines 48 heures.
  6. Préparer 200 mL de hESFM avec dilué (1:200) B27, mélanger 1 mL de 50x concentré B27 supplément à 199 mL de hESFM.
  7. Préparez 20 ng/mL de bFGF en reconstituant 50 μg de bFGF en 250 μL de tampon Tris (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) pour faire une solution de stock de 200 μg/mL. Préparer 200 mL de hESFM contenant 20 ng/mL bFGF en mélangeant 20 μL de 200 μg/mL bFGF avec 200 mL de hESFM.
  8. Préparer 10 μM RA en faisant d’abord une solution de stock de RA de 40 mg/mL en ajoutant 2,5 mL de DMSO à 100 mg de poudre de PR. Diluer cette concentration à 3 mg/mL pour faire une solution de stock de 10 mM. Préparer 200 mL de hESFM contenant 10 μM RA en mélangeant 200 μL de RA 10μM en 200 mL hESFM.

4. Revêtement collagène IV (COL4) et fibronectine (FN) Matrice pour la purification du BMEC dérivé de l’iPSC

  1. Ajouter 2 mL d’eau stérile à 2 mg de FN pour faire 1 mg/mL de solution de bouillon FN. Ajouter 5 mL d’eau stérile à 5 mg de COL4 pour faire une solution de stock COL4 de 1 mg/mL.
    1. Laisser le FN se dissoudre pendant au moins 30 minutes à 37 °C et le COL4 se dissoudre à température ambiante.
  2. Diluer la solution de stock FN dans l’eau stérile jusqu’à une concentration finale de 100 μg/mL et la solution de stock COL4 à une concentration finale de 400 μg/mL.
  3. Enrober les plaques désirées (plaque de 6 puits = 1 mL de solution COL4/FN, plaque de 12 puits = 0,5 mL, plaque de 24 puits = 0,25 mL, et plaque filtrée de 12 transwell = 0,25 mL) avec le mélange de 400 μg/mL COL4 et 100 μg/mL FN.
  4. Incuber les assiettes pendant au moins 2 heures ou toute la nuit à 37 °C; pour les plaques filtrées Transwell, un minimum de 4 heures est recommandé.

5. Sous-culture et purification des CME dérivés de l’iPSC

REMARQUE : L’incubation avec EDTA enzymatique peut prendre plus de 15 minutes selon la confluence des cellules le jour 6 de la différenciation.

  1. Le jour 6 de la différenciation, laver les cellules deux fois avec DPBS. Incuber avec 1 mL d’EDTA enzymatique pendant au moins 15 minutes à 37 °C jusqu’à ce qu’une suspension à cellule unique soit obtenue.
  2. Recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Resuspendez les granulés cellulaires avec hESFM frais avec supplément dilué (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF, et 10 μM RA.
  3. Cellules de graines sur des plaques recouvertes d’un mélange de 400 μg/mL COL4 et 100 μg/mL FN. Cellules de graines utilisant un rapport de 1 puits d’une plaque de 6 puits à 3 puits d’une plaque de 12 puits, 3 puits d’une plaque filtrée de 12 transwell, ou 6 puits d’une plaque de 24 puits.
  4. Les iPSCs indifférenciés de semences de la même lignée cellulaire sur la plaque filtrée col4/FN enduite de 12 transwells comme contrôle négatif pour l’analyse TEER.
  5. Après 24 heures de sous-culture, changer de moyen à hESFM avec supplément B27 seulement. Aucun changement moyen n’est nécessaire après cette étape.

6. Essai de germination

  1. Recueillir les BMC dérivés de l’iPSC du jour 8 et les ensemencer à 100 000 cellules/puits sur une plaque à fond plat de 24 puits fraîchement recouverte de 200 μL/cm2 de matrice membranaire du sous-sol.
  2. Traiter ces cellules avec hESFM avec dilué (1:200) B27 et 40 ng/mL de facteur vasculaire de croissance endothéliale A (VEGFA165).
  3. Observez les cellules toutes les 24 heures et changez le milieu tous les deux jours.

7. Immunocytochimie (ICC)

REMARQUE : L’ICC est réalisé sur des plaques à fond plat de 24 puits.

  1. Après 48 heures de sous-culture (jour 8), laver les cellules deux fois avec DPBS. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 minutes.
  2. Laver les cellules trois fois avec du DPBS, 5 minutes par lavage. Prébloquez les cellules pendant 1 heure à température ambiante dans le DPBS avec 5% de sérum d’âne et 0,3% de Triton X-100 (v/v).
  3. Incuber avec des anticorps primaires : souris anti-humain-PECAM1 (1:100, stock 0,5 mg/mL), lapin anti-humain-TJP1 (1:200, stock 0,53 mg/mL), souris anti-humain-CLDN5 (1:200, stock 0,5 mg/mL), souris anti-humain-OCLN (1:200, stock 0,5 mg/mL), et lapin anti-humain-SLC2A1 (1:100, stock 0,2 mg/mL) en DPBS contenant 5% de sérum d’âne pendant la nuit à 4 °C.
    1. Rincer les cellules une fois avec DPBS, puis laver cinq fois pendant 5 minutes par lavage avec DPBS.
  4. Cellules d’incubation avec des anticorps secondaires : âne-anti-lapin Alexa Fluor 555 (1:200) et âne-anti-souris 488 (1:200) dans DPBS contenant 5% de sérum d’âne pendant 1 heure.
  5. Après cette incubation, ajouter hoechst 33342 trihydrochlorure trihydrochlorate dilué (1:1000) dans DPBS pendant 10 minutes.
    1. Retirer la solution Hoechst 33342 et rincer une fois avec le DPBS et laver quatre fois avec le DPBS pendant 5 minutes par lavage.
  6. Visualisez les cellules sur des microscopes à fluorescence pour rechercher l’expression et la localisation des fabricants de cellules.

8. Mesure et analyse TEER

REMARQUE : Les plaques filtrées Corning 12-Transwell sont équipées de filtres composés de membranes de téréphtalate de polyéthylènede 1,12 cm 2 et de 0,4 micromètre de pores. Les mesures TEER sont obtenues en répliques techniques (3 par puits) et biologiques (3 puits par lignée cellulaire et/ou état).

  1. 24 heures après la sous-culture (jour 7), mesurer TEER à l’aide d’électrodes baguettes et d’un voltohmmètre toutes les 24 heures. Se référer au manuel d’utilisation voltohmmeter pour des instructions spécifiques sur l’obtention de mesures.
    1. Pour mesurer TEER, chargez l’instrument voltohmmètre la veille. Essuyez légèrement les électrodes de l’instrument et de la baguette avec 70 % d’éthanol avant de les placer dans le capot de sécurité.
    2. Allumez la puissance et calibrez le compteur ohm tel que recommandé par le fabricant.
    3. Branchez les électrodes de baguette et rincez les électrodes avec 70% d’éthanol suivi de DPBS.
    4. Placez l’électrode d’extrémité plus courte dans l’insert trans-puits (la chambre apical) et l’extrémité plus longue dans la chambre basolateral.
    5. Mesurez d’abord un puits vierge qui est recouvert de COL4/FN seulement. Ensuite, mesurez les autres puits.
    6. Rincer rapidement les électrodes à baguette avec 70 % d’éthanol, suivies du DPBS pour mesurer différentes conditions (c.-à-d. mesurer différentes lignées cellulaires).
  2. Après que toutes les mesures (en Ω) ont été enregistrées, rincez les électrodes de baguette avec 70% d’éthanol, puis l’eau stérile. Essuyer délicatement l’électrode et la laisser sécher à l’air dans le capot de sécurité.
  3. Faire la moyenne des valeurs TEER triplicate (en Ω) du puits vierge et soustraire cette valeur moyenne de chaque valeur TEER brute par condition.
    1. Faire la moyenne des valeurs soustraites et les multiplier par 1,12 cm2 (la surface de l’insert de 12 transwells).
    2. Utilisez des valeurs transformées à partir de l’étape 6 pour générer le graphique montrant la valeur TEER et les erreurs standard pour chaque jour de mesure TEER.

9. Activité et analyse du transporteur Efflux

REMARQUE : L’essai d’activité du transporteur Efflux est effectué sur une plaque à fond plat de 24 puits. Les transporteurs Efflux d’intérêt comprennent ABCB1 et ABCC1. Il est recommandé que chaque condition soit exécutée en triplicate avec des puits de contrôle (c.-à-d. puits blancs sans les inhibiteurs respectifs).

  1. Après 48 heures de sous-culture (jour 8), incuber des cellules avec 10 μM Valspodar (inhibiteur ABCB1) ou 10 μM MK571 (inhibiteur d’ABCC1) pendant 1 heure à 37 °C.
    1. Préparer 10 mM de stock valspodar en dissolvant 5 mg de poudre (1214,64 g/mol) dans 412 μL de DMSO et diluer à la concentration de travail de 10 μM. Par exemple, pour faire 10 mL de hESFM avec 10 μM Valspodar, mélanger 10 μL de 10 mM de stock Valspodar avec 10 mL de hESFM.
    2. Préparer 10 mM de bouillon MK571 en dissolvant 5 mg de poudre (537,07 g/mol) en 931 μL et diluer à une concentration de travail de 10 μM. Par exemple, pour faire 10 mL de hESFM avec 10 μM MK571, mélanger 10 μL de 10 mM MK571 avec 10 mL de hESFM.
  2. Après 1 heure, incuber des cellules avec 10 μM rhodamine 123 (substrat ABCB1) ou 10 μM 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine diacétate (H2DCFDA, substrat ABCC1) avec ou sans leurs inhibiteurs respectifs pendant 1 heure à 37 °C.
    1. Préparer 10 mM de rhodamine 123 en dissolvant 10 mg de poudre (380,82 g/mol) dans 875 μL de DMSO et diluer à la concentration de travail de 10 μM. Par exemple, pour faire 10 mL de hESFM avec 10 μM rhodamine 123, mélanger 10 μL de 10 mM de rhodamine 123 avec 10 mL de hESFM.
    2. Préparer 10 mM H2DCFDA en dissolvant 50 mg de poudre (487,29 g/mol) dans 10,26 mL de DMSO et diluer à la concentration de travail de 10 μM. Par exemple, pour faire 10 mL de hESFM avec 10 μM rhodamine 123, mélanger 10 μL de 10 mM de rhodamine 123 avec 10 mL de hESFM.
  3. Laver les cellules deux fois avec 0,5 mL de DPBS et de lyse à l’aide de DPBS contenant 5% de Triton-X (v/v).
  4. Mesurer la fluorescence des cellules lysées à l’aide d’un lecteur multiplaque ou microplaqué (voir la liste des matériaux).
    1. Réglez l’instrument de lecteur de plaque fluorescente à l’excitation de nanomètre de 485 et à l’émission de 530 nanomètres et mesurez la fluorescence à ces longueurs d’onde.
    2. Pour les puits non utilisés dans l’analyse du transporteur, laver les cellules deux fois avec DPBS avant de les fixer avec 4% de PFA pour la quantification des noyaux cellulaires.
  5. Incuber les cellules avec hoechst 33342 trihydrochlorure trihydrate dilué (1:1000) dans DPBS pendant 10 minutes. Imagez plusieurs champs visuels dans chaque puits pour calculer le nombre moyen de noyaux cellulaires à l’aide de microscopes à fluorescence.
  6. Comptez les noyaux à l’aide des Fidji et normalisez les valeurs de fluorescence sur une base par cellule à ces comptes.
    1. Calculer l’accumulation moyenne de fluorescence en soustrayant la valeur brute d’accumulation de fluorescence pour chaque condition de sa valeur vierge respective.
    2. Valeurs soustraites moyennes pour chaque condition.
    3. Divisez les valeurs moyennes de l’étape 9.6.1 par le nombre moyen de cellules. Utilisez ces valeurs pour normaliser les valeurs de fluorescence par cellule.
    4. Utilisez des valeurs normalisées pour générer une représentation graphique de chaque condition inhibitrice et effectuer toute analyse statistique nécessaire.

10. Passaging, Expanding, and Cryopreserving BMECs

  1. Reconstituer les cultures BMEC jour 8 avec hESFM frais complété par dilué (1:200) B27 et permettre aux cellules de se développer pendant deux jours de plus sur la matrice COL4 /FN.
  2. Enrober une nouvelle plaque filtrée 12 Transwell et une plaque à fond plat de 24 puits avec 400 μg/mL COL4 et 100 μg/mL FN et incuber pendant 4 heures.
  3. Le jour 10, laver les cellules avec du DPBS et incuber avec 1 mL d’EDTA enzymatique pendant au moins 15 minutes à 37 °C jusqu’à ce qu’une seule suspension cellulaire soit obtenue.
  4. Recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
    1. Pour cryopréserver ces cellules, résuspendez les granulés cellulaires avec du hESFM frais avec 30 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 10 % de DMSO.
    2. Conservez les BMECs dérivés de l’iPSC dans des flacons cryopréservés dans un contenant d’isopropanol pendant les 24 premières heures à -80 °C, puis placez-les dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme à -160 °C.
    3. Pour passer ces cellules, resuspendez les granulés cellulaires avec hESFM frais complété par dilué (1:200) B27.
  5. Cellules de graines sur des plaques enrobées préparées à l’étape 10.2. Cellules de graines utilisant un rapport de 1 puits d’une plaque de 6 puits à 3 puits d’une plaque filtrée de 12 transwell et à 6 puits d’une plaque de 24 puits. Permettre aux cellules de croître et de se développer pendant 24 heures.
  6. Le jour 11, mesurez TEER en suivant les étapes énumérées à l’étape 8.
  7. Le jour 12, effectuez ICC en suivant les étapes énumérées à l’étape 9.
  8. Pour décongeler les BMEC cryopréservés, placez les flacons cryopréservés dans un bain d’eau chaude ou de perles à 37oC. Transférer ensuite les BMECs décongelés à 5 mL de hESFM complétés par du B27 dilué (1:200).
    1. Recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Resuspendez les cellules en hESFM complétées par dilué (1:200) B27, 10 μM RA et 10 μM Y-27632.
    2. Après 24 heures, passer moyen à hESFM complété par dilué (1:200) B27 et 10 μM Y-27632 sans RA.

Résultats

Différenciation BMEC
Quelques étapes critiques de ce protocole doivent être suivies avec précision (Figure 1). E6 utilisation moyenne le jour 1 est important, car il est souvent utilisé pour dériver la lignée neuroectoderm des iPSC dans un délai relativement court donnant des résultats reproductibles à travers plusieurs lignéescellulaires 36. Une autre étape importante est le jour 4 de la différenciation, où e6 moyen devrait être com...

Discussion

Modifications et dépannage

Dans ce protocole, nous avons apporté quelques modifications à l’utilisation d’une matrice extracellulaire couramment utilisée et de médias de culture cellulaire pendant la culture iPSC pour la dérivation des BMECs (Figure 1). Ces changements n’ont pas eu d’impact sur la capacité de tirer BMECS des iPSCs humains tels que décrits dans le protocole Lippmann1. Une lignée iPSC d’un ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été appuyés par un Prix national de recherche biocomportemental de l’Institut national de santé mentale pour les nouveaux scientifiques innovateurs (BRAINS) Prix R01MH113858 (à R.K.), un National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). un National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (à R.K.), une subvention de la Sydney R Baer Jr Foundation Grant (à P.L.) le Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (à R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (à R.K.), le Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (à R.K.), le Harvard Stem Cell Institute (à R.K.) et par Steve Willis et Elissa Freud (à R.K.). Nous remercions la Dre Annie Kathuria pour sa lecture critique et ses commentaires sur le manuscrit.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetateSigma AldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgGLife TechnologiesA-31572
B27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAbCell Signaling3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Collagen IV from human placentaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)Corning353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)Corning353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)Corning3460
Countess slidesThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (without phenol red)Thermo Fisher Scientific A1413202
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
Donkey serumSigma AldrichD9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Fisher Scientific14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)Thermo Fisher ScientificA1516401
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronectinSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium Thermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Human endothelial serum-free mediumThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificN/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Services15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate ReaderPerkin ElmerN/A
Recombinant Human VEGF 165Peprotech100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)Peprotech100-18B
Retinoic acidSigma AldrichR2625-100MG
Rhodamine 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Cell Signaling81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Versene solutionThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris/Thermo Fisher Scientific1254

Références

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